Imagem de cálcio de célula única para estudar a ativação de canais de íons de cálcio

Resumo

Este artigo apresenta um método para monitoramento quantitativo em tempo real das concentrações de íons cálcio (Ca²⁺) em células usando imagens de Ca²⁺ de célula única com o corante Fura-2/AM. Essa técnica permite o carregamento eficiente de corantes e o cálculo preciso dos níveis de Ca²⁺ por meio de taxas de intensidade de fluorescência, tornando-a uma abordagem simples e rápida para aplicações de pesquisa.

Resumo

A imagem de Ca²⁺ de célula única é essencial para o estudo dos canais de Ca²⁺ ativados por vários estímulos, como temperatura, voltagem, composto nativo e produtos químicos et al. Ele se baseia principalmente na tecnologia de imagem de microscopia e no indicador Ca²⁺ relacionado Fura-2 / AM (AM é a abreviatura de éster acetoximetílico). Dentro das células, Fura-2 / AM é hidrolisado por esterases em Fura-2, que pode se ligar reversivelmente ao Ca²⁺ citoplasmático livre. O comprimento de onda máximo de excitação muda de 380 nm para 340 nm (quando saturado com Ca²⁺) após a ligação. A intensidade de fluorescência emitida está quantitativamente relacionada à concentração de Ca²⁺ ligado. Ao medir a razão 340/380, a concentração de Ca²⁺ no citoplasma pode ser determinada, eliminando erros causados por variações na eficiência de carregamento da sonda fluorescente entre diferentes amostras. Essa tecnologia permite o monitoramento em tempo real, quantitativo e simultâneo das alterações de Ca²⁺ em várias células. Os resultados são armazenados em ". XLSX" para análise posterior, que é rápida e gera curvas de mudança intuitivas, melhorando muito a eficiência da detecção. A partir de diferentes perspectivas experimentais, este artigo lista o uso dessa tecnologia para detectar sinais de Ca²⁺ em células com proteínas de canal endógenas ou superexpressas. Enquanto isso, diferentes métodos de ativação de células também foram mostrados e comparados. O objetivo é fornecer aos leitores uma compreensão mais clara do uso e das aplicações da imagem de Ca²⁺ de célula única.

Introdução

O Ca²⁺ desempenha um papel crucial na transdução do sinal celular, regulando várias funções celulares, como contração muscular¹, condução nervosa², secreção³ e expressão gênica⁴, influenciando assim vários processos fisiológicos. Concentrações anormais de Ca²⁺ podem levar a doenças como arritmias⁵, distúrbios de coagulação⁶ e desequilíbrios hormonais⁷. Portanto, estudar os mecanismos de mudanças na concentração intracelular de Ca²⁺ é de suma importância.

Vários canais iônicos estão envolvidos na regulação da concentração de Ca²⁺ nas células, incluindo canais de cálcio ativado por liberação de cálcio altamente seletivo de Ca²⁺ (CRAC)⁸ e canais catiônicos não seletivos da família TRP⁹. Esses canais iônicos podem ser ativados por estímulos como temperatura¹⁰, compostos e ingredientes ativos encontrados na medicina tradicional chinesa¹¹, desempenhando um papel crucial em vários processos fisiológicos relacionados ao Ca²⁺.

O monitoramento efetivo das mudanças na concentração intracelular de Ca²⁺ é essencial para estudar os canais iônicos relacionados ao Ca²⁺, particularmente no campo da medicina tradicional chinesa, onde a regulação da sinalização do cálcio desempenha um papel central em muitas abordagens terapêuticas. Atualmente, os principais métodos de medição de Ca²⁺ intracelular podem ser categorizados em dois tipos: medidas elétricas e ópticas. A abordagem de medição elétrica usa a técnica patch-clamp para avaliar as mudanças no potencial da membrana celular devido ao influxo de Ca^{2+ 12}.

