Imagem de cálcio de célula única para estudar a ativação de canais de íons de cálcio

Resumo

Este artigo apresenta um método para monitoramento quantitativo em tempo real das concentrações de íons cálcio (Ca²⁺) em células usando imagens de Ca²⁺ de célula única com o corante Fura-2/AM. Essa técnica permite o carregamento eficiente de corantes e o cálculo preciso dos níveis de Ca²⁺ por meio de taxas de intensidade de fluorescência, tornando-a uma abordagem simples e rápida para aplicações de pesquisa.

Resumo

A imagem de Ca²⁺ de célula única é essencial para o estudo dos canais de Ca²⁺ ativados por vários estímulos, como temperatura, voltagem, composto nativo e produtos químicos et al. Ele se baseia principalmente na tecnologia de imagem de microscopia e no indicador Ca²⁺ relacionado Fura-2 / AM (AM é a abreviatura de éster acetoximetílico). Dentro das células, Fura-2 / AM é hidrolisado por esterases em Fura-2, que pode se ligar reversivelmente ao Ca²⁺ citoplasmático livre. O comprimento de onda máximo de excitação muda de 380 nm para 340 nm (quando saturado com Ca²⁺) após a ligação. A intensidade de fluorescência emitida está quantitativamente relacionada à concentração de Ca²⁺ ligado. Ao medir a razão 340/380, a concentração de Ca²⁺ no citoplasma pode ser determinada, eliminando erros causados por variações na eficiência de carregamento da sonda fluorescente entre diferentes amostras. Essa tecnologia permite o monitoramento em tempo real, quantitativo e simultâneo das alterações de Ca²⁺ em várias células. Os resultados são armazenados em ". XLSX" para análise posterior, que é rápida e gera curvas de mudança intuitivas, melhorando muito a eficiência da detecção. A partir de diferentes perspectivas experimentais, este artigo lista o uso dessa tecnologia para detectar sinais de Ca²⁺ em células com proteínas de canal endógenas ou superexpressas. Enquanto isso, diferentes métodos de ativação de células também foram mostrados e comparados. O objetivo é fornecer aos leitores uma compreensão mais clara do uso e das aplicações da imagem de Ca²⁺ de célula única.

Introdução

O Ca²⁺ desempenha um papel crucial na transdução do sinal celular, regulando várias funções celulares, como contração muscular¹, condução nervosa², secreção³ e expressão gênica⁴, influenciando assim vários processos fisiológicos. Concentrações anormais de Ca²⁺ podem levar a doenças como arritmias⁵, distúrbios de coagulação⁶ e desequilíbrios hormonais⁷. Portanto, estudar os mecanismos de mudanças na concentração intracelular de Ca²⁺ é de ....

Protocolo

Os métodos experimentais foram aprovados e seguiram as diretrizes da IACUC da Universidade de Tsinghua e da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim. Este protocolo introduz métodos de imagem de Ca²⁺ de célula única para vários tipos de células, incluindo queratinócitos primários isolados da pele de vários camundongos recém-nascidos (dentro de três dias após o nascimento, com irmãos de ninhada randomizados por sexo, camundongos C57BL / 6). Os detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação celular....

Resultados

Detecção de resposta de temperatura
Queratinócitos primários
Os queratinócitos primários foram isolados de camundongos recém-nascidos e preparados de acordo com protocolos estabelecidos¹⁰. Essas células foram semeadas em placas de 24 poços contendo lâminas de vidro. Após o carregamento da sonda Fura-2, o foco foi ajustado ao microscópio em um comprimento de onda de 380 nm para obter uma visualização clara da morfologi.......

Discussão

A aplicação de sistemas de imagem de Ca²⁺ de célula única é extensa, permitindo o estudo de sinais de Ca²⁺ em vários tipos de células, incluindo queratinócitos, células-tronco¹⁶, células hepáticas, células cardíacas¹⁷, podócitos¹⁸, células imunes e linhagens celulares superexpressando proteínas-alvo^10,19. Essa técnica me.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	Nikon
Capsaicine	Sigma	211275
CL-100 temperature controller	Warner Instruments
Cyclopiazonic Acid (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 light	Sutter Instrument Company
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
Fluorescence imaging software (MetaFluor, Paid software)	Molecular Devices
Fluorescence microscope	Nikon
Fura-2/AM	Invitrogen	F1201
HBSS buffer	Gibco	14175103
HEPES	Sigma	H3375
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
Pluronic F-127	Beyotime	ST501
poly-D-lysine	Beyotime	ST508
SC-20 liquid circulation heating/cooling device	Harvard Apparatus
White-light source	Nikon