Establecimiento de un modelo de ratón con hipersensibilidad a la tos por inhalación de ácido cítrico

Resumen

Este protocolo describe el desarrollo de un modelo de ratón con hipersensibilidad a la tos, que puede servir como modelo ideal para estudiar los mecanismos de la tos crónica.

Resumen

La tos es uno de los síntomas más comunes de muchas enfermedades respiratorias. La tos crónica tiene un impacto significativo en la calidad de vida e impone una carga económica considerable. El aumento de la sensibilidad a la tos es un sello fisiopatológico de la tos crónica. Se ha observado que la hipersensibilidad a la tos se relaciona con la inflamación de las vías respiratorias, la remodelación de los nervios sensoriales de las vías respiratorias y las alteraciones del sistema nervioso central. Sin embargo, los mecanismos moleculares precisos siguen sin estar claros y requieren una mayor elucidación utilizando modelos animales adecuados. Estudios previos han utilizado conejillos de indias como modelos para estudiar la tos, pero estos modelos presentan varias limitaciones experimentales, incluyendo altos costos, falta de herramientas transgénicas y escasez de reactivos comerciales. Además, los conejillos de indias suelen mostrar una mala tolerancia ambiental y una alta mortalidad cuando se exponen a estímulos. Por el contrario, los ratones son más pequeños, más fáciles de mantener, más rentables y susceptibles a la manipulación genética, lo que los hace más adecuados para las investigaciones mecánicas. En este estudio, establecimos un modelo de ratón con hipersensibilidad a la tos mediante inhalación continua de ácido cítrico (CA). Este modelo es fácil de operar y produce resultados reproducibles, lo que lo convierte en una herramienta valiosa para estudios posteriores sobre los mecanismos y posibles tratamientos novedosos para la tos crónica.

Introducción

La tos es un reflejo defensivo crucial que ayuda a eliminar las secreciones respiratorias o materiales extraños de las vías respiratorias. Sin embargo, también es uno de los síntomas más comunes de muchas enfermedades respiratorias, lo que a menudo lleva a los pacientes a^{buscar atención médica}. La tos crónica, definida como una tos persistente que dura más de 8 semanas en adultos, impacta significativamente en la calidad de vida, causando problemas como incontinencia, insomnio, reflujo y otras experiencias desagradables, junto con una carga económica sustancial ^2,3,4. Se cree ampliamente que el aumento de la sensibilidad a la tos es un sello fisiopatológico de la tos crónica, donde los niveles bajos de irritantes térmicos, mecánicos y químicos pueden desencadenar^{la tos}. La hipersensibilidad a la tos se asocia con inflamación de las vías respiratorias⁶, remodelación de los nervios sensoriales de las vías respiratorias⁷ y alteraciones en el sistema nervioso central⁸, aunque los mecanismos moleculares precisos siguen sin estar claros y requieren una mayor elucidación a través de modelos animales adecuados.

Se han utilizado varios animales, incluyendo conejillos de indias, gatos, conejos, perros y cerdos, para estudiar los mecanismos de la tos⁹. Los cobayos han sido tradicionalmente reconocidos como el modelo más adecuado para estudiar los mecanismos de la tos y la eficacia de los fármacos antitusivos 9,10,11,12. Sin embargo, estos modelos tienen varias limitaciones experimentales, como los altos costos, la falta de herramientas transgénicas y la escasez de reactivos comerciales. Además, los conejillos de indias a menudo exhiben poca tolerancia ambiental y alta mortalidad cuando se exponen a estímulos. Por el contrario, los ratones son más pequeños, más fáciles de mantener, más rentables y susceptibles a la manipulación genética, lo que los hace más adecuados para las investigaciones mecánicas. Los estudios previos sobre modelos de tos se han centrado principalmente en la tos inducida por la inflamación de las vías respiratorias, utilizada principalmente para evaluar la eficacia de los fármacos antitusivos y los mecanismos periféricos^13,14. Actualmente hay una falta de modelos animales para la hipersensibilidad a la tos.

En respuesta, presentamos un método para establecer un modelo de ratón de hipersensibilidad a la tos a través de la inhalación continua de ácido cítrico (CA). Este modelo es más simple, más fácil de construir y más factible en comparación con otros modelos animales.

