Kalsiyum iyon kanallarının aktivasyonunu incelemek için tek hücreli kalsiyum görüntüleme

Özet

Bu makale, Fura-2/boyası ile tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme kullanılarak hücrelerde kalsiyum iyonu (Ca 2+) konsantrasyonlarının gerçek zamanlı, kantitatif izlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, floresan yoğunluk oranları aracılığıyla verimli boya yüklemesi ve Ca²⁺ seviyelerinin doğru bir şekilde hesaplanmasını sağlayarak araştırma uygulamaları için basit ve hızlı bir yaklaşım haline getirir.

Özet

Tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme, sıcaklık, voltaj, doğal bileşik ve kimyasallar ve diğerleri gibi çeşitli stimülasyonlarla aktive edilen Ca²⁺ kanallarının incelenmesi için gereklidir. Öncelikle mikroskopi görüntüleme teknolojisine ve ilgili Ca^{2 +} indikatörü Fura-2 /'ye (, Asetoksimetil esterin kısaltmasıdır) dayanır. Hücrelerin içinde, Fura-2/, esterazlar tarafından Fura-2'ye hidrolize edilir, bu da serbest sitoplazmik Ca^{2 +} ile geri dönüşümlü olarak bağlanabilir. Maksimum uyarma dalga boyu, bağlanma üzerine 380nm'den 340nm'ye (Ca²⁺ ile doyurulduğunda) kayar. Yayılan floresan yoğunluğu, kantitatif olarak bağlı Ca^{2 +} konsantrasyonu ile ilişkilidir. 340/380 oranının ölçülmesiyle, sitoplazmadaki Ca²⁺ konsantrasyonu belirlenebilir ve farklı numuneler arasında floresan probun yükleme verimliliğindeki değişikliklerden kaynaklanan hatalar ortadan kaldırılabilir. Bu teknoloji, birden fazla hücredeki Ca²⁺ değişikliklerinin gerçek zamanlı, nicel ve eşzamanlı olarak izlenmesine olanak tanır. Sonuçlar " içinde saklanır. Hızlı olan ve sezgisel değişim eğrileri oluşturan sonraki analizler için XLSX" formatı, algılama verimliliğini büyük ölçüde artırır. Farklı deneysel perspektiflerden, bu makale, endojen veya aşırı eksprese edilmiş kanal proteinlerine sahip hücrelerde Ca²⁺ sinyallerini tespit etmek için bu teknolojinin kullanımını listeler. Bu arada, hücreleri aktive etmek için farklı yöntemler de gösterildi ve karşılaştırıldı. Amaç, okuyucuların tek hücreli Ca²⁺ görüntülemenin kullanımı ve uygulamaları hakkında daha net bir anlayış sağlamasını sağlamaktır.

Giriş

Ca^{2 +}, kas kasılması 1, sinir iletimi 2, sekresyon³ ve gen ekspresyonu ⁴ gibi çeşitli hücresel fonksiyonları düzenleyerek hücresel sinyal iletiminde çok önemli bir rol oynar ve böylece çoklu fizyolojik süreçleri etkiler. Anormal Ca²⁺ konsantrasyonları aritmiler⁵, pıhtılaşma bozuklukları⁶ ve hormonal dengesizlikler⁷ gibi hastalıklara yol açabilir. Bu nedenle, hücre içi Ca^{2 +} konsantrasyon değişikliklerinin mekanizmalarını incelemek büyük önem taşımaktadır.

Hücrelerde Ca^{2 +} konsantrasyonunun düzenlenmesinde, yüksek Ca^{2 +} seçici kalsiyum salınımı ile aktive edilen kalsiyum (CRAC) kanalları⁸ ve TRP ailesinin⁹ seçici olmayan katyon kanalları dahil olmak üzere çeşitli iyon kanalları yer alır. Bu iyon kanalları, geleneksel Çin tıbbında¹¹ bulunan sıcaklık¹⁰, bileşikler ve aktif bileşenler gibi uyaranlarla aktive edilebilir ve Ca²⁺ ile ilgili çeşitli fizyolojik süreçlerde çok önemli bir rol oynar.

