דימות סידן חד-תאי לחקר הפעלת תעלות יוני סידן

Summary

מאמר זה מציג שיטה לניטור כמותי בזמן אמת של ריכוזי יוני סידן (Ca²⁺) בתאים באמצעות הדמיה חד-תאית Ca²⁺ עם צבע Fura-2/AM. טכניקה זו מאפשרת העמסת צבע יעילה וחישוב מדויק של רמות Ca²⁺ באמצעות יחסי עוצמת פלואורסצנטיות, מה שהופך אותה לגישה פשוטה ומהירה ליישומי מחקר.

Abstract

הדמיה של תא יחיד Ca²⁺ חיונית לחקר ערוצי Ca²⁺ המופעלים על ידי גירויים שונים כמו טמפרטורה, מתח, תרכובת טבעית וכימיקלים וכו '. הוא מסתמך בעיקר על טכנולוגיית הדמיה מיקרוסקופית ועל מחוון Ca²⁺ הקשור Fura-2/AM (AM הוא קיצור של אסטר אצטוקסימתיל). בתוך התאים, Fura-2/AM עובר הידרוליזה על ידי אסטראזות לתוך Fura-2, אשר יכול להיקשר באופן הפיך עם Ca²⁺ ציטופלזמי חופשי. אורך גל העירור המרבי משתנה מ-380 ננומטר ל-340 ננומטר (כאשר הוא רווי ב-Ca²⁺) בעת הקשירה. עוצמת הפלואורסצנטיות הנפלטת קשורה כמותית לריכוז Ca²⁺ כבול. על ידי מדידת יחס 340/380, ניתן לקבוע את ריכוז Ca²⁺ בציטופלסמה, תוך ביטול טעויות הנגרמות כתוצאה משינויים ביעילות ההעמסה של הגשושית הפלואורסצנטית בין דגימות שונות. טכנולוגיה זו מאפשרת ניטור בזמן אמת, כמותי ובו-זמני של שינויי Ca²⁺ בתאים מרובים. התוצאות מאוחסנות ב- ". XLSX" פורמט לניתוח הבא, שהוא מהיר ומייצר עקומות שינוי אינטואיטיביות, שיפור משמעותי של יעילות האיתור. מנקודות מבט ניסיוניות שונות, מאמר זה מפרט את השימוש בטכנולוגיה זו כדי לזהות אותות Ca²⁺ בתאים עם חלבוני ערוץ אנדוגניים או בעלי ביטוי יתר. בינתיים הוצגו והושוו גם שיטות שונות להפעלת תאים. המטרה היא לספק לקוראים הבנה ברורה יותר של השימוש והיישומים של הדמיית Ca²⁺ תא בודד.

Introduction

Ca²⁺ ממלא תפקיד מכריע בהעברת אותות תאיים, מווסת תפקודים תאיים שונים כגון כיווץ שרירים¹, הולכה עצבית², הפרשה³ וביטוי גנים⁴, ובכך משפיע על תהליכים פיזיולוגיים מרובים. ריכוזי Ca²⁺ חריגים עלולים להוביל למחלות כגון הפרעות קצב⁵, הפרעות קרישה⁶ וחוסר איזון הורמונלי⁷. לכן, חקר המנגנונים של שינויי ריכוז תוך תאיים Ca²⁺ הוא בעל חשיבות עליונה.

תעלות יונים שונות מעורבות בוויסות ריכוז Ca²⁺ בתאים,^{כולל תעלות} סידן 8 (CRAC) 8 ותעלות קטיון לא סלקטיביות ממשפחת TRP⁹. תעלות יונים אלה יכולות להיות מופעלות על ידי גירויים כגון טמפרטורה¹⁰, תרכובות וחומרים פעילים הנמצאים ברפואה הסינית המסורתית¹¹, וממלאים תפקיד מכריע בתהליכים פיזיולוגיים שונים הקשורים ל- Ca²⁺.