Na medição óptica, as sondas fluorescentes se ligam especificamente ao Ca²⁺, permitindo que os pesquisadores rastreiem as mudanças na intensidade da fluorescência celular. Os métodos ópticos comuns incluem técnicas baseadas em proteínas fluorescentes e baseadas em corantes fluorescentes. Em métodos baseados em proteínas fluorescentes, os pesquisadores podem superexpressar proteínas fluorescentes sensíveis a Ca²⁺, como Cameleon¹³ e GCaMP¹⁴ em células e monitorar as alterações do sinal de fluorescência usando microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo para observar mudanças nas concentrações citoplasmáticas de Ca²⁺ . Além disso, os pesquisadores podem superexpressar essas proteínas em camundongos e usar microscopia de fluorescência de dois fótons para monitoramento in vivo ou em nível de tecido em tempo real das concentrações intracelulares de Ca²⁺ , fornecendo alta resolução e penetração profunda nos tecidos¹⁰.

Para métodos baseados em corantes fluorescentes, as sondas Ca²⁺ comumente usadas incluem Fluo-3/AM, Fluo-4/AM e Fura-2/AM¹⁰. Os pesquisadores incubam as células em uma solução contendo essas sondas fluorescentes, que atravessam a membrana celular e são clivadas por esterases intracelulares para formar compostos ativos (por exemplo, Fluo-3, Fluo-4 e Fura-2) que permanecem dentro da célula. Essas sondas exibem fluorescência mínima em sua forma de ligante livre, mas emitem forte fluorescência quando ligadas ao Ca²⁺ intracelular, indicando assim alterações nas concentrações citoplasmáticas de Ca²⁺ . Comparado a outras proteínas e corantes fluorescentes, o Fura-2 é tipicamente excitado em comprimentos de onda de 340 nm e 380 nm. Quando ligado ao Ca livre intracelular²⁺, o Fura-2 sofre uma mudança de absorção, movendo o pico do comprimento de onda de excitação de 380 nm para 340 nm, enquanto o pico de emissão próximo a 510 nm permanece inalterado. Existe uma relação quantitativa entre a intensidade de fluorescência e a concentração de Ca²⁺ ligado, permitindo o cálculo da concentração intracelular de Ca²⁺ medindo a razão de intensidade de fluorescência nesses dois comprimentos de onda de excitação. As medições de proporção reduzem os efeitos do fotobranqueamento, vazamento da sonda fluorescente, carga desigual e diferenças na espessura da célula, produzindo resultados mais confiáveis e reprodutíveis (Figura 1).

Os sistemas de imagem de Ca²⁺ de célula única utilizam principalmente técnicas de microscopia e o indicador de Ca²⁺ Fura-2/AM para detectar concentrações intracelulares de Ca²⁺ . Esses sistemas compreendem um microscópio de fluorescência, uma fonte de luz de imagem de Ca²⁺ e um software de imagem de fluorescência, permitindo o monitoramento quantitativo em tempo real das alterações de Ca²⁺ no citoplasma de várias células simultaneamente (até 50 células por campo de visão). Os resultados são salvos no formato ".xlsx" para análise posterior. O sistema oferece uma velocidade de análise rápida (aproximadamente 1 min para analisar um grupo de células dentro de um campo de visão) e gera curvas de mudança intuitivas, aumentando significativamente a eficiência da detecção. A imagem de Ca²⁺ de célula única é uma abordagem técnica essencial para estudar os canais relacionados ao Ca²⁺ e tem um valor considerável na pesquisa biomédica relacionada ao canal iônico. Espera-se que sua aplicação na tecnologia de imagem de cálcio de célula única avance muito na pesquisa sobre os mecanismos subjacentes à medicina tradicional chinesa.

