Direcionamento de genes mediados por CRISPR/Cas9 retroviral para o estudo da diferenciação Th17 in vitro

Resumo

Apresentamos um protocolo para transdução retroviral de RNA guia em células T primárias de camundongos transgênicos Cas9, fornecendo uma alternativa eficiente para edição gênica no estudo da diferenciação Th17.

Resumo

As células T auxiliares que produzem IL-17A, conhecidas como células Th17, desempenham um papel crítico na defesa imunológica e estão implicadas em doenças autoimunes. As células T CD4 podem ser estimuladas com antígenos e coquetéis de citocinas bem definidos in vitro para mimetizar a diferenciação de células Th17 in vivo. A pesquisa foi conduzida extensivamente sobre os mecanismos de regulação da diferenciação Th17 usando o ensaio de polarização Th17 in vitro .

Os métodos convencionais de polarização Th17 normalmente envolvem a obtenção de células T CD4 virgens de camundongos geneticamente modificados para estudar os efeitos de genes específicos na diferenciação e função Th17. Esses métodos podem ser demorados e caros e podem ser influenciados por fatores extrínsecos celulares dos animais nocautes. Assim, um protocolo usando transdução retroviral de RNA guia para introduzir nocaute genético em células T primárias de camundongo knockin CRISPR/Cas9 serve como uma abordagem alternativa muito útil. Este artigo apresenta um protocolo para diferenciar células T primárias virgens em células Th17 após o direcionamento de genes mediado por retrovírus, bem como os métodos subsequentes de análise de citometria de fluxo para testar a infecção e a eficiência de diferenciação.

Introdução

As células Th17, um subconjunto único de células T auxiliares CD4⁺, são vitais para a erradicação de bactérias e fungos extracelulares e desempenham um papel significativo em várias doenças autoimunes ^1,2,3. Evidências emergentes sugerem que as células Th17 exibem heterogeneidade, funcionando em condições patogênicas e não patogênicas, influenciadas por fatores ambientais e genéticos. Elucidar os processos regulatórios que controlam a diferenciação das células Th17, plasticidade e heterogeneidade é crucial para o avanço de estratégias imunoterapêuticas mais eficazes.

Animais geneticamente modificados têm sido amplamente utilizados para desvendar os principais reguladores da diferenciação e funções das células Th17. O uso de animais geneticamente modificados envolve manipulação completa in vivo, proporcionando autenticidade e estudo sistemático de seu papel em condições fisiológicas ou modelos de doenças. No entanto, a triagem de alto rendimento com essa abordagem é amplamente impraticável. Os ensaios de polarização in vitro fornecem uma alternativa para estudar a diferenciação de células Th17. A interleucina 6 (IL-6) em combinação com o fator de crescimento transformador β1 (TGFβ1) demonstrou promover o desenvolvimento de células Th17 não patogênicas, enquanto IL-6, IL-1β e IL-23 estão implicadas na condução da diferenciação de células Th17 patogênicas (pTh17)^4,5.

O surgimento da tecnologia CRISPR/Cas9 facilitou a edição precisa do genoma em bases específicas. Quando combinada com a transdução retroviral, essa abordagem fornece um método genético potente, eficiente e econômico para triagem e estudo funcional de potenciais reguladores em células Th17 ^6,7. Neste estudo, aprimoramos o procedimento de transdução retroviral dentro do sistema de polarização Th17. Usando um sistema retroviral, infectamos células T virgens ativadas pré-estabelecidas que expressam Cas9 de camundongos. As células foram transduzidas com construções de RNA guia (gRNA) conduzidas pelo promotor U6, juntamente com genes que codificam proteínas repórter fluorescentes sob o controle do promotor EF1a para facilitar o nocaute do gene alvo. Em seguida, as células T transduzidas foram cultivadas sob condições específicas de citocinas para induzir a diferenciação em células Th17. Notavelmente, o nocaute do RoRγt reduziu significativamente a produção de IL-17A em comparação com o grupo controle. A eficácia deste sistema depende da produção otimizada de retrovírus e condições de transdução para células T primárias ativadas, fornecendo uma abordagem rápida e prática para o estudo de genes específicos na diferenciação e função Th17.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Bem-Estar Animal Experimental, Hospital Renji, Escola de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai e estão em conformidade com as diretrizes institucionais.