ניטור יעיל של שינויים בריכוז Ca²⁺ תוך תאי חיוני לחקר תעלות יונים הקשורות ל- Ca²⁺, במיוחד בתחום הרפואה הסינית המסורתית, שם ויסות איתות הסידן משחק תפקיד מרכזי בגישות טיפוליות רבות. כיום, ניתן לסווג את השיטות העיקריות למדידת Ca²⁺ תוך תאי לשני סוגים: מדידות חשמליות ואופטיות. גישת המדידה החשמלית משתמשת בטכניקת מהדק טלאי כדי להעריך שינויים בפוטנציאל קרום התא עקב זרם Ca^{2+ 12}.

במדידה אופטית, גשושיות פלואורסצנטיות נקשרות באופן ספציפי ל-Ca²⁺, ומאפשרות לחוקרים לעקוב אחר שינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות התאית. שיטות אופטיות נפוצות כוללות טכניקות מבוססות חלבון פלואורסצנטי וטכניקות מבוססות צבע פלואורסצנטי. בשיטות מבוססות חלבון פלואורסצנטי, חוקרים יכולים לבטא יתר על המידה חלבונים פלואורסצנטיים רגישים ל-Ca²⁺ כמו Cameleon¹³ ו-GCaMP¹⁴ בתאים ולנטר שינויים באותות הפלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או ציטומטריית זרימה כדי לצפות בשינויים בריכוזי Ca²⁺ ציטופלזמי. בנוסף, חוקרים יכולים לבטא יתר על המידה חלבונים אלה בעכברים ולהשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של שני פוטונים לניטור בזמן אמת in vivo או ברמת הרקמה של ריכוזי Ca²⁺ תוך תאיים, מה שמספק רזולוציה גבוהה וחדירה עמוקה לרקמות¹⁰.

עבור שיטות מבוססות צבע פלואורסצנטי, בדיקות Ca²⁺ נפוצות כוללות Fluo-3/AM, Fluo-4/AM ו- Fura-2/AM¹⁰. חוקרים דוגרים על תאים בתמיסה המכילה את הגשושיות הפלואורסצנטיות הללו, אשר חוצות את קרום התא ונבקעות על ידי אסטראזות תוך-תאיות ליצירת תרכובות פעילות (למשל, Fluo-3, Fluo-4 ו-Fura-2) שנשארות בתוך התא. גשושיות אלה מציגות פלואורסצנטיות מינימלית בצורת הליגנד החופשי שלהן, אך פולטות פלואורסצנטיות חזקה כאשר הן קשורות ל-Ca²⁺ תוך תאי, ובכך מעידות על שינויים בריכוזי Ca²⁺ ציטופלזמי. בהשוואה לחלבונים וצבעים פלואורסצנטיים אחרים, Fura-2 מעורר בדרך כלל באורכי גל של 340 ננומטר ו-380 ננומטר. כאשר הוא קשור ל-Ca²⁺ חופשי תוך-תאי, Fura-2 עובר שינוי בליעה, ומעביר את שיא אורך גל העירור מ-380 ננומטר ל-340 ננומטר, בעוד שיא הפליטה קרוב ל-510 ננומטר נותר ללא שינוי. קיים קשר כמותי בין עוצמת הפלואורסצנטיות לבין ריכוז Ca²⁺ קשור, המאפשר חישוב ריכוז Ca²⁺ תוך תאי על ידי מדידת יחס עוצמת הפלואורסצנטיות בשני אורכי גל עירור אלה. מדידות יחס מפחיתות את ההשפעות של הלבנה פוטו, דליפת בדיקה פלואורסצנטית, עומס לא אחיד והבדלים בעובי התא, ומניבות תוצאות אמינות וניתנות לשחזור יותר (איור 1).

