Segmentación génica retroviral mediada por CRISPR/Cas9 para el estudio de la diferenciación de Th17 in vitro

Resumen

Presentamos un protocolo para la transducción retroviral de ARN guía en células T primarias de ratones transgénicos Cas9, proporcionando una alternativa eficiente para la edición de genes en el estudio de la diferenciación Th17.

Resumen

Las células T auxiliares que producen IL-17A, conocidas como células Th17, desempeñan un papel fundamental en la defensa inmunitaria y están implicadas en los trastornos autoinmunes. Las células T CD4 pueden estimularse con antígenos y cócteles de citocinas bien definidos in vitro para imitar la diferenciación de las células Th17 in vivo. Se han llevado a cabo numerosas investigaciones sobre los mecanismos de regulación de la diferenciación Th17 utilizando el ensayo de polarización Th17 in vitro .

Los métodos convencionales de polarización Th17 suelen implicar la obtención de linfocitos T CD4 vírgenes de ratones modificados genéticamente para estudiar los efectos de genes específicos en la diferenciación y función de Th17. Estos métodos pueden llevar mucho tiempo y ser costosos, y pueden estar influenciados por factores extrínsecos de las células de los animales knockout. Por lo tanto, un protocolo que utiliza la transducción retroviral de ARN guía para introducir la eliminación de genes en las células T primarias de ratón knockin de CRISPR/Cas9 sirve como un enfoque alternativo muy útil. En este artículo se presenta un protocolo para diferenciar linfocitos T primarios naïve en linfocitos Th17 siguiendo la focalización génica mediada por retrovirales, así como los métodos de análisis de citometría de flujo posteriores para analizar la infección y la eficiencia de la diferenciación.

Introducción

Las células Th17, un subconjunto único de células T auxiliares CD4⁺, son vitales para erradicar bacterias y hongos extracelulares y desempeñan un papel importante en diversas enfermedades autoinmunes ^1,2,3. La evidencia emergente sugiere que las células Th17 exhiben heterogeneidad, funcionando tanto en condiciones patógenas como no patógenas, influenciadas por factores ambientales y genéticos. Dilucidar los procesos reguladores que controlan la diferenciación de las células Th17, la plasticidad y la heterogeneidad es crucial para el avance de estrategias inmunoterapéuticas más efectivas.

Los animales modificados genéticamente se han utilizado ampliamente para revelar los reguladores clave de la diferenciación y las funciones de las células Th17. El uso de animales modificados genéticamente implica una manipulación completa in vivo, proporcionando autenticidad y un estudio sistemático de su papel en condiciones fisiológicas o modelos de enfermedades. Sin embargo, el cribado de alto rendimiento con este enfoque es en gran medida poco práctico. Los ensayos de polarización in vitro proporcionan una alternativa para estudiar la diferenciación de las células Th17. Se ha demostrado que la interleucina 6 (IL-6) en combinación con el factor de crecimiento transformante β1 (TGFβ1) promueve el desarrollo de células Th17 no patógenas, mientras que la IL-6, la IL-1β y la IL-23 están implicadas en la diferenciación de las células Th17 patógenas (pTh17)^4,5.

La aparición de la tecnología CRISPR/Cas9 ha facilitado la edición precisa del genoma en bases específicas. Cuando se combina con la transducción retroviral, este enfoque proporciona un método genético potente, eficiente y económico para el cribado y el estudio funcional de posibles reguladores en las células Th17 ^6,7. En este estudio, mejoramos el procedimiento para la transducción retroviral dentro del sistema de polarización Th17. Usando un sistema retroviral, infectamos células T vírgenes activadas preestablecidas que expresan Cas9 de ratones. Las células se transducieron con construcciones de ARN guía (ARNg) impulsadas por el promotor U6, junto con genes que codifican proteínas reporteras fluorescentes bajo el control del promotor EF1a para facilitar la eliminación del gen diana. Luego, las células T transducidas se cultivaron en condiciones específicas de citocinas para inducir la diferenciación en células Th17. En particular, la eliminación de RoRγt redujo significativamente la producción de IL-17A en comparación con el grupo de control. La eficacia de este sistema depende de la optimización de la producción de retrovirus y de las condiciones de transducción de las células T primarias activadas, lo que proporciona un enfoque rápido y práctico para estudiar genes específicos en la diferenciación y función de Th17.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética de Bienestar de Animales Experimentales del Hospital Renji de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái y cumplen con las directrices institucionales.