Protocolo

Todos los procedimientos de experimentación con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Animales de Laboratorio del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou (20230656). En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6 adultos libres de patógenos específicos, de 8 a 10 semanas de edad y con un peso de 20 a 25 g. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de reactivos químicos

1. Preparación de la solución de ácido cítrico (CA)
   1. Para la evaluación de la tos, prepare una solución 0,4 M disolviendo 3,84 g de ácido cítrico en polvo en solución salina normal hasta un volumen final de 50 mL.
   2. Para el tratamiento animal, prepare una solución 0,1 M disolviendo 9,6 g de ácido cítrico en polvo en solución salina normal hasta un volumen final de 500 mL.
2. Preparación de la solución de capsaicina
   1. Disuelva 30,5 mg de polvo de capsaicina en PBS que contenga 10% de etanol y 10% de Tween-80 para hacer una solución madre de 10 mM.
   2. Diluir la solución madre 1:100 en solución salina normal para hacer una solución de trabajo de 100 μM.
3. Preparación de la solución de metacolina
   1. Disuelva 100 mg de polvo de metacolina en PBS hasta un volumen final de 2 mL para hacer una solución de 50 mg/mL.
   2. Diluya esta solución con PBS para obtener concentraciones de 25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 6,25 mg/mL y 3,125 mg/mL.

2. Preparación animal

1. Condiciones de la vivienda
   1. Ratones domésticos en jaulas con libre acceso a comida y agua, mantenidas a una temperatura de 22 ± 1 °C con un ciclo estándar de luz/oscuridad de 12 horas. Las manipulaciones experimentales se realizaron después de 1 semana de aclimatación al ambiente de alimentación.
2. Aclimatación
   1. Permita que los ratones se aclimaten al entorno de alimentación durante 1 semana antes de realizar manipulaciones experimentales.

3. Desarrollo del modelo

1. Asignación grupal
   1. Divida aleatoriamente los ratones en un grupo modelo y un grupo de control, con 8 ratones en cada grupo.
2. Configuración de la exposición
   1. Coloque los ratones en dos cámaras independientes (como se muestra en la Figura 1), cada una conectada a un nebulizador ultrasónico.
   2. Exponga el grupo modelo a aerosol de ácido cítrico (CA) 0,1 M y el grupo control a aerosol de solución salina normal (NS) al 0,9% a una tasa de atomización de 3 mL/min durante 2 h por día durante 2 semanas (como se muestra en la Figura 2). Regrese los ratones a sus jaulas después de cada exposición.
3. Evaluación de la sensibilidad a la tos
   1. Después de la última exposición, evalúe la sensibilidad a la tos mediante la evaluación de la tos refleja (desafiada con NS, CA (0,4 M) y capsaicina (100 μM)) y la tos espontánea (sin ninguna provocación).
      NOTA: Para monitorear los cambios dinámicos en la sensibilidad a la tos durante el desarrollo del modelo, evalúe la sensibilidad a la tos en los días 0, 3, 7 y 10 utilizando un desafío CA (0.4 M).

4. Evaluación de la sensibilidad a la tos

1. Preparación del instrumento
   1. Use un sistema no invasivo de pletismografía de cuerpo entero (WBP, por sus siglas en inglés) para medir la sensibilidad a la tos. Conecte las cámaras, los transductores de flujo, el flujo de polarización y otros componentes de acuerdo con el manual de aplicación (consulte la Tabla de materiales).
   2. Realice un proceso de calibración para garantizar mediciones precisas haciendo clic en el botón Calibrar . Una pantalla de estado mostrará el progreso y, una vez que la barra de estado alcance el 100%, la calibración se completará.
2. Detección de tos
   1. Cree un estudio de tos para ratones y configure los parámetros para 1 minuto de aclimatación, 10 minutos de tiempo de respuesta y 10 minutos de administración de solución química.
   2. Coloque los ratones conscientes en cámaras individuales, asegurándose de que solo haya un ratón por cámara.
      NOTA: Asegúrese de que el mouse esté completamente dentro de la cámara antes de cerrar la tapa para evitar dañar su cola y dedos.
   3. Agregue 1 mL de las soluciones químicas (NS, CA o capsaicina) al nebulizador.
      NOTA: El número de eventos de tos, cada uno de los cuales consta de tres fases: inspiratoria, compresiva y expulsiva¹⁵ (como se muestra en la Figura 3), se registrará una vez que comience el estudio. Después de 10 minutos de grabación, la detección de tos estará completa. Limpie la cámara después de detectar a cada animal para evitar la contaminación cruzada.