מערכות הדמיה חד-תאיות Ca²⁺ משתמשות בעיקר בטכניקות מיקרוסקופיה ובמחוון Ca²⁺ Fura-2/AM כדי לזהות ריכוזי Ca²⁺ תוך תאיים. מערכות אלה כוללות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מקור אור הדמיה Ca²⁺ ותוכנת הדמיה פלואורסצנטית, המאפשרת ניטור כמותי בזמן אמת של שינויים בציטופלסמה Ca²⁺ של תאים מרובים בו זמנית (עד 50 תאים לכל שדה ראייה). התוצאות נשמרות בפורמט ".xlsx" לניתוח הבא. המערכת מציעה מהירות ניתוח מהירה (כדקה לניתוח קבוצת תאים בשדה ראייה אחד) ומייצרת עקומות שינוי אינטואיטיביות, המשפרות משמעותית את יעילות האיתור. הדמיית Ca²⁺ חד-תאית היא גישה טכנית חיונית לחקר ערוצים הקשורים ל-Ca²⁺ ויש לה ערך רב במחקר ביו-רפואי הקשור לתעלות יונים. יישומה בטכנולוגיית דימות סידן חד-תאי צפוי לקדם מאוד את המחקר על המנגנונים העומדים בבסיס הרפואה הסינית המסורתית.

Protocol

שיטות הניסוי אושרו על ידי ופעלו בהתאם להנחיות IACUC של אוניברסיטת צינגהואה ואוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית. פרוטוקול זה מציג שיטות הדמיה של Ca²⁺ חד-תאי עבור סוגי תאים שונים, כולל קרטינוציטים ראשוניים שבודדו מעורם של מספר עכברים שזה עתה נולדו (תוך שלושה ימים מהלידה, עם חברי המלטה אקראיים למין, C57BL/6 עכברים). פרטים על הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת תאים

הערה: תאים ראשוניים, שורות תאים עם גני מטרה אנדוגניים, או אלה הנגועים בפלסמידים בעלי ביטוי יתר מתאימים כולם להדמיית Ca²⁺ של תא יחיד. הפלסמידים ששימשו במחקר זה התקבלו ממעבדתו של פרופסור שיאו ביילונג באוניברסיטת צינגהואה. פלסמידים אלה נבנו על ידי שילוב רצפים של חלבון פלואורסצנטי GFP עם STIM1 אנושי, חלבון פלואורסצנטי DsRed עם Orai1 אנושי, חלבון פלואורסצנטי mRuby עם ארנב TRPV1, כמו גם חלבון פלואורסצנטי אדום mCherry לתוך וקטורים פלסמיד פאג^'10.

1. הכינו מגלשות זכוכית סטריליות בקוטר 8 מ"מ בצלחת בת 24 בארות. הוסף 500 μL של חיץ פולי-D-ליזין (PDL) (50 מיקרוגרם/מ"ל ב-DPBS) לכל באר.
2. יש לדגור על המגלשות בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת כדי לאפשר ציפוי, ולאחר מכן להשליך את תמיסת הציפוי באמצעות פיפטה.
3. שטפו את המגלשות פעם אחת עם DPBS והניחו אותן בצד לשימוש מאוחר יותר.
4. תרבית תאים ראשוניים וקווי תאים בנפרד בהתאם לשיטות הגידול הספציפיות שלהם¹⁰.
5. תאי זרעים על צלחת 24 בארות מוכן בצפיפות של כ 1.5 x 10⁵ תאים לכל באר. השתמש בתאים להדמיית Ca²⁺ לאחר שהם נצמדו לכיסוי.
6. עבור תאים המבטאים יתר על המידה פלסמידים, יש לבצע טרנספקציה^{של 10,15} פלסמיד המטרה (1 מיקרוגרם / באר) באמצעות מגיב טרנספקציה Lipofectamine 2000 (או Lipofectamine 3000) ביחס של 1:1, ולדגור באינקובטור תרבית תאים במשך כ -24 שעות.
   הערה: זמן דגירה ארוך יותר עשוי להיות נחוץ עבור חלבונים מבוטא גדולים יותר.