1. Producción de retrovirales

1. Preparación de la construcción retroviral
   1. Utilice la herramienta CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public) para diseñar el sgRNA para el knockout⁸ de RORγt. Especifique el genoma de referencia como Mouse GRCm38 y elija la secuencia PAM como NGG (para SpyoCas9, Hsu (2013) tracrRNA) basado en el sistema de guía CRISPRko. Valide el nombre del gen objetivo u otros formatos de genes objetivo y envíe la entrada válida para obtener candidatos a sgRNA. Estableciendo otros parámetros en valores predeterminados, establezca el objetivo de sgRNA en RORγt (Rorc, Gene ID: 19885) para perturbar la diferenciación de Th17 y seleccione sgRNA no objetivo (abreviado sgNT, secuencia: GCGAGGTATTCGGCTCCGCGG) de las bibliotecas GeCKO v2 del ratón.
      NOTA: Esta herramienta ofrece una gama de opciones en las que se puede hacer clic para diseñar ARN guía, lo que permite una personalización conveniente para cumplir con requisitos específicos.
      1. Introduzca el nombre del gen objetivo en el cuadro de búsqueda de la columna Búsqueda rápida de genes. El sistema mostrará la identificación del gen y el nombre completo del gen objetivo para garantizar una selección precisa.
         NOTA: Hay opciones adicionales disponibles para validar diferentes formatos de genes diana.
   2. Elija un sgRNA dirigido a la secuencia Rorc (abreviado sgRorc) de acuerdo con el rango combinado alto y el orden de selección para evitar coincidencias fuera del objetivo y aumentar la eficacia en el objetivo (secuencia sgRorc: GTCATCTGGGATCCACTACG). Sintetice dos oligonucleótidos para sgRorc y sgNT: para el oligonucleótido directo, agregue la secuencia "gttttagagctagaaatagcaagttaaaat" al extremo 5' de cada secuencia guía; Para el oligo inverso, agregue la secuencia "tttcgtcctttccacaagatatataaagc" al extremo 3' de cada secuencia guía.
      NOTA: Por lo general, existen múltiples opciones para las secuencias de sgRNA. Es esencial seleccionar 2 o 3 secuencias de sgRNA dirigidas al mismo genotipo para evaluar su eficiencia de knockout. En nuestros experimentos preliminares, se seleccionaron dos ARNg diana de Rorc para la comparación (secuencia de sgRNA1: GTCATCTGGGATCCACTACG; secuencia de sgRNA2: CTTGAGTATAGTCCAGAACG). Los resultados experimentales indicaron que el ARNg presentado en el método actual (secuencia de ARNsg1) exhibe una mayor eficiencia de knockout entre los dos.
   3. Amplifique las secuencias codificantes de sgRorc y sgNT utilizando ADN polimerasa en PCR con los cebadores anteriores y clónelos en el vector pMX-U6-MCS (entre las regiones del promotor U6 y el andamio de ARNg) en el marco con la proteína fluorescente mCherry, respectivamente⁹. Configure el sistema de reacción (50 μL) como Tabla 1. Esos cebadores consisten en una secuencia de sgRNA (3'), que puede insertar el sgRNA en el vector, y un segmento de secuencia vectorial (5'), que puede amplificar el fragmento vectorial de longitud completa. Además, diseñe los cebadores directos e inversos con un solapamiento de aproximadamente 18 pb dentro de la región de sgRNA (pero no totalmente superpuestos), lo que facilita el ensamblaje del vector de clonación linealizado durante el proceso de ligadura.
      NOTA: Se debe obtener un fragmento vectorial linealizado en el sitio de la secuencia de sgRNA con cebadores por PCR de aproximadamente 5.551 kd.
   4. Purifica el constructo con un kit de extracción en gel y circularlo con un kit de clonación. Utilice los productos de recombinación para ensayos de transformación.
   5. Elija los clones individuales de las placas y verifique las secuencias codificantes de sgRorc o sgNT mediante secuenciación de primera generación, utilizando el cebador promotor U6 (secuencia: ATGGACTATCATATGCTTACCGTA).
