Imágenes de calcio unicelular para estudiar la activación de los canales iónicos de calcio

Resumen

Este artículo presenta un método para el monitoreo cuantitativo en tiempo real de las concentraciones de iones de calcio (Ca²⁺) en células utilizando imágenes de Ca²⁺ de una sola célula con el colorante Fura-2 / AM. Esta técnica permite una carga eficiente de colorante y un cálculo preciso de los niveles de Ca²⁺ a través de las relaciones de intensidad de fluorescencia, lo que la convierte en un enfoque simple y rápido para aplicaciones de investigación.

Resumen

Las imágenes de Ca²⁺ de una sola célula son esenciales para el estudio de los canales de Ca²⁺ activados por diversas estimulaciones como la temperatura, el voltaje, el compuesto nativo y los productos químicos, etc. Se basa principalmente en la tecnología de imágenes de microscopía y el indicador Ca²⁺ relacionado Fura-2/AM (AM es la abreviatura de acetoximetil éster). Dentro de las células, Fura-2/AM es hidrolizado por las esterasas en Fura-2, que puede unirse reversiblemente con el Ca²⁺ citoplasmático libre. La longitud de onda de excitación máxima cambia de 380 nm a 340 nm (cuando está saturada con Ca²⁺) al unirse. La intensidad de fluorescencia emitida está cuantitativamente relacionada con la concentración de Ca²⁺ unido. Al medir la relación 340/380, se puede determinar la concentración de Ca²⁺ en el citoplasma, eliminando los errores causados por las variaciones en la eficiencia de carga de la sonda fluorescente entre diferentes muestras. Esta tecnología permite el monitoreo en tiempo real, cuantitativo y simultáneo de los cambios de Ca²⁺ en múltiples celdas. Los resultados se almacenan en formato ". XLSX" para análisis posteriores, que es rápido y genera curvas de cambio intuitivas, mejorando en gran medida la eficiencia de detección. Desde diferentes perspectivas experimentales, en este artículo se enumera el uso de esta tecnología para detectar señales de Ca²⁺ en células con proteínas de canal endógenas o sobreexpresadas. Mientras tanto, también se mostraron y compararon diferentes métodos para activar las células. El objetivo es proporcionar a los lectores una comprensión más clara del uso y las aplicaciones de las imágenes de Ca²⁺ de una sola célula.

Introducción

El Ca²⁺ desempeña un papel crucial en la transducción de señales celulares, regulando diversas funciones celulares como la contracción muscular¹, la conducción nerviosa², la secreción³ y la expresión génica⁴, influyendo así en múltiples procesos fisiológicos. Las concentraciones anormales de Ca²⁺ pueden provocar enfermedades como arritmias⁵, trastornos de la coagulación⁶ y desequilibrios hormonales⁷. Por lo tanto, el estudio de los mecanismos de los cambios en la concentración intracelular de^Ca2+ es de suma importancia.

Varios canales iónicos están involucrados en la regulación de la concentración de Ca²⁺ en las células, incluidos los canales⁸ de calcio activado por liberación de calcio (CRAC) altamente selectivos de Ca²⁺ y los canales catiónicos no selectivos de la familia TRP⁹. Estos canales iónicos pueden ser activados por estímulos como la temperatura¹⁰, los compuestos y los ingredientes activos que se encuentran en la medicina tradicional china¹¹, desempeñando un papel crucial en varios procesos fisiológicos relacionados con el Ca²⁺.

El control eficaz de los cambios en la concentración intracelular de^Ca2+ es esencial para estudiar los canales iónicos relacionados con el^Ca2+, especialmente en el campo de la medicina tradicional china, donde la regulación de la señalización del calcio desempeña un papel central en muchos enfoques terapéuticos. Actualmente, los principales métodos para medir el Ca²⁺ intracelular se pueden clasificar en dos tipos: mediciones eléctricas y ópticas. El enfoque de medición eléctrica utiliza la técnica de patch-clamp para evaluar los cambios en el potencial de la membrana celular debido a la afluencia de Ca^{2+ 12}.