2. הכנת פתרון עבודה Fura-2/AM

1. הוסף 50 μL של dimethyl sulfoxide (DMSO) לצינור המכיל 50 מיקרוגרם של אבקת Fura-2/AM וערבב היטב כדי להכין תמיסת ציר 1 מיקרוגרם / μL של Fura-2/AM.
2. ערבבו את תמיסת המניות Fura-2/AM ואת Pluronic F-127 לתוך החיץ של האנק המכיל 1.3 mM Ca²⁺.
   הערה: הריכוז הסופי של Fura-2/AM ו-F-127 פלורוני בתמיסת העבודה הוא 2.5 מיקרוגרם/מ"ל. החיץ של האנק מוכן על ידי הוספת 10 mM HEPES למאגר HBSS 1x.
3. השתמש ברדיד אלומיניום כדי להגן על פתרון העבודה Fura-2/AM מפני אור.

3. טיפול מקדים בתאים להדמיית Ca²⁺ חד-תאי

1. העבירו את מגלשות הזכוכית עם התאים לצלחת חדשה בת 24 בארות המכילה את החיץ של האנק לשטיפה.
2. השליכו את החיץ באמצעות פיפטה והוסיפו 500 μL של חיץ עבודה Fura-2/AM לכל באר.
3. יש לדגור בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות כדי לאפשר העמסת בדיקה.
4. הסר את חיץ העבודה Fura-2/AM ושטוף את התאים שלוש פעמים עם המאגר של האנק כדי לסלק עודפי Fura-2/AM. התאים מוכנים כעת לשימוש.

4. הפעלת מערכת ההדמיה Ca²⁺

הערה: במחקר זה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש להדמיית Ca²⁺ .

1. הפעל את הרכיבים הבאים ברצף: אור DG4 (מנורת קסנון), מצלמה, מקור אור לבן, בקר במה במיקרוסקופ, מיקרוסקופ, מחשב ותוכנת הדמיה פלואורסצנטית.
   הערה: אם אתם מזהים הפעלה של תעלות יונים לפי טמפרטורה, הפעילו גם את הרכיבים הבאים: מערכת זילוח, מערכת חימום, בקר טמפרטורה ומכשיר חימום/קירור למחזור נוזלים.