   6. Seleccione el clon único deseado para la amplificación en el caldo LB. Extraiga ADN plasmídico de alta calidad de células bacterianas mediante el uso de un kit de plásmidos libre de endotoxinas.
      NOTA: Asegúrese de que la solución de plásmido tenga una alta calidad. Recomendamos que la concentración de la solución de plásmido sea de al menos 1 μg/μL.
2. Preparación de células de envasado
   1. Prepare las células Platinum-E (Plat-E) utilizando el siguiente procedimiento: cultivo de células Plat-E con medio de águila modificado de Dulbecco (medio DMEM) que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS), 100 unidades/mL de penicilina y 0,1 mg/mL de estreptomicina en una placa de cultivo de 10 cm. A continuación, se hará referencia a él como medio de cultivo celular .
      NOTA: Para obtener la eficiencia de transfección adecuada, recomendamos utilizar celdas en la fase de crecimiento logarítmico con menos de 15 números de paso.
   2. Divida una placa completa de células Plat-E de 10 cm (~2,6 × 10⁷ células) en una proporción adecuada en una nueva placa de 10 cm 1 día antes de la transfección para lograr una confluencia celular de aproximadamente el 80% al día siguiente, que es la condición óptima para la transfección. Realice el paso de células para una nueva placa de 10 cm en una proporción de 1:3 (semilla ~ 8 × 10⁶ células en una nueva placa de 10 cm el día antes de la transfección).
      NOTA: La relación de división depende de la condición de crecimiento de las células, y se puede lograr una mayor eficiencia de transfección en las células que exhiben un crecimiento robusto. Realizamos el paso de celdas para una placa de 10 cm en una proporción de 1:3. Para diferentes placas de cultivo celular, como una placa de 6 cm, recomendamos que se siembren 1,5 × 10⁶ células Plat-E el día antes de la transfección.
3. Transfección
   1. Una hora antes de la transfección, sustituir el medio de cultivo celular por 8 mL de medio sérico reducido sin rojo de fenol con FBS al 5%, pero sin penicilina-estreptomicina, ya que puede interferir con el reactivo de transfección. Calentar el medio sérico reducido a 37 °C antes de usar.
   2. Prepare la mezcla de transfección que contiene la mezcla 1 y la mezcla 2: la mezcla 1 incluye 18 μg de ADN plasmídico (pMXs-U6-MCS-sgNT-mCherry/pMXs-U6-MCS-sgRorc-mCherry) y 6 μg de pCL-Ecotropic Retroviral Vector (pCL-Eco) en 1.000 μL de medio sérico reducido. La mezcla 2 contiene 48 μL de reactivo de transfección en 1.000 μL de medio sérico reducido. Agregue la mezcla 2 gota a gota en la mezcla 1 y mezcle suave y completamente. Incubar el complejo durante 15-20 min a 20-25 °C.
   3. Gotee con cuidado la mezcla en las celdas Plat-E, girando la placa suavemente para asegurar una distribución uniforme. Incubar las células a 37 °C bajo 5% de CO₂ durante 6-12 h.
   4. Sustituya el medio por 10 mL de medio de cultivo celular fresco y continúe incubando las células a 37 °C, 5% de CO₂ durante 48 h.
   5. Evalúe la eficiencia de la transfección en células Plat-E mediante la detección de la etiqueta vectorial retroviral, que actúa como proxy, mediante microscopía de fluorescencia o citometría de flujo.
      NOTA: Se detectó una fuerte señal de fluorescencia mCherry (la fluorescencia positiva supera el 80%) en una proporción considerable de células Plat-E transfectadas con el vector pMX-U6-MCS, lo que indica una transfección exitosa.
   6. Recolectar el sobrenadante de cultivo que contiene virus y centrifugar a 1.500 × g durante 10 minutos para eliminar los fragmentos celulares. Aliquotar el sobrenadante del virus 1 mL por vial y almacenar a -80 °C.
      NOTA: La filtración es un método alternativo para eliminar los residuos celulares. Recomendamos utilizar un filtro de jeringa con un tamaño de poro de 0,45 μm y una membrana de polietersulfona (PES) para minimizar la retención de partículas virales en la membrana del filtro.