En la medición óptica, las sondas fluorescentes se unen específicamente al Ca²⁺, lo que permite a los investigadores rastrear los cambios en la intensidad de la fluorescencia celular. Los métodos ópticos comunes incluyen técnicas basadas en proteínas fluorescentes y colorantes fluorescentes. En los métodos basados en proteínas fluorescentes, los investigadores pueden sobreexpresar proteínas fluorescentes sensibles al Ca²⁺ como Cameleon¹³ y GCaMP¹⁴ en las células y monitorear los cambios en la señal de fluorescencia mediante microscopía de fluorescencia o citometría de flujo para observar cambios en las concentraciones citoplasmáticas de Ca²⁺ . Además, los investigadores pueden sobreexpresar estas proteínas en ratones y utilizar la microscopía de fluorescencia de dos fotones para la monitorización en tiempo real in vivo o a nivel tisular de las concentraciones intracelulares de Ca²⁺ , proporcionando una alta resolución y una penetración^{profunda en los} tejidos.

Para los métodos basados en colorantes fluorescentes, las sondas Ca²⁺ comúnmente utilizadas incluyen Fluo-3/AM, Fluo-4/AM y Fura-2/AM¹⁰. Los investigadores incuban las células en una solución que contiene estas sondas fluorescentes, que atraviesan la membrana celular y son escindidas por las esterasas intracelulares para formar compuestos activos (por ejemplo, Fluo-3, Fluo-4 y Fura-2) que permanecen dentro de la célula. Estas sondas exhiben una fluorescencia mínima en su forma de ligando libre, pero emiten una fuerte fluorescencia cuando se unen al Ca²⁺ intracelular, lo que indica cambios en las concentraciones citoplasmáticas de Ca²⁺ . En comparación con otras proteínas y tintes fluorescentes, Fura-2 se excita normalmente a longitudes de onda de 340 nm y 380 nm. Cuando se une al Ca²⁺ libre intracelular, Fura-2 experimenta un cambio de absorción, moviendo el pico de la longitud de onda de excitación de 380 nm a 340 nm, mientras que el pico de emisión cerca de 510 nm permanece sin cambios. Existe una relación cuantitativa entre la intensidad de fluorescencia y la concentración de Ca²⁺ unida, lo que permite calcular la concentración intracelular de Ca²⁺ midiendo la relación de intensidad de fluorescencia en estas dos longitudes de onda de excitación. Las mediciones de la relación reducen los efectos del fotoblanqueo, la fuga de la sonda fluorescente, la carga desigual y las diferencias en el grosor de las células, lo que produce resultados más fiables y reproducibles (Figura 1).

Los sistemas de imágenes de Ca²⁺ de una sola célula utilizan principalmente técnicas de microscopía y el indicador de Ca²⁺ Fura-2/AM para detectar concentraciones intracelulares de Ca²⁺ . Estos sistemas comprenden un microscopio de fluorescencia, una fuente de luz de imagen de Ca²⁺ y un software de imágenes de fluorescencia, que permite el monitoreo cuantitativo en tiempo real de los cambios de Ca²⁺ en el citoplasma de múltiples células simultáneamente (hasta 50 células por campo de visión). Los resultados se guardan en formato ".xlsx" para su posterior análisis. El sistema ofrece una velocidad de análisis rápida (aproximadamente 1 minuto para analizar un grupo de celdas dentro de un campo de visión) y genera curvas de cambio intuitivas, lo que mejora significativamente la eficiencia de la detección. La obtención de imágenes de Ca²⁺ de una sola célula es un enfoque técnico esencial para estudiar los canales relacionados con el Ca²⁺ y tiene un valor considerable en la investigación biomédica relacionada con los canales iónicos. Se espera que su aplicación en la tecnología de imágenes de calcio de una sola célula avance en gran medida la investigación sobre los mecanismos subyacentes a la medicina tradicional china.