1. Produção retroviral

1. Preparação do construto retroviral
   1. Use a ferramenta CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public) para projetar o sgRNA para nocaute RORγt⁸. Especifique o genoma de referência como Mouse GRCm38 e escolha a sequência PAM como NGG (para SpyoCas9, Hsu (2013) tracrRNA) com base no sistema guia CRISPRko. Valide o nome do gene alvo ou outros formatos de gene alvo e envie a entrada válida para obter candidatos a sgRNA. Definindo outros parâmetros para valores padrão, defina o alvo de sgRNA para RORγt (Rorc, Gene ID: 19885) para perturbar a diferenciação de Th17 e selecione sgRNA não direcionado (abreviação sgNT, sequência: GCGAGGTATTCGGCTCCGCGGGG) das bibliotecas GeCKO v2 do mouse.
      NOTA: Esta ferramenta oferece uma variedade de opções clicáveis para projetar RNAs guia, permitindo uma personalização conveniente para atender a requisitos específicos.
      1. Digite o nome do gene alvo na caixa de pesquisa na coluna Pesquisa rápida de genes. O sistema exibirá o ID do gene e o nome completo do gene alvo para garantir uma seleção precisa.
         NOTA: Opções adicionais estão disponíveis para validar diferentes formatos de genes-alvo.
   2. Escolha um sgRNA direcionado à sequência Rorc (abreviação sgRorc) de acordo com a alta classificação combinada e ordem de escolha para evitar correspondências fora do alvo e aumentar a eficácia no alvo (sequência sgRorc: GTCATCTGGGATCCACTACG). Sintetize dois oligonucleotídeos para sgRorc e sgNT: para o oligo direto, anexe a sequência "gttttagagctagaaaatagcaagttaaaat" ao final 5' de cada sequência guia; Para o oligo reverso, anexar a sequência "tttcgtcctttccaaagatatataaagc" à extremidade 3' de cada sequência guia.
      NOTA: Normalmente, existem várias opções para sequências de sgRNA. É essencial selecionar 2 ou 3 sequências de sgRNA direcionadas ao mesmo genótipo para avaliar sua eficiência de nocaute. Em nossos experimentos preliminares, dois gRNAs direcionados ao Rorc foram selecionados para comparação (sequência de sgRNA1: GTCATCTGGGATCCACTACG; sequência de sgRNA2: CTTGAGTATAGTCCAGAACG). Os resultados experimentais indicaram que o gRNA apresentado no método atual (sequência de sgRNA1) apresenta maior eficiência de nocaute entre os dois.
   3. Amplifique as sequências codificadoras sgRorc e sgNT usando DNA polimerase em PCR com os primers acima e clone-as no vetor pMX-U6-MCS (entre as regiões do promotor U6 e o andaime gRNA) no quadro com a proteína fluorescente mCherry, respectivamente⁹. Configure o sistema de reação (50 μL) conforme a Tabela 1. Esses primers consistem na sequência de sgRNA (3'), que pode inserir o sgRNA no vetor, e um segmento de sequência vetorial (5'), que pode amplificar o fragmento vetorial de comprimento total. Além disso, projete os primers direto e reverso com uma sobreposição de aproximadamente 18 pb dentro da região do sgRNA (mas não totalmente sobrepostos), facilitando a montagem do vetor de clonagem linearizado durante o processo de ligação.
      NOTA: Um fragmento vetorial linearizado no local da sequência de sgRNA com primers por PCR de aproximadamente 5.551 kd deve ser obtido.
   4. Purifique a construção usando um kit de extração de gel e circule-a usando um kit de clonagem. Use os produtos de recombinação para ensaios de transformação.
   5. Escolha os clones únicos das placas e verifique as sequências de codificação sgRorc ou sgNT por meio de sequenciamento de primeira geração, usando o primer do promotor U6 (sequência: ATGGACTATCATATGCTTACCGTA).
   6. Selecione o clone único desejado para amplificação no caldo LB. Extraia DNA de plasmídeo de alta qualidade de células bacterianas usando um kit de plasmídeo livre de endotoxinas.