Protocolo

Os métodos experimentais foram aprovados e seguiram as diretrizes da IACUC da Universidade de Tsinghua e da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim. Este protocolo introduz métodos de imagem de Ca²⁺ de célula única para vários tipos de células, incluindo queratinócitos primários isolados da pele de vários camundongos recém-nascidos (dentro de três dias após o nascimento, com irmãos de ninhada randomizados por sexo, camundongos C57BL / 6). Os detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação celular

NOTA: Células primárias, linhagens celulares com genes-alvo endógenos ou aquelas transfectadas com plasmídeos superexpressos são adequadas para imagens de Ca²⁺ de célula única. Os plasmídeos usados neste estudo foram obtidos do laboratório do professor Xiao Bailong na Universidade de Tsinghua. Esses plasmídeos foram construídos incorporando sequências de proteína fluorescente GFP com STIM1 humano, proteína fluorescente DsRed com Orai1 humano, proteína fluorescente mRuby com TRPV1 de coelho, bem como a proteína fluorescente vermelha mCherry em vetores de plasmídeo de fago¹⁰.

1. Prepare lâminas de vidro estéreis com 8 mm de diâmetro em uma placa de 24 poços. Adicione 500 μL de tampão poli-D-lisina (PDL) (50 μg/mL em DPBS) a cada poço.
2. Incubar as lâminas a 37 °C durante 1 h para permitir o revestimento e, em seguida, rejeitar a solução de revestimento utilizando uma pipeta.
3. Lave as lâminas uma vez com DPBS e reserve-as para uso posterior.
4. Cultivar células primárias e linhagens celulares separadamente de acordo com seus métodos de cultivo específicos¹⁰.
5. Semeie células na placa preparada de 24 poços a uma densidade de aproximadamente 1,5 x 10⁵ células por poço. Use as células para imagens de Ca²⁺ depois de aderidas à lamínula.
6. Para células que superexpressam plasmídeos, transfectar^10,15 o plasmídeo alvo (1 μg/poço) usando o reagente de transfecção Lipofectamine 2000 (ou Lipofectamine 3000) na proporção de 1:1 e incubar em uma incubadora de cultura de células por cerca de 24 h.
   NOTA: Um tempo de incubação mais longo pode ser necessário para proteínas expressas maiores.

2. Preparação da solução de trabalho Fura-2 / AM

1. Adicione 50 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) a um tubo contendo 50 μg de pó de Fura-2 / AM e misture bem para preparar uma solução estoque de 1 μg / μL de Fura-2 / AM.
2. Misture a solução estoque Fura-2 / AM e o Pluronic F-127 no tampão de Hank contendo 1,3 mM de Ca²⁺.
   NOTA: A concentração final de Fura-2/AM e Pluronic F-127 na solução de trabalho é de 2,5 μg/mL. O buffer de Hank é preparado adicionando 10 mM HEPES a 1x buffer HBSS.
3. Use papel alumínio para proteger a solução de trabalho Fura-2/AM da luz.

3. Pré-tratamento celular para imagem de Ca²⁺ de célula única

1. Transfira as lâminas de vidro com células para uma nova placa de 24 poços contendo o tampão de Hank para lavagem.
2. Descarte o tampão usando uma pipeta e adicione 500 μL de tampão de trabalho Fura-2 / AM a cada poço.
3. Incube em temperatura ambiente no escuro por 30 min para permitir o carregamento da sonda.
4. Remova o tampão de trabalho Fura-2 / AM e lave as células três vezes com o tampão de Hank para eliminar o excesso de Fura-2 / AM. As células agora estão prontas para uso.

4. Iniciando o sistema de imagem Ca²⁺

NOTA: Neste estudo, um microscópio de fluorescência é usado para imagens de Ca²⁺ .

1. Inicie os seguintes componentes em sequência: luz DG4 (lâmpada de xenônio), câmera, fonte de luz branca, controlador de platina do microscópio, microscópio, computador e software de imagem de fluorescência.
   NOTA: Se detectar a ativação de canais iônicos por temperatura, ligue também os seguintes componentes: sistema de perfusão, sistema de aquecimento, controlador de temperatura e dispositivo de aquecimento/resfriamento de circulação de líquido.