Protocolo

Los métodos experimentales fueron aprobados y siguieron las directrices de la IACUC de la Universidad de Tsinghua y la Universidad de Medicina China de Beijing. Este protocolo introduce métodos de imagen de Ca²⁺ de una sola célula para varios tipos de células, incluidos los queratinocitos primarios aislados de la piel de varios ratones recién nacidos (dentro de los tres días posteriores al nacimiento, con compañeros de camada aleatorios por sexo, ratones C57BL/6). Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de la célula

NOTA: Las células primarias, las líneas celulares con genes diana endógenos o las transfectadas con plásmidos sobreexpresados son adecuadas para la obtención de imágenes de Ca²⁺ de una sola célula. Los plásmidos utilizados en este estudio se obtuvieron del laboratorio del profesor Xiao Bailong en la Universidad de Tsinghua. Estos plásmidos se construyeron incorporando secuencias de proteína fluorescente GFP con STIM1 humano, proteína fluorescente DsRed con Orai1 humano, proteína fluorescente mRuby con TRPV1 de conejo, así como la proteína fluorescente roja mCherry en vectores de plásmidos de fagos¹⁰.

1. Prepare portaobjetos de vidrio estéril de 8 mm de diámetro en una placa de 24 pocillos. Agregue 500 μL de tampón de poli-D-lisina (PDL) (50 μg/mL en DPBS) a cada pocillo.
2. Incubar los portaobjetos a 37 °C durante 1 h para permitir el recubrimiento y, a continuación, desechar la solución de recubrimiento con una pipeta.
3. Lave los portaobjetos una vez con DPBS y déjelos a un lado para su uso posterior.
4. Cultivar células primarias y líneas celulares por separado de acuerdo con sus métodos de cultivo específicos¹⁰.
5. Las células de siembra se colocan en la placa preparada de 24 pocillos a una densidad de aproximadamente 1,5 x 10⁵ células por pocillo. Utilice las células para la obtención de imágenes de Ca²⁺ una vez que se hayan adherido al cubreobjetos.
6. En el caso de las células que sobreexpresan plásmidos, transfecte^10,15 el plásmido objetivo (1 μg/pocillo) utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (o Lipofectamine 3000) en una proporción de 1:1 e incube en una incubadora de cultivo celular durante unas 24 h.
   NOTA: Puede ser necesario un tiempo de incubación más largo para las proteínas expresadas más grandes.

2. Preparación de la solución de trabajo Fura-2/AM

1. Añadir 50 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) a un tubo que contenga 50 μg de Fura-2/AM en polvo y mezclar bien para preparar una solución madre de 1 μg/μL de Fura-2/AM.
2. Mezcle la solución madre de Fura-2/AM y Pluronic F-127 en el tampón de Hank que contiene 1,3 mM de Ca²⁺.
   NOTA: La concentración final de Fura-2/AM y Pluronic F-127 en la solución de trabajo es de 2,5 μg/mL. El tampón de Hank se prepara añadiendo 10 mM HEPES a 1x tampón HBSS.
3. Utilice papel de aluminio para proteger la solución de trabajo Fura-2/AM de la luz.

3. Pretratamiento celular para imágenes de Ca²⁺ de una sola célula

1. Transfiera los portaobjetos de vidrio con celdas a una nueva placa de 24 pocillos que contenga tampón de Hank para lavar.
2. Deseche el tampón con una pipeta y añada 500 μL de tampón de trabajo Fura-2/AM a cada pocillo.
3. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos para permitir la carga de la sonda.
4. Retire el tampón de trabajo Fura-2/AM y lave las células tres veces con el tampón de Hank para eliminar el exceso de Fura-2/AM. Las celdas ya están listas para su uso.

4. Puesta en marcha del sistema de imágenes Ca²⁺

NOTA: En este estudio, se utiliza un microscopio de fluorescencia para la obtención de imágenes de Ca²⁺ .

1. Inicie los siguientes componentes en secuencia: luz DG4 (lámpara de xenón), cámara, fuente de luz blanca, controlador de etapa de microscopio, microscopio, computadora y software de imágenes de fluorescencia.
   NOTA: Si detecta la activación de canales iónicos por temperatura, encienda también los siguientes componentes: sistema de perfusión, sistema de calefacción, controlador de temperatura y dispositivo de calefacción / enfriamiento de circulación de líquido.