      NOTA: Certifique-se de que a solução de plasmídeo tenha alta qualidade. Recomendamos que a concentração da solução plasmidial seja de pelo menos 1 μg/μL.
2. Preparação de células de embalagem
   1. Prepare células Platinum-E (Plat-E) usando o seguinte procedimento: cultura de células Plat-E com meio de Eagle modificado de Dulbecco (meio DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 unidades / mL de penicilina e 0,1 mg / mL de estreptomicina em uma placa de cultura de 10 cm. Será referido como o meio de cultura de células a seguir.
      NOTA: Para obter a eficiência de transfecção adequada, recomendamos o uso de células na fase de crescimento logarítmico com menos de 15 números de passagem.
   2. Divida uma placa cheia de células Plat-E de 10 cm (~ 2,6 × 10⁷ células) em uma proporção adequada em uma nova placa de 10 cm 1 dia antes da transfecção para atingir uma confluência celular de aproximadamente 80% no dia seguinte, que é a condição ideal para a transfecção. Realize a passagem celular para um novo prato de 10 cm na proporção de 1:3 (semente ~ 8 × 10⁶ células em um novo prato de 10 cm no dia anterior à transfecção).
      NOTA: A taxa de divisão depende da condição de crescimento das células, com maior eficiência de transfecção alcançável em células que exibem crescimento robusto. Realizamos a passagem celular para um prato de 10 cm na proporção de 1:3. Para diferentes placas de cultura de células, como uma placa de 6 cm, recomendamos que 1,5 × 10⁶ células Plat-E sejam semeadas no dia anterior à transfecção.
3. Transfecção
   1. Uma hora antes da transfecção, substituir o meio de cultura celular por 8 mL de meio sérico reduzido sem vermelho de fenol com 5% de FBS, mas sem penicilina-estreptomicina, pois pode interferir no reagente de transfecção. Aqueça o meio sérico reduzido a 37 °C antes de usar.
   2. Prepare a mistura de transfecção contendo a mistura 1 e a mistura 2: a mistura 1 inclui 18 μg de DNA de plasmídeo (pMXs-U6-MCS-sgNT-mCherry / pMXs-U6-MCS-sgRorc-mCherry) e 6 μg de vetor retroviral ecotrópico pCL (pCL-Eco) em 1.000 μL de meio de soro reduzido. A mistura 2 contém 48 μL de reagente de transfecção em 1.000 μL de meio de soro reduzido. Adicione a mistura 2 gota a gota na mistura 1 e misture delicada e completamente. Incubar o complexo durante 15-20 min a 20-25 °C.
   3. Pingue cuidadosamente a mistura nas células Plat-E, girando a placa suavemente para garantir uma distribuição uniforme. Incubar as células a 37 °C sob 5% de CO₂ durante 6-12 h.
   4. Substitua o meio por 10 ml de meio de cultura de células frescas e continue a incubar as células a 37 °C, 5% de CO₂ durante 48 h.
   5. Avalie a eficiência da transfecção em células Plat-E detectando a marca do vetor retroviral, servindo como um proxy, por meio de microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo.
      NOTA: Um forte sinal de fluorescência mCherry (a fluorescência positiva excede 80%) foi detectado em uma proporção considerável de células Plat-E transfectadas com o vetor pMX-U6-MCS, indicando transfecção bem-sucedida.
   6. Colha o sobrenadante da cultura contendo vírus e centrifugue a 1.500 × g por 10 min para remover fragmentos de células. Alíquota do sobrenadante do vírus 1 ml por frasco para injetáveis e conservar a -80 °C.
      NOTA: A filtração é um método alternativo para remover detritos celulares. Recomendamos o uso de um filtro de seringa com um tamanho de poro de 0,45 μm e uma membrana de polietersulfona (PES) para minimizar a retenção de partículas virais na membrana do filtro.