5. נוהל תגובה סלולרי Ca²⁺

1. פתח את תוכנת ההדמיה הפלואורסצנטית (ראה טבלת חומרים).
   1. בחר פרוטוקול ולאחר מכן בחר קובץ, ולאחר מכן טען פרוטוקול. בחר את הפרוטוקול ולחץ על אישור.
   2. הגדר את הניסוי (ברשימת התפריטים).
   3. בחר ניסוי חדש.
2. הרכיבו את תא הזילוח על המיקרוסקופ.
   הערה: הנמיכו תמיד את המטרה במלואה בעת הרכבה או הסרה של תאים באמצעות ידית המיקוד המחוספסת כדי למנוע נזק למטרה.
3. הסר את שקופיות התאים שטופלו ב- Fura-2/AM ומקם אותן בתא המכיל את החיץ של האנק.
4. הפעל את מערכת הזילוח.
5. בחר את המטרה 20x DIC וכוונן את המיקוד תחת אור לבן.
6. לחץ על Cfg Exp בשורת המשימות.
   1. בחר את הפלואורים הרצויים להדמיה.
   2. קבע את תדירות הרכישה ואת הגדרות התצוגה על המסך (רכישה: בדוק עבור 340, 380, GFP; מרווח רכישה: 1 שניות; מרווח שמור: 1 שניות).
7. מוקד
   1. בלוח הבקרה של הניסוי, לחץ על כפתור פוקוס .
   2. התאימו את זמן הרכישה (בדרך כלל 100 מילישניות) והרוויחו לפי הצורך, ואז "שמרו לגל הזה".
      הערה: עבור אור UV, השתמש רווח במקום זמן חשיפה.
   3. בחר את אורך הגל הרצוי למיקוד (למשל, 380) ולחץ על התחל להתמקד.
   4. העבר את התצוגה מהמשקפת למחשב.
   5. ודא שצבע ירקרק קלוש נראה דרך המשקפת.
   6. התמקדו בתאים, השתמשו תחילה במיקוד גס כדי לקרב את המטרה, ולאחר מכן להתמקד בעדינות.
      הערה: המיקרוסקופ יצפצף אם יתקרב יותר מדי לבמה. אם זה קורה, הנמיכו את המטרה, יישרו מחדש את הצלחת על הבמה והתמקדו שוב. צמצם את זמן ההתמקדות כדי להפחית את הנזק לתאים הנגרם על-ידי לייזר.
   7. בדוק את עוצמת הפלואורסצנטיות של התאים במהלך תהליך המיקוד.
   8. התאם את עוצמת הפלואורסצנטיות של התאים על ידי שינוי זמן החשיפה והרווח.
      הערה: זמן החשיפה והרווח עבור 340 ו- 380 חייבים להיות עקביים.
   9. לאחר השגת מיקוד טוב, לחץ על הלחצן במיקרוסקופ כדי להעביר את התצוגה למחשב.
   10. מיקוד מחדש לפי הצורך כדי לקבל את התמונה החדה ביותר במחשב, ולאחר מכן לחץ על הפסק מיקוד.
8. הליך חלופי למציאת תאים חיוביים GFP
   1. השתמש תחילה בהליך 340/380 כדי להשיג מיקוד טוב בתאים.
   2. בחר FITC ולאחר מכן לחץ על התחל להתמקד.
   3. השתמש בבקר הבמה כדי למצוא תאים חיוביים ל- GFP.
   4. העבר את התצוגה למחשב ולאחר מכן לחץ על הפסק מיקוד.
9. בחירת אזור
   1. לחץ על אזור כפתור בשורת התפריטים.
   2. בחר את סוג התאורה שבחרת (340/380/FITC/TRITC). מסנני FITC ו-TRITC נבחרים עבור GFP ו-mCherry/DsRed/mRuby, בהתאמה, עבור תאים המבטאים יתר על המידה את הפלסמידים הממוקדים; אחרת, בחר Fura-2.
      הערה: הימנע מבחירת תאים במצב גרוע או מתים, כגון אלה שהם בבירור מעוגלים או שיש להם חלבונים פלואורסצנטיים חשופים יתר על המידה.
   3. לחץ על רכוש תמונות, ולאחר מכן אישור.
   4. יופיע חלון חדש; בחר תאים על-ידי לחיצה על הכלי הסגלגל ולאחר מכן לחיצה על התא.
   5. בחר את התאים הרצויים תחת הפלואורסצנטיות הנישא על ידי חלבון המטרה (FITC או TRITC). בחר את תאי הבקרה שאינם מבטאים את חלבון המטרה בתנאי 380 ננומטר.
   6. בטל אזור על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על העיגול ולאחר מכן בחירה באפשרות מחק אזור.
   7. בחר דוגמת רקע כאזור האחרון ורשום את מספר הזיהוי שלו.
   8. לחץ על שמור ולאחר מכן על סיום.
10. חיסור רקע
    1. לחץ על כפתור התפריט הפניות.
    2. ציין את מספר אזור הרקע.
       הערה: אם הרקע היה האזור האחרון שנבחר, הזנת מספר גבוה מאוד תעבור אוטומטית לאזור האחרון שנבחר.
    3. סמן את התיבה החסר הפניות ולאחר מכן לחץ על אישור.
11. נתוני יומן רישום
    1. לחץ על כפתור Log Data בלוח הבקרה של הניסוי.
       הערה: תמונות נשמרות רק אם יש רצון לחזור על הניסוי מאוחר יותר; בדרך כלל, מספיק רק לבדוק את תיבת הנתונים.
    2. ודא שמופיעה בקשה המבקשת את סוג קובץ הנתונים המועדף; בחירת. תבנית XLSX מומלצת.
    3. ייפתח גליון עבודה מסוג ".xlsx". מזעור גליון העבודה ימנע ממנו לתפוס שטח מסך.
12. איסוף נתונים
    1. במקטע Time Lapse בלוח הבקרה, הגדר את מרווח הזמן לרכישת נתונים ל - 1 s.
       הערה: ניתן להתאים זאת בהתאם לצרכים בפועל.
    2. לחץ על שעון אפס ורכוש בלוח הבקרה של הניסוי כדי להתחיל את הניסוי. קווי בסיס יוצגו בגרף המציין כל אחד מאזורי התא שנבחרו.
    3. לבצע סדרת טיפולים בתאים בהתאם לדרישות הניסוי.
    4. כדי לצפות בתגובת הטמפרטורה של התאים, חממו את החיץ במערכת הזילוח לטמפרטורה מתאימה באמצעות בקר טמפרטורה.
    5. כדי לבחון את ההשפעות של תרופות על תאים, יש לנקב או להוסיף ידנית חיץ המכיל תרופות ולתעד את השינויים בתאים.
    6. לאחר השלמת איסוף הנתונים, לחץ על השהה.
       הערה: ניתן להשהות את איסוף הנתונים, ולאפס את השעון בכל עת במהלך הניסוי.
    7. שמור ונתח את הנתונים.
13. לחץ על File and Close Experiment כדי לסיים את הניסוי, ובחר No בתיבת הדו-שיח כדי לשמור את הפרוטוקול.
14. פתח ניסוי חדש על ידי לחיצה על חדש בתפריט, וחזור על התהליך.
15. תסגור
    1. סגור את התוכנה והעבר את הנתונים מהמחשב.
    2. הפוך את הליך ההפעלה.
    3. רשמו את השעות בגיליון ההרשמה ונקו את כל הבלגן.
16. ניתוח נתונים
    1. ייצג את ריכוז Ca²⁺ התוך תאי ביחס Fura-2 340/380 או המר לריכוז Ca²⁺ המתאים.