5. Procedimiento de respuesta celular Ca²⁺

1. Abra el software de imágenes de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales).
   1. Elija Protocolo, luego seleccione Archivo, seguido de Protocolo de carga. Seleccione el protocolo y haga clic en Aceptar.
   2. Configure el experimento (en la lista de menús).
   3. Seleccione Nuevo experimento.
2. Monte la cámara de perfusión en el microscopio.
   NOTA: Siempre baje el objetivo por completo cuando monte o retire las cámaras usando la perilla de enfoque aproximado para evitar daños al objetivo.
3. Retire los portaobjetos de células tratadas con Fura-2/AM y colóquelos en la cámara que contiene el tampón de Hank.
4. Poner en marcha el sistema de perfusión.
5. Selecciona el objetivo DIC 20x y ajusta el enfoque bajo luz blanca.
6. Haga clic en Cfg Exp en la barra de tareas.
   1. Seleccione los fluor deseados para la obtención de imágenes.
   2. Determine la frecuencia de adquisición y la configuración de visualización en la pantalla (Adquisición: verifique 340, 380, GFP; Intervalo de adquisición: 1 s; Intervalo de guardado: 1 s).
7. Centro de atención
   1. En el panel de control del experimento, haga clic en el botón Enfoque .
   2. Ajuste el tiempo de adquisición (generalmente 100 ms) y la ganancia según sea necesario, luego "guarde para esta onda".
      NOTA: Para la luz ultravioleta, use la ganancia en lugar del tiempo de exposición.
   3. Elija la longitud de onda deseada para enfocar (por ejemplo, 380) y haga clic en Iniciar enfoque.
   4. Cambie la vista de los binoculares a la computadora.
   5. Asegúrese de que un tenue color verdoso sea visible a través de los binoculares.
   6. Concéntrese en las celdas, usando primero el enfoque aproximado para acercar el objetivo, luego el enfoque fino.
      NOTA: El microscopio emitirá un pitido si se acerca demasiado a la plataforma. Si esto sucede, baje el objetivo, vuelva a alinear la placa en el escenario y vuelva a enfocar. Minimice el tiempo dedicado a enfocar para reducir el daño celular inducido por el láser.
   7. Compruebe la intensidad de fluorescencia de las células durante el proceso de enfoque.
   8. Ajuste la intensidad de fluorescencia de las células modificando el tiempo de exposición y la ganancia.
      NOTA: El tiempo de exposición y la ganancia para 340 y 380 deben ser consistentes.
   9. Una vez que se logra un buen enfoque, presione el botón en el microscopio para cambiar la vista a la computadora.
   10. Vuelva a enfocar según sea necesario para obtener la imagen más nítida en la computadora, luego haga clic en Detener enfoque.
8. Procedimiento alternativo para encontrar células GFP positivas
   1. Utilice primero el procedimiento 340/380 para lograr un buen enfoque en las células.
   2. Seleccione FITC y luego haga clic en Comenzar a enfocar.
   3. Utilice el controlador de etapa para encontrar celdas positivas para GFP.
   4. Cambie la vista a la computadora y luego haga clic en Dejar de enfocar.
9. Selección de región
   1. Haga clic en el botón Región en la barra de menú.
   2. Seleccione el tipo de iluminación de su elección (340/380/FITC/TRITC). Los filtros FITC y TRITC se seleccionan para GFP y mCherry/DsRed/mRuby, respectivamente, para las células que sobreexpresan los plásmidos objetivo; de lo contrario, seleccione Fura-2.
      NOTA: Evite seleccionar células que estén en mal estado o muertas, como las que están obviamente redondeadas o tienen proteínas fluorescentes sobreexpuestas.
   3. Haga clic en Adquirir imágenes, luego en Aceptar.
   4. Aparecerá una nueva ventana; Seleccione las celdas haciendo clic en la herramienta Óvalo y luego haciendo clic sobre la celda.
   5. Seleccione las células deseadas bajo la fluorescencia transportada por la proteína objetivo (FITC o TRITC). Seleccione las células de control que no expresan la proteína objetivo en la condición de 380 nm.
   6. Para deshacer una región, haga clic con el botón derecho en el círculo y, a continuación, seleccione Eliminar región.
   7. Seleccione una muestra de fondo como última región y registre su número de identificación.
   8. Haga clic en Guardar y luego en Listo.
10. Sustracción de fondo
    1. Haga clic en el botón de menú Referencias.
    2. Indique el número de la región de fondo.
       NOTA: Si el fondo fue la última región seleccionada, al introducir un número muy alto se cambiará automáticamente a la última región seleccionada.
    3. Marque la casilla Restar referencias y luego haga clic en Aceptar.
11. Datos de registro
    1. Haga clic en el botón Registrar datos en el panel de control del experimento.
       NOTA: Las imágenes se guardan solo si existe el deseo de repetir el experimento más tarde; Normalmente, basta con marcar la casilla de datos.
    2. Asegúrese de que aparezca un mensaje solicitando el tipo de archivo de datos preferido; Seleccionar. Se recomienda el formato XLSX .
    3. Se abrirá una hoja de cálculo de tipo ".xlsx". Minimizar la hoja de trabajo evitará que ocupe espacio en la pantalla.
12. Adquisición de datos
    1. En la sección Lapso de tiempo del panel de control, establezca el intervalo de adquisición de datos en 1 s.
       NOTA: Esto se puede ajustar de acuerdo con las necesidades reales.
    2. Haga clic en Reloj cero y Adquirir en el panel de control del experimento para iniciar el experimento. Las líneas de base serán visibles en un gráfico que indica cada una de las regiones de celda seleccionadas.
    3. Realizar una serie de tratamientos sobre las células de acuerdo con los requerimientos experimentales.
    4. Para observar la respuesta a la temperatura de las células, caliente el tampón en el sistema de perfusión a una temperatura adecuada utilizando un controlador de temperatura.
    5. Para observar los efectos de los medicamentos en las células, perfunde o agrega manualmente un tampón que contenga medicamentos y registra los cambios celulares.
    6. Una vez completada la adquisición de datos, haga clic en Pausa.
       NOTA: La adquisición de datos se puede pausar y el reloj se puede reiniciar en cualquier momento durante el experimento.
    7. Guarde y analice los datos.
13. Haga clic en Archivo y Cerrar experimento para finalizar el experimento y seleccione No en el cuadro de diálogo para guardar el protocolo.
14. Abra un nuevo experimento haciendo clic en Nuevo en el menú y repita el proceso.
15. Apaga
    1. Cierre el software y transfiera los datos desde la computadora.
    2. Invierta el procedimiento de inicio.
    3. Registre las horas en la hoja de registro y limpie cualquier desorden.
16. Análisis de datos
    1. Represente la concentración intracelular de Ca²⁺ mediante la relación Fura-2 340/380 o conviértala a la concentración de Ca²⁺ correspondiente.