Hücre içi Ca^{2 +} konsantrasyon değişikliklerinin etkili bir şekilde izlenmesi, özellikle kalsiyum sinyal düzenlemesinin birçok terapötik yaklaşımda merkezi bir rol oynadığı geleneksel Çin tıbbı alanında, Ca^{2 +} ile ilgili iyon kanallarını incelemek için gereklidir. Şu anda, hücre içi Ca^{2 +} 'yı ölçmek için birincil yöntemler iki türe ayrılabilir: elektriksel ve optik ölçümler. Elektriksel ölçüm yaklaşımı, Ca²⁺ akışı¹² nedeniyle hücre zarı potansiyelindeki değişiklikleri değerlendirmek için yama-kelepçe tekniğini kullanır.

Optik ölçümde, floresan problar spesifik olarak Ca^{2 +} 'ya bağlanır ve araştırmacıların hücresel floresan yoğunluğundaki değişiklikleri izlemelerine olanak tanır. Yaygın optik yöntemler arasında floresan protein bazlı ve floresan boya bazlı teknikler bulunur. Floresan protein bazlı yöntemlerde, araştırmacılar hücrelerde Cameleon¹³ ve GCaMP¹⁴ gibi Ca^{2 +} 'ya duyarlı floresan proteinleri aşırı eksprese edebilir ve sitoplazmik Ca^{2 +} konsantrasyonlarındaki kaymaları gözlemlemek için floresan mikroskobu veya akış sitometrisi kullanarak floresan sinyal değişikliklerini izleyebilirler. Ek olarak, araştırmacılar bu proteinleri farelerde aşırı eksprese edebilir ve hücre içi Ca²⁺ konsantrasyonlarının gerçek zamanlı in vivo veya doku düzeyinde izlenmesi için iki fotonlu floresan mikroskobu kullanabilir, bu da yüksek çözünürlük ve derin doku penetrasyonu sağlar¹⁰.

Floresan boya bazlı yöntemler için, yaygın olarak kullanılan Ca^{2 +} probları arasında Fluo-3 /, Fluo-4 / ve Fura-2 /¹⁰ bulunur. Araştırmacılar, hücre zarını geçen ve hücre içinde kalan aktif bileşikler (örneğin, Fluo-3, Fluo-4 ve Fura-2) oluşturmak için hücre içi esterazlar tarafından parçalanan bu floresan probları içeren bir çözelti içinde hücreleri inkübe ederler. Bu problar, serbest ligand formlarında minimal floresan sergilerler, ancak hücre içi^Ca2+'ya bağlandığında güçlü floresan yayarlar, böylece sitoplazmik^Ca2+ konsantrasyonlarındaki değişiklikleri gösterir. Diğer floresan proteinler ve boyalarla karşılaştırıldığında, Fura-2 tipik olarak 340 nm ve 380 nm dalga boylarında uyarılır. Hücre içi serbest^Ca2+'ya bağlandığında, Fura-2, uyarma dalga boyu tepe noktasını 380 nm'den 340 nm'ye hareket ettiren bir absorpsiyon kaymasına uğrarken, 510 nm'ye yakın emisyon zirvesi değişmeden kalır. Floresan yoğunluğu ile bağlı Ca²⁺ konsantrasyonu arasında nicel bir ilişki vardır ve bu iki uyarma dalga boyunda floresan yoğunluk oranını ölçerek hücre içi Ca²⁺ konsantrasyonunun hesaplanmasına izin verir. Oran ölçümleri, fotoağartma, floresan prob sızıntısı, düzensiz yükleme ve hücre kalınlığındaki farklılıkların etkilerini azaltarak daha güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar verir (Şekil 1).

Tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme sistemleri, hücre içi Ca 2+ konsantrasyonlarını tespit etmek için öncelikle mikroskopi tekniklerini ve Ca²⁺ indikatörü Fura-2 /'yi kullanır. Bu sistemler, bir floresan mikroskobu, bir Ca²⁺ görüntüleme ışık kaynağı ve floresan görüntüleme yazılımından oluşur ve aynı anda birden fazla hücrenin sitoplazmasındaki Ca²⁺ değişikliklerinin gerçek zamanlı, nicel olarak izlenmesini sağlar (görüş alanı başına 50 hücreye kadar). Sonuçlar, sonraki analizler için ".xlsx" formatında kaydedilir. Sistem, hızlı bir analiz hızı sunar (bir görüş alanındaki bir hücre grubunu analiz etmek için yaklaşık 1 dakika) ve sezgisel değişim eğrileri oluşturarak algılama verimliliğini önemli ölçüde artırır. Tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme, Ca²⁺ ile ilgili kanalları incelemek için önemli bir teknik yaklaşımdır ve iyon kanalı ile ilgili biyomedikal araştırmalarda önemli bir değere sahiptir. Tek hücreli kalsiyum görüntüleme teknolojisindeki uygulamasının, geleneksel Çin tıbbının altında yatan mekanizmalar üzerine yapılan araştırmaları büyük ölçüde ilerletmesi bekleniyor.

Protokol

Deneysel yöntemler, Tsinghua Üniversitesi ve Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi'nin IACUC yönergeleri tarafından onaylandı ve takip edildi. Bu protokol, birkaç yenidoğan farenin derisinden izole edilen primer keratinositler dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri için tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme yöntemlerini tanıtır (doğumdan sonraki üç gün içinde, cinsiyet randomize yavrularla, C57BL / 6 fareler). Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hücre hazırlığı

NOT: Birincil hücreler, endojen hedef genlere sahip hücre hatları veya aşırı eksprese edilmiş plazmitlerle transfekte edilenlerin tümü tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme için uygundur. Bu çalışmada kullanılan plazmitler, Profesör Xiao Bailong'un Tsinghua Üniversitesi'ndeki laboratuvarından elde edildi. Bu plazmitler, insan STIM1 ile GFP floresan proteini, insan Orai1 ile DsRed floresan proteini, tavşan TRPV1 ile mRuby floresan proteini ve ayrıca kırmızı floresan proteini mCherry dizilerinin faj plazmit vektörlerine¹⁰ dahil edilmesiyle oluşturulmuştur.

1. 24 oyuklu bir plakada 8 mm çapında steril cam slaytlar hazırlayın. Her oyuğa 500 μL poli-D-lizin (PDL) tamponu (DPBS'de 50 μg/mL) ekleyin.
2. Kaplamaya izin vermek için slaytları 37 °C'de 1 saat inkübe edin, ardından kaplama solüsyonunu bir pipet kullanarak atın.
3. Slaytları DPBS ile bir kez yıkayın ve daha sonra kullanmak üzere bir kenara koyun.
4. Birincil hücreleri ve hücre hatlarını özel yetiştirme yöntemlerine göre ayrı ayrı kültürleyin¹⁰.
5. Tohum hücreleri, oyuk başına yaklaşık 1.5 x^{10 5} hücre yoğunluğunda hazırlanan 24 oyuklu plakaya yerleştirin. Hücreleri, lamel üzerine yapıştıktan sonra Ca²⁺ görüntüleme için kullanın.
6. Plazmitleri aşırı eksprese eden hücreler için, 1^:1 oranında Lipofectamine 2000 (veya Lipofectamine 3000) transfeksiyon reaktifi kullanarak hedef plazmiti (1 μg/kuyu) ^10,15 transfekte edin ve yaklaşık 24 saat boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
   NOT: Daha büyük eksprese edilen proteinler için daha uzun bir inkübasyon süresi gerekebilir.