5. Procedimento de resposta celular de Ca²⁺

1. Abra o software de imagem de fluorescência (consulte a Tabela de Materiais).
   1. Escolha Protocolo e, em seguida, selecione Arquivo e, em seguida, Carregar protocolo. Selecione o protocolo e clique em OK.
   2. Configure o experimento (na lista de menus).
   3. Selecione Novo experimento.
2. Monte a câmara de perfusão no microscópio.
   NOTA: Sempre abaixe totalmente a objetiva ao montar ou remover câmaras usando o botão de foco áspero para evitar danos à objetiva.
3. Remova as lâminas de células tratadas com Fura-2 / AM e coloque-as na câmara que contém o tampão de Hank.
4. Inicie o sistema de perfusão.
5. Selecione a objetiva DIC de 20x e ajuste o foco sob luz branca.
6. Clique em Cfg Exp na barra de tarefas.
   1. Selecione os fluors desejados para a geração de imagens.
   2. Determine a frequência de aquisição e as configurações de exibição na tela (Adquirir: verifique 340, 380, GFP; Intervalo de aquisição: 1 s; Intervalo de salvamento: 1 s).
7. Foco
   1. No painel de controle do experimento, clique no botão Foco .
   2. Ajuste o tempo de aquisição (geralmente 100 ms) e ganhe conforme necessário e, em seguida, "salve para esta onda".
      NOTA: Para luz UV, use ganho em vez de tempo de exposição.
   3. Escolha o comprimento de onda desejado para focar (por exemplo, 380) e clique em Iniciar foco.
   4. Mude a visão dos binóculos para o computador.
   5. Certifique-se de que uma leve cor esverdeada seja visível através dos binóculos.
   6. Concentre-se nas células, usando o foco aproximado primeiro para aproximar o objetivo e, em seguida, o foco fino.
      NOTA: O microscópio emitirá um bipe se chegar muito perto do palco. Se isso acontecer, abaixe a objetiva, realinhe a placa no palco e concentre-se novamente. Minimize o tempo gasto focando para reduzir os danos celulares induzidos por laser.
   7. Verifique a intensidade de fluorescência das células durante o processo de focalização.
   8. Ajuste a intensidade de fluorescência das células modificando o tempo de exposição e o ganho.
      NOTA: O tempo de exposição e o ganho para 340 e 380 devem ser consistentes.
   9. Assim que um bom foco for alcançado, pressione o botão no microscópio para alternar a visualização para o computador.
   10. Volte a focar conforme necessário para obter a imagem mais nítida no computador e clique em Parar de focar.
8. Procedimento alternativo para encontrar células positivas para GFP
   1. Use o procedimento 340/380 primeiro para obter um bom foco nas células.
   2. Selecione FITC e clique em Iniciar foco.
   3. Use o controlador de estágio para encontrar células GFP-positivas.
   4. Mude a visualização para o computador e clique em Parar de focar.
9. Seleção de região
   1. Clique no botão Região na barra de menus.
   2. Selecione o tipo de iluminação de sua escolha (340/380/FITC/TRITC). Os filtros FITC e TRITC são selecionados para GFP e mCherry/DsRed/mRuby, respectivamente, para células que superexpressam os plasmídeos alvo; caso contrário, selecione Fura-2.
      NOTA: Evite selecionar células que estão em más condições ou mortas, como aquelas que são obviamente arredondadas ou têm proteínas fluorescentes superexpostas.
   3. Clique em Adquirir imagens e depois em OK.
   4. Uma nova janela aparecerá; Selecione as células clicando na ferramenta oval e, em seguida, clicando sobre a célula.
   5. Selecione as células desejadas sob a fluorescência transportada pela proteína alvo (FITC ou TRITC). Selecione as células de controle que não expressam a proteína-alvo na condição de 380 nm.
   6. Desfaça uma região clicando com o botão direito do mouse no círculo e selecionando Excluir região.
   7. Selecione uma amostra de plano de fundo como a última região e registre seu número de ID.
   8. Clique em Salvar e depois em Concluído.
10. Subtração de fundo
    1. Clique no botão de menu Referências.
    2. Indique o número da região de fundo.
       NOTA: Se o plano de fundo foi a última região selecionada, inserir um número muito alto mudará automaticamente para a última região escolhida.
    3. Marque a caixa Subtrair referências e clique em OK.
11. Dados de log
    1. Clique no botão Dados de Log no painel de controle do experimento.
       NOTA: As imagens são salvas apenas se houver desejo de reproduzir o experimento mais tarde; Normalmente, apenas marcar a caixa de dados é suficiente.
    2. Certifique-se de que um prompt apareça solicitando o tipo de arquivo de dados preferido; Selecionar. xlsx é recomendado.
    3. Uma planilha do tipo ".xlsx" será aberta. Minimizar a planilha impedirá que ela ocupe espaço na tela.
12. Aquisição de dados
    1. Na seção Time Lapse do painel de controle, defina o intervalo de aquisição de dados como 1 s.
       NOTA: Isso pode ser ajustado de acordo com as necessidades reais.
    2. Clique em Zero Clock e Acquire no painel de controle do experimento para iniciar o experimento. As linhas de base serão visíveis em um gráfico indicando cada uma das regiões de células selecionadas.
    3. Realize uma série de tratamentos nas células de acordo com os requisitos experimentais.
    4. Para observar a resposta à temperatura das células, aqueça o tampão no sistema de perfusão a uma temperatura apropriada usando um controlador de temperatura.
    5. Para observar os efeitos dos medicamentos nas células, perfunda ou adicione manualmente o tampão contendo o medicamento e registre as alterações celulares.
    6. Após a conclusão da aquisição de dados, clique em Pausar.
       NOTA: A aquisição de dados pode ser pausada e o relógio pode ser redefinido a qualquer momento durante o experimento.
    7. Salve e analise os dados.
13. Clique em Arquivo e Fechar Experimento para encerrar o experimento e selecione Não na caixa de diálogo para salvar o protocolo.
14. Abra um novo experimento clicando em Novo no menu e repita o processo.
15. Desligar
    1. Feche o software e transfira os dados do computador.
    2. Inverta o procedimento de inicialização.
    3. Registre as horas na folha de inscrição e limpe qualquer bagunça.
16. Análise de dados
    1. Representar a concentração intracelular de Ca²⁺ pela razão Fura-2 340/380 ou converter para a concentração correspondente de Ca²⁺ .

