Segmentación génica retroviral mediada por CRISPR/Cas9 para el estudio de la diferenciación de Th17 in vitro

Resumen

Presentamos un protocolo para la transducción retroviral de ARN guía en células T primarias de ratones transgénicos Cas9, proporcionando una alternativa eficiente para la edición de genes en el estudio de la diferenciación Th17.

Resumen

Las células T auxiliares que producen IL-17A, conocidas como células Th17, desempeñan un papel fundamental en la defensa inmunitaria y están implicadas en los trastornos autoinmunes. Las células T CD4 pueden estimularse con antígenos y cócteles de citocinas bien definidos in vitro para imitar la diferenciación de las células Th17 in vivo. Se han llevado a cabo numerosas investigaciones sobre los mecanismos de regulación de la diferenciación Th17 utilizando el ensayo de polarización Th17 in vitro .

Los métodos convencionales de polarización Th17 suelen implicar la obtención de linfocitos T CD4 vírgenes de ratones modificados genéticamente para estudiar los efectos de genes específicos en la diferenciación y función de Th17. Estos métodos pueden llevar mucho tiempo y ser costosos, y pueden estar influenciados por factores extrínsecos de las células de los animales knockout. Por lo tanto, un protocolo que utiliza la transducción retroviral de ARN guía para introducir la eliminación de genes en las células T primarias de ratón knockin de CRISPR/Cas9 sirve como un enfoque alternativo muy útil. En este artículo se presenta un protocolo para diferenciar linfocitos T primarios naïve en linfocitos Th17 siguiendo la focalización génica mediada por retrovirales, así como los métodos de análisis de citometría de flujo posteriores para analizar la infección y la eficiencia de la diferenciación.

Introducción

Las células Th17, un subconjunto único de células T auxiliares CD4⁺, son vitales para erradicar bacterias y hongos extracelulares y desempeñan un papel importante en diversas enfermedades autoinmunes ^1,2,3. La evidencia emergente sugiere que las células Th17 exhiben heterogeneidad, funcionando tanto en condiciones patógenas como no patógenas, influenciadas por factores ambientales y genéticos. Dilucidar los procesos reguladores que controlan la diferenciación de las células Th17, la plasticidad y la heterogeneidad es crucial para e....

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética de Bienestar de Animales Experimentales del Hospital Renji de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái y cumplen con las directrices institucionales.

1. Producción de retrovirales

1. Preparación de la construcción retroviral
   1. Utilice la herramienta CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public) para diseñar el sgRNA para el knockout⁸ de RORγt. Especifique el genoma de referencia como Mouse GRCm38 y elija la

Resultados

En el estudio, clonamos el objetivo de sgRNA a Rorc y secuencias codificantes no dirigidas a sgRNA en el vector pMX-U6-MCS con proteína fluorescente mCherry (Figura 1A,B). La producción de retrovirus se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo descrito en la Figura 2. La transfección se inició el día 0 y la recolección retroviral se produjo el día 2. La eficienci.......

Discusión

La edición del genoma CRISPR/Cas9 a través de la administración retroviral es un método sólido para explorar las funciones de las células T auxiliares. Este protocolo ofrece un enfoque rápido y eficaz para examinar genes específicos implicados en la diferenciación y función de Th17. Se deben seguir cuidadosamente varios pasos críticos para lograr resultados óptimos. En primer lugar, para mejorar la eficiencia de la eliminación de genes, los ARNg deben seleccionarse cuidadosa.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Solarbio	E1170
100 mm cell and tissue Culture Dish	BIOFIL	TCD010100
1 M Hepes (Free Acid, sterile)	Solarbio	H1090
24-well cell and tissue culture plate	NEST	702002
48-well cell and tissue culture plate	NEST	748002
Brefeldin A Solution (1,000x)	BioLegend	420601
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD4 Antibody (RM4-5)	BioLegend	100546
CD3e Monoclonal Antibody (145-2C11), Functional Grade, eBioscience	Invitrogen	16-0031-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7), PE, eBioscience	Invitrogen	12-0441-83
CD62L (L-Selectin) Monoclonal Antibody (MEL-14), APC, eBioscience	Invitrogen	17-0621-82
Cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto 2000
Cell Strainer (40 μm)	biosharp	BS-40-CS
Cell Strainer (70 μm)	biosharp	BS-70-CS
Centrifuge	eppendorf	5425 R
Centrifuge	eppendorf	5810 R
ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix	Vazyme	Q411-02
ClonExpress II One Step Cloning Kit	Vazyme	C112
DH5α Competent Cells	Sangon Biotech	B528413
Direct-zol RNA Miniprep	ZYMO RESEARCH	R2050
DMEM Medium	BasalMedia	L110KJ
EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit	STEMCELL	19852
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 660	Invitrogen	65-0864-18
EndoFree Mini Plasmid Kit II	TIANGEN	DP118-02
ExFect Transfection Reagent	Vazyme	T101-01
Fetal Bovine Serum, Premium Plus	Gibco	A5669701
FITC anti-mouse IL-17A Antibody (TC11-18H10.1)	BioLegend	506907
Formaldehyde solution	Macklin	F864792
HiScript IV RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）	Vazyme	R423-01
Ionomycin	Beyotime	S1672
Mitomycin C	Maokang Biotechnology	7/7/1950
Mouse GRCm38	NCBI	RefSeq v.108.20200622
OPTI-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985070	reduced serum medium
Pacific Blue anti-mouse CD4 Antibody (RM4-5)	BioLegend	100531
PE/Cyanine7 anti-mouse CD25 Antibody (PC61)	BioLegend	102015
PE/Cyanine7 anti-mouse CD4 Antibody (GK1.5)	BioLegend	100422
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
PMA/TPA	Beyotime	S1819
R26-CAG-Cas9 mice	Shanghai Model Organisms Center	Cat. NO. NM-KI-00120
Recombinant Human TGF-beta 1 (CHO-Expressed) Protein, CF	R&D Systems	11409-BH
Recombinant Murine IL-6	PeproTech	216-16
Research Cell Analyzer	BD Biosciences	BD LSRFortessa
Research Cell Sorter	SONY	MA900
RPMI 1640 Medium	BasalMedia	L210KJ
SimpliAmp Thermal Cycler PCR System	Applied Biosystems	A24811
Sodium pyruvate solution (100 mM)	Sigma-Aldrich	S8636
Ultra-LEAF Purified anti-mouse CD28 Antibody (37.51)	BioLegend	102121
Ultra-LEAF Purified anti-mouse IFN-γ Antibody (XMG1.2)	BioLegend	505847
Ultra-LEAF Purified anti-mouse IL-4 Antibody (11B11)	BioLegend	504135
Ultra-LEAF Purified anti-mouse IL-12/IL-23 p40 Antibody (C17.8)	BioLegend	505309
β-Mercaptoethanol (50 mM)	Solarbio	M8211