5. Medición de la hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR)

1. Preparación del instrumento
   1. Prepare los instrumentos como se describe en el paso 4.1.
2. Medición de AHR
   1. Cree un estudio de dosis-respuesta para ratones, configurando los tipos de medición, los parámetros y la secuencia de tareas: 1 min para la aclimatación, 30 s para la administración de la solución de metacolina, 3 min para el tiempo de respuesta y 1 min para la recuperación.
   2. Coloque los ratones conscientes en cámaras individuales, asegurándose de que solo haya un ratón por cámara.
   3. Añada 50 μL de las soluciones químicas (PBS o metacolina) al nebulizador e inicie el estudio.
   4. Registre el valor de Penh, un indicador de broncoconstricción, en respuesta a diferentes concentraciones de metacolina (0 mg/mL, 3,125 mg/mL, 6,25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL).

6. Recolección de lavado broncoalveolar

1. Sacrificio
   1. Sacrificar los ratones mediante hiperanestesia con pentobarbital sódico (50 mg/kg) administrado por inyección intraperitoneal (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
2. Recogida de muestras
   1. Recoja sangre del seno orbital del ratón en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y luego coloque el tubo en hielo. Centrifugar la sangre a 3000 x g durante 10 min a 4°C. Utilice una pipeta para recoger el sobrenadante, alicústelo y guárdelo a -80 °C.
   2. Recoja el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) abriendo el tórax para exponer la tráquea, insertando una aguja permanente de 22 G en la tráquea, luego lavando tres veces con 0,5 mL de PBS preenfriado y recogiendo el líquido.
   3. Después de la recolección, centrifugar el BALF a 500 x g durante 10 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante, alícuota y guárdelo a -80 °C. Vuelva a suspender el pellet en 100 μL de PBS y prepare frotis celulares para su posterior análisis.
   4. Recoja los tejidos pulmonares abriendo el tórax para exponer los pulmones, extrayendo los tejidos pulmonares y colocándolos en viales criogénicos. Almacene los viales a -80 °C para futuros estudios.

7. RT-PCR cuantitativa

1. Extraiga el ARN total del tejido pulmonar utilizando el reactivo TRIzol. Realice la síntesis de ADNc utilizando un kit de síntesis de ADNc de primera cadena, siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
2. Realice PCR en un sistema de detección de PCR cuantitativa en tiempo real utilizando fluorescencia verde SYBR. Normalizar la cuantificación de la expresión relativa de ARNm de SP y CGRP a la expresión de β-actina⁹.

8. Análisis estadístico

1. Presentar los datos como la media ± SEM. Utilice una prueba t para comparar los datos entre dos grupos, considerando P < 0,05 como estadísticamente significativos. Realizar todos los análisis estadísticos utilizando software estadístico y de gráficos.

Resultados

Como se muestra en la Figura 4A, la sensibilidad a la tos en el grupo modelo (grupo CA) aumentó significativamente después de 1 semana de exposición en comparación con el grupo control (grupo NS), y esta mayor sensibilidad persistió durante todo el período de exposición. Ni el grupo de control ni los ratones del grupo modelo experimentaron mortalidad durante el proceso de modelado (Figura 4B). Las figuras 4C

Discusión

Este estudio estableció con éxito un modelo de ratón con hipersensibilidad a la tos a través de la inhalación continua de ácido cítrico (CA). Este modelo demostró un aumento fiable de la sensibilidad a la tos, tanto para la tos espontánea como para la tos refleja provocada por el ácido cítrico y la capsaicina. El ácido cítrico y la capsaicina son ampliamente utilizados para evaluar la sensibilidad del reflejo de la tos¹⁶

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% normal saline	Biosharp	BL158A
Capsaicin	Cayman chemical	92350
Citric Acid	Sigma-Aldrich	C2404
Ethanol	Guangzhou chemical reagent factory	GSHB15-AR-0.5L
First-strand cDNA synthesis kit	TransGen Biotech	AT341
Methacholine	Sigma-Aldrich	A2251
Non-invasive whole-body plethysmography (WBP) system	DSI	601-1400-001
Pentobarbital sodium	Merk	P3761
PerfectStart Green qPCR SuperMix	TransGen Biotech	AQ601
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Meilunbio	MA0015
Real-time quantitative PCR detecting system	Bio-rad	CFX  Connect
TRIzol reagent	Invitrogen	15596026CN
Tween-80	Solarbio	T8360-100
Ultrasonic nebulizer	Yuwell	402AI