Resultados

Detección de respuesta a la temperatura
Queratinocitos primarios
Los queratinocitos primarios se aislaron de ratones recién nacidos y se prepararon de acuerdo con los protocolos establecidos¹⁰. Estas células se sembraron en placas de 24 pocillos que contenían portaobjetos de vidrio. Después de la carga de la sonda Fura-2, el enfoque se ajustó bajo el microscopio a una longitud de onda de 380 nm para lograr una visualización ...

Discusión

La aplicación de los sistemas de imagen de Ca²⁺ de una sola célula es extensa, lo que permite el estudio de las señales de Ca²⁺ en varios tipos de células, incluidos queratinocitos, células madre¹⁶, células hepáticas, células cardíacas¹⁷, podocitos¹⁸, células inmunitarias y líneas celulares que sobreexpresan proteínas diana^10,19

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	Nikon
Capsaicine	Sigma	211275
CL-100 temperature controller	Warner Instruments
Cyclopiazonic Acid (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 light	Sutter Instrument Company
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
Fluorescence imaging software (MetaFluor, Paid software)	Molecular Devices
Fluorescence microscope	Nikon
Fura-2/AM	Invitrogen	F1201
HBSS buffer	Gibco	14175103
HEPES	Sigma	H3375
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
Pluronic F-127	Beyotime	ST501
poly-D-lysine	Beyotime	ST508
SC-20 liquid circulation heating/cooling device	Harvard Apparatus
White-light source	Nikon