תוצאות

זיהוי תגובת טמפרטורה
קרטינוציטים ראשוניים
קרטינוציטים ראשוניים בודדו מעכברים שזה עתה נולדו והוכנו על פי פרוטוקולים שנקבעו¹⁰. תאים אלה נזרעו לתוך לוחות של 24 בארות שהכילו מגלשות זכוכית. בעקבות ההעמסה של הגשושית Fura-2, המיקוד הותאם תחת המיקרוס...

Discussion

היישום של מערכות הדמיה של Ca²⁺ חד-תאי הוא נרחב, ומאפשר מחקר של אותות Ca²⁺ בסוגי תאים שונים, כולל קרטינוציטים, תאי גזע¹⁶, תאי כבד, תאי לב¹⁷, פודוציטים¹⁸, תאי חיסון וקווי תאים המבטאים יתר על המידה חלבוני מטרה^10,19

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	Nikon
Capsaicine	Sigma	211275
CL-100 temperature controller	Warner Instruments
Cyclopiazonic Acid (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 light	Sutter Instrument Company
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
Fluorescence imaging software (MetaFluor, Paid software)	Molecular Devices
Fluorescence microscope	Nikon
Fura-2/AM	Invitrogen	F1201
HBSS buffer	Gibco	14175103
HEPES	Sigma	H3375
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
Pluronic F-127	Beyotime	ST501
poly-D-lysine	Beyotime	ST508
SC-20 liquid circulation heating/cooling device	Harvard Apparatus
White-light source	Nikon