2. Infección retroviral de linfocitos T CD4 ⁺ activados y diferenciación Th17

1. Preparar y activar los linfocitos T CD4⁺ vírgenes primarios
   1. Cubra cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos con 2 μg/mL de anti-CD3e y 4 μg/mL de anti-CD28 en PBS estéril de 500 μL, envuelva la placa en parafilm para evitar la evaporación y la contaminación, y luego incube la placa a 4 °C durante la noche (o 37 °C durante 1-2 horas antes de colocar las células T CD4⁺ ) el día antes de aislar las células T CD4⁺ vírgenes.
      NOTA: Este paso es necesario para realizar la estimulación unida a placa para las células T de ratón antes de realizar la transducción viral.
   2. Al día siguiente, eutanasiar a los ratones que expresan Cas9 de 6 a 8 semanas de edad (ratones R26-CAG-Cas9) mediante asfixia con CO₂ y esterilizarlos con etanol al 70%.
   3. Extraiga el bazo de ratón y colóquelo en PBS con 2% de FBS y 100 μM de EDTA (tampón FACS).
   4. Muele el bazo con vidrio esmerilado esterilizado (lado mate) en el tampón FACS, homogeneiza el tejido en una suspensión unicelular y filtra la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 μm en un tubo de 50 mL.
      NOTA: Asegúrese de moler el pañuelo de forma suave y consistente para mantenerlo húmedo. La molienda violenta del tejido puede afectar drásticamente a la supervivencia de las células.
   5. Girar la suspensión de células esplénicas a 800 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 2 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos. Déjelo reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego agregue el tampón FACS para alcanzar un volumen total de 15 mL. Centrifugar los esplenocitos a 800 × g durante 5 min.
   6. Vuelva a suspender los esplenocitos y fíltrelos a través de un filtro de células de 40 μm. Ajuste el volumen final a 1 mL para el aislamiento de células T CD4⁺ .
   7. Aísle las células T CD4⁺ con kits de reactivos comerciales siguiendo las instrucciones del manual.
   8. Etiquete las células T CD4⁺ con una mezcla de anticuerpos fluorescentes (CD4, CD25, CD44 y CD62L) a 4 °C durante 30 min, lave las células con tampón FACS y aísle las células T CD4⁺ vírgenes con un clasificador de células de flujo. Esto dará como resultado la obtención de linfocitos T CD4⁺CD25-CD62L^{de alto}CD44^{y bajos} ingenuos.
   9. Retire el sobrenadante de estimulación unido a la placa de cultivo celular de 24 pocillos (preparada en el paso 2.1.1) y enjuague cada pocillo dos veces con 500 μL de PBS. Placa 1 x 10⁶ linfocitos T CD4⁺ vírgenes en 1 mL de medio de cultivo de linfocitos en un pocillo de la placa de cultivo celular de 24 pocillos. Incubar las células en la incubadora de células.
      NOTA: El medio de cultivo de linfocitos contiene 10% de FBS, 100 unidades/mL de penicilina y 0,1 mg/mL de estreptomicina, 1 mM de piruvato de sodio, 10 mM de HEPES y 50 μM de β-ME en el medio RPMI 1640.
2. Infección retroviral
   1. Después de 18-24 h, recoja cada pocillo de células activadas en el tubo de 1,5 mL. Centrifugar a 800 × g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
   2. Vuelva a suspender el pellet celular en 1 mL de mezcla de infección (10 μg/mL de bromuro de hexadimetrina, 10 mM de HEPES en el sobrenadante del virus) y agregue 1 mL de la mezcla a un nuevo pocillo de una placa de cultivo celular de 48 pocillos. Mientras tanto, guarde suficientes celdas como control negativo (no transducido).
      NOTA: Es factible tener menos de 1 x 10⁶ linfocitos T CD4⁺ naïve activados por pocillo, pero no se recomienda usar menos de 0,5 x 10⁶ linfocitos por pocillo. Además, no se deben sembrar células en los pocillos periféricos de la placa de cultivo de 48 pocillos.
   3. Envuelva la placa con parafilm y centrifuga a 800 x g durante 90 min a 32 °C. Establezca acelerar y desacelerar en 3. Después de la centrifugación, retire el parafilm, incube las células en la incubadora durante 4 h y continúe con los pasos de diferenciación.
3. Diferenciación de células infectadas en células Th17
   1. Preparar las células presentadoras de antígeno (APC) durante la infección retroviral. En primer lugar, obtenga esplenocitos de ratones de tipo salvaje siguiendo las instrucciones de los pasos 2.1.2 a 2.1.4. Resuspender los esplenocitos con 1 mL de medio de cultivo de linfocitos con 50 μg/mL de mitomicina en un tubo de 15 mL. Incubar los esplenocitos a 37 °C bajo 5% de CO₂ durante 1 h.
   2. Una hora más tarde, agregue PBS hasta la marca de 15 mL para lavar los esplenocitos, centrifugar a 800 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante, resuspender los esplenocitos con 1 mL de medio de cultivo de linfocitos y contar el número de células. Las células APC se han preparado con éxito.
   3. Después de las 4 h de incubación de las células (como en el paso 2.2.3), recoja las células T CD4⁺ transducidas en tubos de 1,5 ml y centrifugue a 800 x g durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células infectadas en 600 μL de PBS para lavar. Centrifugar a 800 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
   4. Coloque 0,5 × 10⁶ linfocitos T CD4⁺ transducidos en 1 mL de medio de cultivo de linfocitos con 1,5 x 10⁶ linfocitos APC en un pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Suplementar con 2 μg/mL de anti-CD3e, 2 μg/mL de anti-CD28 y cóctel de diferenciación celular Th17, que contiene 10 μg/mL de anti-IFNγ, 10 μg/mL de anti-IL-12/IL23 p40, 10 μg/mL de anti-IL4, 2,5-3 ng/mL de hTGF-β y 20-30 ng/mL de IL-6. Cultivo de células durante 2 días.
   5. Recoja cada pocillo de células en los tubos de 1,5 ml, centrifugue a 800 x g durante 5 minutos y deseche el sobrenadante. Refresque 1 mL nuevo del medio de cultivo de linfocitos solo con 3 ng/mL de TGF-β y 30 ng/mL de IL-6. Coloque las células en un nuevo pocillo de placa de cultivo celular de 24 pocillos durante un período de cultivo prolongado. Analice las celdas 2 días después del cambio de medio.