2. Infecção retroviral de células T CD4 ⁺ ativadas e diferenciação Th17

1. Preparar e ativar células T CD4⁺ virgens primárias
   1. Cubra cada alvéolo de uma placa de cultura de células de 24 poços com 2 μg/ml de anti-CD3e e 4 μg/ml de anti-CD28 em PBS estéril de 500 μL, envolva a placa em parafilme para evitar evaporação e contaminação e, em seguida, incube a placa a 4 °C durante a noite (ou 37 °C durante 1-2 horas antes de plaquear as células T CD4⁺ ) no dia anterior ao isolamento das células T CD4⁺ virgens.
      NOTA: Esta etapa é necessária para realizar a estimulação ligada à placa para as células T do camundongo antes de realizar a transdução viral.
   2. No dia seguinte, eutanasiar camundongos que expressam Cas9 de 6 a 8 semanas de idade (camundongos R26-CAG-Cas9) por asfixia por CO₂ e esterilizá-los com etanol a 70%.
   3. Colha o baço de camundongo e coloque-o em PBS com 2% de FBS e 100 μM de EDTA (tampão FACS).
   4. Triture o baço com vidro fosco esterilizado (lado fosco) no tampão FACS, homogeneize o tecido em uma suspensão unicelular e filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm em um tubo de 50 mL.
      NOTA: Certifique-se de moer o tecido de forma suave e consistente para mantê-lo úmido. A trituração violenta do tecido pode afetar drasticamente a sobrevivência celular.
   5. Gire a suspensão de células esplênicas a 800 × g por 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 2 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Deixe descansar em temperatura ambiente por 5 min e, em seguida, adicione o tampão FACS para atingir um volume total de 15 mL. Centrifugue os esplenócitos a 800 × g por 5 min.
   6. Ressuspender os esplenócitos e filtrá-los através de um filtro de células de 40 μm. Ajuste o volume final para 1 mL para o isolamento de células T CD4⁺ .
   7. Isole as células T CD4⁺ usando kits de reagentes comerciais seguindo as instruções do manual.
   8. Rotule as células T CD4⁺ com uma mistura de anticorpos fluorescentes (CD4, CD25, CD44 e CD62L) a 4 °C por 30 min, lave as células com tampão FACS e isole as células T CD4⁺ virgens usando um classificador de células de fluxo. Isso resultará na obtenção de células T CD4⁺CD25-CD62L^{CD44e baixa} virgens.
   9. Remova o sobrenadante de estimulação ligado à placa da placa de cultura de células de 24 poços (preparada na etapa 2.1.1) e enxágue cada poço duas vezes com 500 μL de PBS. Placa 1 x 10⁶ células T CD4⁺ virgens em 1 mL de meio de cultura de linfócitos em um poço da placa de cultura de células de 24 poços. Incube as células na incubadora de células.
      NOTA: O meio de cultura de linfócitos contém 10% de FBS, 100 unidades / mL de penicilina e 0,1 mg / mL de estreptomicina, 1 mM de piruvato de sódio, 10 mM de HEPES e 50 μM de β-EM em meio RPMI 1640.
2. Infecção retroviral
   1. Após 18-24 h, colete cada poço de células ativadas no tubo de 1,5 mL. Centrifugar a 800 × g durante 5 min e rejeitar o sobrenadante.
   2. Ressuspenda o pellet celular em 1 mL de mistura de infecção (10 μg / mL de brometo de hexadimerina, 10 mM de HEPES no sobrenadante do vírus) e adicione 1 mL da mistura a um novo poço de uma placa de cultura de células de 48 poços. Enquanto isso, guarde células suficientes como controle negativo (não transduzido).
      NOTA: É possível ter menos de 1 x 10⁶ células T CD4 ⁺ virgens ativadas por poço, mas não é recomendado usar menos de 0,5 x 10⁶ células por poço. Além disso, nenhuma célula deve ser semeada nos poços periféricos da placa de cultura de 48 poços.
   3. Envolva a placa com parafilme e centrifugue a 800 x g por 90 min a 32 °C. Defina acelerar e desacelerar em 3. Após centrifugação, remova o parafilme, incube as células na incubadora por 4 h e prossiga com as etapas de diferenciação.
3. Diferenciação de células infectadas em células Th17
   1. Prepare as células apresentadoras de antígenos (APC) durante a infecção retroviral. Primeiro, obtenha esplenócitos de camundongos do tipo selvagem seguindo as instruções das etapas 2.1.2 a 2.1.4. Ressuspenda os esplenócitos com 1 mL de meio de cultura de linfócitos com 50 μg / mL de mitomicina em um tubo de 15 mL. Incubar os esplenócitos a 37 °C sob 5% de CO₂ durante 1 h.
   2. Uma hora depois, adicione PBS até a marca de 15 mL para lavar os esplenócitos, centrifugue a 800 x g por 5 min, descarte o sobrenadante, ressuspenda os esplenócitos com 1 mL de meio de cultura de linfócitos e conte o número de células. As células APC foram preparadas com sucesso.
   3. Após as 4 h de incubação celular (como na etapa 2.2.3), colete as células T CD4 ⁺ transduzidas em tubos de 1,5 mL e centrifugue a 800 x g por 5 min. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células infectadas em 600 μL de PBS para lavar. Centrifugue a 800 x g durante 5 min e elimine o sobrenadante.
   4. Coloque 0,5 × 10⁶ células T CD4 ⁺ transduzidas em 1 mL de meio de cultura de linfócitos com 1,5 x 10⁶ células APC em um poço de uma placa de cultura de células de 24 poços. Suplemento com 2 μg/mL de anti-CD3e, 2 μg/mL de anti-CD28 e coquetel de diferenciação de células Th17, que contém 10 μg/mL de anti-IFNγ, 10 μg/mL anti-IL-12/IL23 p40, 10 μg/mL anti-IL4, 2,5-3 ng/mL de hTGF-β e 20-30 ng/mL de IL-6. Células de cultura por 2 dias.
   5. Colete cada poço de células nos tubos de 1,5 mL, centrifugue a 800 x g por 5 min e descarte o sobrenadante. Atualize 1 mL novo do meio de cultura de linfócitos apenas com 3 ng/mL de TGF-β e 30 ng/mL de IL-6. Coloque as células em um novo poço de placa de cultura de células de 24 poços por um período de cultura prolongado. Analise as células 2 dias após a mudança do meio.