2. Fura-2 / çalışma çözeltisinin hazırlanması

1. 50 μg Fura-2 / tozu içeren bir tüpe 50 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin ve 1 μg / μL'lik bir Fura-2 / stok çözeltisi hazırlamak için iyice karıştırın.
2. Fura-2/stok çözeltisini ve Pluronic F-127'yi Hank'in 1.3 mM Ca²⁺ içeren tamponuna karıştırın.
   NOT: Çalışma çözeltisindeki Fura-2/ve Pluronic F-127'nin nihai konsantrasyonu 2.5 μg/mL'dir. Hank'in tamponu, 1x HBSS tamponuna 10 mM HEPES eklenerek hazırlanır.
3. Fura-2/çalışma solüsyonunu ışıktan korumak için alüminyum folyo kullanın.

3. Tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme için hücre ön işlemi

1. Hücreli cam slaytları, yıkama için Hank'in tamponunu içeren 24 oyuklu yeni bir plakaya aktarın.
2. Tamponu bir pipet kullanarak atın ve her oyuğa 500 μL Fura-2 / çalışma tamponu ekleyin.
3. Prob yüklemesine izin vermek için oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika inkübe edin.
4. Fura-2 / çalışma tamponunu çıkarın ve fazla Fura-2 /'yi ortadan kaldırmak için hücreleri Hank'in tamponu ile üç kez yıkayın. Hücreler artık kullanıma hazırdır.

4. Ca²⁺ görüntüleme sisteminin başlatılması

NOT: Bu çalışmada Ca²⁺ görüntüleme için floresan mikroskobu kullanılmıştır.

1. Aşağıdaki bileşenleri sırayla başlatın: DG4 ışığı (ksenon lamba), kamera, beyaz ışık kaynağı, mikroskop aşaması denetleyicisi, mikroskop, bilgisayar ve floresan görüntüleme yazılımı.
   NOT: İyon kanallarının sıcaklığa göre aktivasyonunu tespit ediyorsanız, aşağıdaki bileşenleri de açın: perfüzyon sistemi, ısıtma sistemi, sıcaklık kontrolörü ve sıvı sirkülasyonlu ısıtma/soğutma cihazı.