3. Evaluación de la eficiencia de la transducción y los resultados de diferenciación

1. Después de dos días de cambio de medio, recoja las células y centrifugue a 800 × g durante 5 min y deseche el sobrenadante. Tratar las células diferenciadas con 50 ng/mL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), 500 ng/mL de ionomicina y 5 μg/mL de brefeldina A en 500 μL de medio de cultivo de linfocitos en un nuevo pocillo de placa de cultivo celular de 24 pocillos a 37 °C en incubadora durante 4 h. Extraiga la mitad de las células para el análisis de citometría de flujo y lise la otra mitad de las células con tampón de extracción de ARN para el análisis de qPCR.
2. Para el análisis de citometría de flujo
   1. Recoja las células en tubos de 1,5 ml. Añadir 1 mL de tampón FACS en los tubos y centrifugar a 800 × g durante 5 min para lavar las células.
   2. Vuelva a suspender el pellet celular con la mezcla de anticuerpos fluorescentes (CD4 y colorante de viabilidad fijable en 100 μL de PBS) y tiña las células a 4 °C durante 30 min.
   3. Lave las células con 300 μL de PBS y fíjelas con 300 μL de formaldehído (FA) tamponado con fosfato al 2% a 4 °C durante al menos 60 min.
   4. Una hora más tarde, lavar las células con PBS, volver a suspenderlas con 600 μL de tampón de permeabilización 1x y centrifugar a 800 × g durante 5 min.
   5. Deseche el sobrenadante y la tinción con anti-IL-17A en 100 μL de tampón de permeabilización 1x durante 60 min a temperatura ambiente o 4 °C durante la noche.
   6. Al día siguiente, lavar las células con tampón de permeabilización 1x y volver a suspenderlas en 200 μL de PBS. Análisis de las células por citometría de flujo¹⁰. Consulte la sección Resultados representativos.
3. Para el análisis de qPCR, extraiga el ARN siguiendo las instrucciones del kit de extracción de ARN. Transcriba inversamente el ARN en ADNc para su almacenamiento o posterior análisis de qPCR. El diseño de estos cebadores debe adherirse a los principios generales de diseño de cebadores de qPCR y, al mismo tiempo, dirigirse específicamente a la región que abarca el sitio indel esperado, donde se ha producido la escisión mediada por ARNg. Cualquier reducción en la eficiencia de amplificación o pérdida de señal en este sitio puede servir como un indicador de knockout exitoso. Los cebadores de qPCR son los siguientes:
   Rorc F: TCCACTACGGGGTTATCACCT; R: AGTAGGCCACATTACACTGCT.
   IL17a F: TCAGCGTGTCCAAACACTGAG; R: CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT.