3. Avaliação da eficiência de transdução e resultados de diferenciação

1. Após dois dias de mudança do meio, recolher as células e centrifugar a 800 × g durante 5 min e rejeitar o sobrenadante. Trate as células diferenciadas com 50 ng/mL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), 500 ng/mL de ionomicina e 5 μg/mL de brefeldina A em 500 μL de meio de cultura de linfócitos em um novo poço de placa de cultura de células de 24 poços a 37 ° C em incubadora por 4 h. Colha metade das células para análise de citometria de fluxo e lise a outra metade das células com tampão de extração de RNA para análise de qPCR.
2. Para análise de citometria de fluxo
   1. Colete as células em tubos de 1,5 mL. Adicione 1 mL de tampão FACS em tubos e centrifugue a 800 × g por 5 min para lavar as células.
   2. Ressuspenda o pellet celular com uma mistura de anticorpos fluorescentes (CD4 e Fixable Viability Dye em 100 μL de PBS) e core as células a 4 °C por 30 min.
   3. Lave as células com 300 μL de PBS e fixe-as com 300 μL de formaldeído (FA) tamponado com fosfato a 2% a 4 ° C por pelo menos 60 min.
   4. Uma hora depois, lave as células com PBS, ressuspenda-as com 600 μL de tampão de permeabilização 1x e centrifugue a 800 × g por 5 min.
   5. Descarte o sobrenadante e core com anti-IL-17A em 100 μL de tampão de permeabilização 1x por 60 min em temperatura ambiente ou 4 ° C durante a noite.
   6. No dia seguinte, lave as células com tampão de permeabilização 1x e ressuspenda-as em 200 μL de PBS. Analise as células por citometria^{de fluxo 10}. Consulte a seção Resultados representativos.
3. Para análise de qPCR, extraia RNA seguindo as instruções do kit de extração de RNA. Transcreva o RNA em cDNA para armazenamento ou análise subsequente de qPCR. O design desses primers deve aderir aos princípios gerais de design do primer qPCR, ao mesmo tempo em que visa especificamente a região que abrange o local indel esperado, onde ocorreu a clivagem mediada por gRNA. Qualquer redução na eficiência da amplificação ou perda de sinal neste local pode servir como um indicador de nocaute bem-sucedido. Os primers de qPCR são os seguintes:
   Rorc F: TCCACTACGGGGTTATCACCT; R: AGTAGGCCACATTACACTGCT.
   IL17a F: TCAGCGTGTCCAAACACTGAG; R: CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT.