5. Hücresel Ca^{2 +} yanıt prosedürü

1. Floresan görüntüleme yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu).
   1. Protokol'ü seçin, ardından Dosya'yı ve ardından Protokolü Yükle'yi seçin. Protokolü seçin ve Tamam'a tıklayın.
   2. Denemeyi yapılandırın (menü listesinde).
   3. Yeni Deneme'yi seçin.
2. Perfüzyon odasını mikroskobun üzerine monte edin.
   NOT: Objektifin hasar görmesini önlemek için hazneleri takarken veya çıkarırken kaba netleme düğmesini kullanarak objektifi her zaman tam olarak indirin.
3. Fura-2 / ile muamele edilmiş hücre slaytlarını çıkarın ve bunları Hank'in tamponunu içeren hazneye yerleştirin.
4. Perfüzyon sistemini başlatın.
5. 20x DIC hedefini seçin ve beyaz ışık altında odağı ayarlayın.
6. Görev çubuğundaki Cfg Exp'e tıklayın.
   1. Görüntüleme için istediğiniz florları seçin.
   2. Ekranda alım sıklığını ve görüntü ayarlarını belirleyin (Alma: 340, 380, GFP'yi kontrol edin; Edinme Aralığı: 1 s; Kaydetme Aralığı: 1 s).
7. Odak
   1. Deney kontrol panelinde, Odak düğmesine tıklayın.
   2. Edinme süresini (genellikle 100 ms) ayarlayın ve gerektiği gibi kazanın, ardından "bu dalga için tasarruf edin".
      NOT: UV ışığı için maruz kalma süresi yerine kazanç kullanın.
   3. Odaklama için istediğiniz dalga boyunu seçin (örn. 380) ve Odaklamayı Başlat'a tıklayın.
   4. Dürbünle görüntüyü bilgisayara geçirin.
   5. Dürbünle soluk yeşilimsi bir rengin göründüğünden emin olun.
   6. Hücrelere odaklanın, hedefi yakınlaştırmak için önce kaba odaklamayı, ardından ince odaklamayı kullanın.
      NOT: Mikroskop, sahneye çok yaklaşırsa bip sesi çıkaracaktır. Böyle bir durumda, hedefi indirin, plakayı sahneye yeniden hizalayın ve tekrar odaklanın. Lazer kaynaklı hücre hasarını azaltmak için odaklanmak için harcanan zamanı en aza indirin.
   7. Odaklama işlemi sırasında hücrelerin floresan yoğunluğunu kontrol edin.
   8. Maruz kalma süresini ve kazancını değiştirerek hücrelerin floresan yoğunluğunu ayarlayın.
      NOT: 340 ve 380 için maruz kalma süresi ve kazancı tutarlı olmalıdır.
   9. İyi bir odak elde edildiğinde, görüntüyü bilgisayara geçirmek için mikroskop üzerindeki düğmeye basın.
   10. Bilgisayardaki en keskin görüntüyü elde etmek için gerektiği gibi yeniden odaklanın, ardından Odaklamayı Durdur'a tıklayın.
8. GFP pozitif hücreleri bulmak için alternatif prosedür
   1. Hücrelere iyi bir odaklanma elde etmek için önce 340/380 prosedürünü kullanın.
   2. FITC'yi seçin ve ardından Odaklamayı Başlat'a tıklayın.
   3. GFP pozitif hücreleri bulmak için sahne denetleyicisini kullanın.
   4. Görünümü bilgisayara geçirin ve ardından Odaklamayı Durdur'a tıklayın.
9. Bölge seçimi
   1. Menü çubuğundaki Bölge düğmesine tıklayın.
   2. Tercih ettiğiniz aydınlatma tipini seçin (340/380/FITC/TRITC). FITC ve TRITC filtreleri, hedeflenen plazmitleri aşırı eksprese eden hücreler için sırasıyla GFP ve mCherry/DsRed/mRuby için seçilir; aksi takdirde Fura-2'yi seçin.
      NOT: Açıkça yuvarlatılmış veya aşırı maruz kalmış floresan proteinleri olanlar gibi kötü durumda veya ölü hücreleri seçmekten kaçının.
   3. Görüntüleri Al'a ve ardından Tamam'a tıklayın.
   4. Yeni bir pencere açılacaktır; Oval araca tıklayarak ve ardından hücrenin üzerine tıklayarak hücreleri seçin.
   5. Hedef protein (FITC veya TRITC) tarafından taşınan floresan altında istenen hücreleri seçin. 380 nm koşulu altında hedef proteini eksprese etmeyen kontrol hücrelerini seçin.
   6. Daireye sağ tıklayarak ve ardından Bölgeyi Sil'i seçerek bir bölgeyi geri alın.
   7. Son bölge olarak bir arka plan örneği seçin ve kimlik numarasını kaydedin.
   8. Kaydet'e ve ardından Bitti'ye tıklayın.
10. Arka plan çıkarma
    1. Referanslar menü düğmesine tıklayın.
    2. Arka plan bölgesinin numarasını belirtin.
       NOT: Arka plan en son seçilen bölgeyse, çok yüksek bir sayı girildiğinde otomatik olarak en son seçilen bölgeye geçilir.
    3. Referansları Çıkar kutusunu işaretleyin ve ardından Tamam'a tıklayın.
11. Günlük verileri
    1. Deneme kontrol panelindeki Günlük Verileri düğmesine tıklayın.
       NOT: Görüntüler, yalnızca deneyi daha sonra tekrarlama isteği varsa kaydedilir; Normalde, sadece veri kutusunu işaretlemek yeterlidir.
    2. Tercih edilen veri dosyası türünü soran bir istemin göründüğünden emin olun; Seçme. XLSX formatı önerilir.
    3. ".xlsx" türünde bir çalışma sayfası açılacaktır. Çalışma sayfasını simge durumuna küçültmek, ekranda yer kaplamasını önleyecektir.
12. Veri toplama
    1. Kontrol panelinin Time Lapse (Hızlandırılmış Çekim) bölümünde, veri toplama aralığını 1 s olarak ayarlayın.
       NOT: Bu, gerçek ihtiyaçlara göre ayarlanabilir.
    2. Denemeyi başlatmak için deney kontrol panelinde Zero Clock (Sıfır Saat ) ve Acquire (Edin ) öğesine tıklayın. Taban çizgileri, seçilen hücre bölgelerinin her birini gösteren bir grafikte görünür olacaktır.
    3. Deneysel gereksinimlere göre hücreler üzerinde bir dizi tedavi gerçekleştirin.
    4. Hücrelerin sıcaklık tepkisini gözlemlemek için, perfüzyon sistemindeki tamponu bir sıcaklık kontrolörü kullanarak uygun bir sıcaklığa ısıtın.
    5. İlaçların hücreler üzerindeki etkilerini gözlemlemek için perfüsün veya manuel olarak ilaç içeren tampon ekleyin ve hücre değişikliklerini kaydedin.
    6. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra Duraklat'a tıklayın.
       NOT: Veri alımı duraklatılabilir ve saat, deney sırasında herhangi bir zamanda sıfırlanabilir.
    7. Verileri kaydedin ve analiz edin.
13. Denemeyi sonlandırmak için Dosya ve Denemeyi Kapat'a tıklayın ve protokolü kaydetmek için iletişim kutusunda Hayır'ı seçin.
14. Menüde Yeni'ye tıklayarak yeni bir deneme açın ve işlemi tekrarlayın.
15. Kapat
    1. Yazılımı kapatın ve verileri bilgisayardan aktarın.
    2. Başlatma prosedürünü tersine çevirin.
    3. Saatleri kayıt sayfasına kaydedin ve herhangi bir karışıklığı temizleyin.
16. Veri analizi
    1. Hücre içi^Ca2+ konsantrasyonunu Fura-2 340/380 oranı ile temsil edin veya karşılık gelen^Ca2+ konsantrasyonuna dönüştürün.