Resultados

Detecção de resposta de temperatura
Queratinócitos primários
Os queratinócitos primários foram isolados de camundongos recém-nascidos e preparados de acordo com protocolos estabelecidos¹⁰. Essas células foram semeadas em placas de 24 poços contendo lâminas de vidro. Após o carregamento da sonda Fura-2, o foco foi ajustado ao microscópio em um comprimento de onda de 380 nm para obter uma visualização clara da morfologi...

Discussão

A aplicação de sistemas de imagem de Ca²⁺ de célula única é extensa, permitindo o estudo de sinais de Ca²⁺ em vários tipos de células, incluindo queratinócitos, células-tronco¹⁶, células hepáticas, células cardíacas¹⁷, podócitos¹⁸, células imunes e linhagens celulares superexpressando proteínas-alvo^10,19. Essa técnica me...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	Nikon
Capsaicine	Sigma	211275
CL-100 temperature controller	Warner Instruments
Cyclopiazonic Acid (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 light	Sutter Instrument Company
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
Fluorescence imaging software (MetaFluor, Paid software)	Molecular Devices
Fluorescence microscope	Nikon
Fura-2/AM	Invitrogen	F1201
HBSS buffer	Gibco	14175103
HEPES	Sigma	H3375
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
Pluronic F-127	Beyotime	ST501
poly-D-lysine	Beyotime	ST508
SC-20 liquid circulation heating/cooling device	Harvard Apparatus
White-light source	Nikon