Resultados

En el estudio, clonamos el objetivo de sgRNA a Rorc y secuencias codificantes no dirigidas a sgRNA en el vector pMX-U6-MCS con proteína fluorescente mCherry (Figura 1A,B). La producción de retrovirus se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo descrito en la Figura 2. La transfección se inició el día 0 y la recolección retroviral se produjo el día 2. La eficienci...

Discusión

La edición del genoma CRISPR/Cas9 a través de la administración retroviral es un método sólido para explorar las funciones de las células T auxiliares. Este protocolo ofrece un enfoque rápido y eficaz para examinar genes específicos implicados en la diferenciación y función de Th17. Se deben seguir cuidadosamente varios pasos críticos para lograr resultados óptimos. En primer lugar, para mejorar la eficiencia de la eliminación de genes, los ARNg deben seleccionarse cuidadosa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Solarbio	E1170
100 mm cell and tissue Culture Dish	BIOFIL	TCD010100
1 M Hepes (Free Acid, sterile)	Solarbio	H1090
24-well cell and tissue culture plate	NEST	702002
48-well cell and tissue culture plate	NEST	748002
Brefeldin A Solution (1,000x)	BioLegend	420601
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD4 Antibody (RM4-5)	BioLegend	100546
CD3e Monoclonal Antibody (145-2C11), Functional Grade, eBioscience	Invitrogen	16-0031-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7), PE, eBioscience	Invitrogen	12-0441-83
CD62L (L-Selectin) Monoclonal Antibody (MEL-14), APC, eBioscience	Invitrogen	17-0621-82
Cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto 2000
Cell Strainer (40 μm)	biosharp	BS-40-CS
Cell Strainer (70 μm)	biosharp	BS-70-CS
Centrifuge	eppendorf	5425 R
Centrifuge	eppendorf	5810 R
ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix	Vazyme	Q411-02
ClonExpress II One Step Cloning Kit	Vazyme	C112
DH5α Competent Cells	Sangon Biotech	B528413
Direct-zol RNA Miniprep	ZYMO RESEARCH	R2050
DMEM Medium	BasalMedia	L110KJ
EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit	STEMCELL	19852
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 660	Invitrogen	65-0864-18
EndoFree Mini Plasmid Kit II	TIANGEN	DP118-02
ExFect Transfection Reagent	Vazyme	T101-01
Fetal Bovine Serum, Premium Plus	Gibco	A5669701
FITC anti-mouse IL-17A Antibody (TC11-18H10.1)	BioLegend	506907
Formaldehyde solution	Macklin	F864792
HiScript IV RT SuperMix for qPCR?+gDNA wiper?	Vazyme	R423-01
Ionomycin	Beyotime	S1672
Mitomycin C	Maokang Biotechnology	7/7/1950
Mouse GRCm38	NCBI	RefSeq v.108.20200622
OPTI-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985070	reduced serum medium
Pacific Blue anti-mouse CD4 Antibody (RM4-5)	BioLegend	100531
PE/Cyanine7 anti-mouse CD25 Antibody (PC61)	BioLegend	102015
PE/Cyanine7 anti-mouse CD4 Antibody (GK1.5)	BioLegend	100422
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
PMA/TPA	Beyotime	S1819
R26-CAG-Cas9 mice	Shanghai Model Organisms Center	Cat. NO. NM-KI-00120
Recombinant Human TGF-beta 1 (CHO-Expressed) Protein, CF	R&D Systems	11409-BH
Recombinant Murine IL-6	PeproTech	216-16
Research Cell Analyzer	BD Biosciences	BD LSRFortessa
Research Cell Sorter	SONY	MA900
RPMI 1640 Medium	BasalMedia	L210KJ
SimpliAmp Thermal Cycler PCR System	Applied Biosystems	A24811
Sodium pyruvate solution (100 mM)	Sigma-Aldrich	S8636
Ultra-LEAF Purified anti-mouse CD28 Antibody (37.51)	BioLegend	102121
Ultra-LEAF Purified anti-mouse IFN-γ Antibody (XMG1.2)	BioLegend	505847
Ultra-LEAF Purified anti-mouse IL-4 Antibody (11B11)	BioLegend	504135
Ultra-LEAF Purified anti-mouse IL-12/IL-23 p40 Antibody (C17.8)	BioLegend	505309
β-Mercaptoethanol (50 mM)	Solarbio	M8211