Sonuçlar

Sıcaklık tepkisi algılama
Birincil keratinosit
Primer keratinositler yenidoğan farelerden izole edildi ve belirlenen protokollere^{göre hazırlandı 10}. Bu hücreler, cam slaytlar içeren 24 oyuklu plakalara tohumlandı. Fura-2 probunun yüklenmesini takiben, Şekil 2A'da gösterildiği gibi, hücre morfolojisinin net bir görselleştirmesini elde etmek için odak mikroskop altında 380 nm dalga boy...

Tartışmalar

Tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme sistemlerinin uygulaması kapsamlıdır ve keratinositler, kök hücreler¹⁶, karaciğer hücreleri, kalp hücreleri¹⁷, podositler¹⁸, bağışıklık hücreleri ve hedef proteinleri aşırı eksprese eden hücre hatları^10,19 dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde Ca²⁺ sinyallerinin incelenmesini s...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	Nikon
Capsaicine	Sigma	211275
CL-100 temperature controller	Warner Instruments
Cyclopiazonic Acid (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 light	Sutter Instrument Company
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
Fluorescence imaging software (MetaFluor, Paid software)	Molecular Devices
Fluorescence microscope	Nikon
Fura-2/AM	Invitrogen	F1201
HBSS buffer	Gibco	14175103
HEPES	Sigma	H3375
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
Pluronic F-127	Beyotime	ST501
poly-D-lysine	Beyotime	ST508
SC-20 liquid circulation heating/cooling device	Harvard Apparatus
White-light source	Nikon