Resultados

No estudo, clonamos o alvo de sgRNA para Rorc e sequências codificantes sem direcionamento de sgRNA no vetor pMX-U6-MCS com proteína fluorescente mCherry (Figura 1A, B). A produção de retrovírus foi realizada de acordo com o protocolo descrito na Figura 2. A transfecção foi iniciada no dia 0 e a colheita retroviral ocorreu no dia 2. A eficiência da transfecção ...

Discussão

A edição do genoma CRISPR/Cas9 via entrega retroviral é um método robusto para explorar os papéis das células T auxiliares. Este protocolo oferece uma abordagem rápida e eficaz para examinar genes específicos envolvidos na diferenciação e função do Th17. Várias etapas críticas devem ser seguidas cuidadosamente para alcançar os melhores resultados. Primeiro, para aumentar a eficiência do nocaute genético, os gRNAs devem ser cuidadosamente selecionados. Dado o risco de efe...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Solarbio	E1170
100 mm cell and tissue Culture Dish	BIOFIL	TCD010100
1 M Hepes (Free Acid, sterile)	Solarbio	H1090
24-well cell and tissue culture plate	NEST	702002
48-well cell and tissue culture plate	NEST	748002
Brefeldin A Solution (1,000x)	BioLegend	420601
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD4 Antibody (RM4-5)	BioLegend	100546
CD3e Monoclonal Antibody (145-2C11), Functional Grade, eBioscience	Invitrogen	16-0031-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7), PE, eBioscience	Invitrogen	12-0441-83
CD62L (L-Selectin) Monoclonal Antibody (MEL-14), APC, eBioscience	Invitrogen	17-0621-82
Cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto 2000
Cell Strainer (40 μm)	biosharp	BS-40-CS
Cell Strainer (70 μm)	biosharp	BS-70-CS
Centrifuge	eppendorf	5425 R
Centrifuge	eppendorf	5810 R
ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix	Vazyme	Q411-02
ClonExpress II One Step Cloning Kit	Vazyme	C112
DH5α Competent Cells	Sangon Biotech	B528413
Direct-zol RNA Miniprep	ZYMO RESEARCH	R2050
DMEM Medium	BasalMedia	L110KJ
EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit	STEMCELL	19852
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 660	Invitrogen	65-0864-18
EndoFree Mini Plasmid Kit II	TIANGEN	DP118-02
ExFect Transfection Reagent	Vazyme	T101-01
Fetal Bovine Serum, Premium Plus	Gibco	A5669701
FITC anti-mouse IL-17A Antibody (TC11-18H10.1)	BioLegend	506907
Formaldehyde solution	Macklin	F864792
HiScript IV RT SuperMix for qPCR?+gDNA wiper?	Vazyme	R423-01
Ionomycin	Beyotime	S1672
Mitomycin C	Maokang Biotechnology	7/7/1950
Mouse GRCm38	NCBI	RefSeq v.108.20200622
OPTI-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985070	reduced serum medium
Pacific Blue anti-mouse CD4 Antibody (RM4-5)	BioLegend	100531
PE/Cyanine7 anti-mouse CD25 Antibody (PC61)	BioLegend	102015
PE/Cyanine7 anti-mouse CD4 Antibody (GK1.5)	BioLegend	100422
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
PMA/TPA	Beyotime	S1819
R26-CAG-Cas9 mice	Shanghai Model Organisms Center	Cat. NO. NM-KI-00120
Recombinant Human TGF-beta 1 (CHO-Expressed) Protein, CF	R&D Systems	11409-BH
Recombinant Murine IL-6	PeproTech	216-16
Research Cell Analyzer	BD Biosciences	BD LSRFortessa
Research Cell Sorter	SONY	MA900
RPMI 1640 Medium	BasalMedia	L210KJ
SimpliAmp Thermal Cycler PCR System	Applied Biosystems	A24811
Sodium pyruvate solution (100 mM)	Sigma-Aldrich	S8636
Ultra-LEAF Purified anti-mouse CD28 Antibody (37.51)	BioLegend	102121
Ultra-LEAF Purified anti-mouse IFN-γ Antibody (XMG1.2)	BioLegend	505847
Ultra-LEAF Purified anti-mouse IL-4 Antibody (11B11)	BioLegend	504135
Ultra-LEAF Purified anti-mouse IL-12/IL-23 p40 Antibody (C17.8)	BioLegend	505309
β-Mercaptoethanol (50 mM)	Solarbio	M8211