Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, kronik öksürük mekanizmalarını incelemek için ideal bir model olarak hizmet edebilecek öksürük aşırı duyarlılığına sahip bir fare modelinin geliştirilmesini açıklar.

Özet

Öksürük, birçok solunum yolu hastalığının en yaygın semptomlarından biridir. Kronik öksürük yaşam kalitesini önemli ölçüde etkilemekte ve önemli bir ekonomik yük getirmektedir. Artan öksürük duyarlılığı, kronik öksürüğün patofizyolojik bir özelliğidir. Öksürük aşırı duyarlılığının hava yolu iltihabı, hava yolu duyu sinirlerinin yeniden şekillenmesi ve merkezi sinir sistemindeki değişiklikler ile ilişkili olduğu gözlenmiştir. Bununla birlikte, kesin moleküler mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır ve uygun hayvan modelleri kullanılarak daha fazla açıklama gerektirmektedir. Önceki çalışmalar, öksürüğü incelemek için model olarak kobayları kullanmıştır, ancak bu modeller, yüksek maliyetler, transgenik araçların eksikliği ve ticari reaktiflerin kıtlığı dahil olmak üzere çeşitli deneysel sınırlamalar sunmaktadır. Ek olarak, kobaylar uyaranlara maruz kaldıklarında tipik olarak zayıf çevresel tolerans ve yüksek ölüm oranı sergilerler. Buna karşılık, fareler daha küçük, bakımı daha kolay, daha uygun maliyetli ve genetik manipülasyona uygundur, bu da onları mekanik araştırmalar için daha uygun hale getirir. Bu çalışmada, sitrik asidin (CA) sürekli solunması yoluyla öksürük aşırı duyarlılığı olan bir fare modeli oluşturduk. Bu modelin kullanımı kolaydır ve tekrarlanabilir sonuçlar verir, bu da onu kronik öksürük için mekanizmalar ve potansiyel yeni tedaviler hakkında daha ileri çalışmalar için değerli bir araç haline getirir.

Giriş

Öksürük, solunum salgılarını veya yabancı maddeleri hava yolundan temizlemeye yardımcı olan çok önemli bir savunma refleksidir. Bununla birlikte, aynı zamanda birçok solunum yolu hastalığının en yaygın semptomlarından biridir ve genellikle hastaları tıbbi yardım almaya sevk eder1. Erişkinlerde 8 haftadan uzun süren inatçı öksürük olarak tanımlanan kronik öksürük, yaşam kalitesini önemli ölçüde etkileyerek idrar kaçırma, uykusuzluk, reflü ve diğer hoş olmayan deneyimler gibi sorunlara ve önemli bir ekonomik yüke neden olmaktadır 2,3,4. Artan öksürük duyarlılığının, düşük seviyelerde termal, mekanik ve kimyasal tahriş edici maddelerin öksürüğü tetikleyebileceği kronik öksürüğün patofizyolojik bir özelliği olduğuna yaygın olarak inanılmaktadır5. Öksürük aşırı duyarlılığı, hava yolu iltihabı6, hava yolu duyusal sinirlerinin yeniden şekillenmesi7 ve merkezi sinir sistemindekideğişiklikler 8 ile ilişkilidir, ancak kesin moleküler mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır ve uygun hayvan modelleri aracılığıyla daha fazla açıklama gerektirmektedir.

Gine domuzları, kediler, tavşanlar, köpekler ve domuzlar dahil olmak üzere çeşitli hayvanlar öksürük mekanizmalarını incelemek için kullanılmıştır9. Gine domuzları geleneksel olarak öksürük mekanizmalarını ve antitussif ilaçların etkinliğini incelemek için en uygun model olarak kabul edilmiştir 9,10,11,12. Bununla birlikte, bu modellerin yüksek maliyetler, transgenik araçların eksikliği ve ticari reaktiflerin kıtlığı dahil olmak üzere çeşitli deneysel sınırlamaları vardır. Ek olarak, kobaylar uyaranlara maruz kaldıklarında genellikle zayıf çevresel tolerans ve yüksek ölüm oranı sergilerler. Buna karşılık, fareler daha küçük, bakımı daha kolay, daha uygun maliyetli ve genetik manipülasyona uygundur, bu da onları mekanik araştırmalar için daha uygun hale getirir. Öksürük modelleri üzerine yapılan önceki çalışmalar, esas olarak antitussif ilaçların ve periferik mekanizmaların etkinliğini değerlendirmek için kullanılan hava yolu inflamasyonunun neden olduğu öksürüğe odaklanmıştır13,14. Şu anda öksürük aşırı duyarlılığı için hayvan modelleri eksikliği vardır.

Yanıt olarak, sitrik asidin (CA) sürekli solunması yoluyla öksürük aşırı duyarlılığının bir fare modelini oluşturmak için bir yöntem sunuyoruz. Bu model, diğer hayvan modellerine kıyasla daha basit, yapımı daha kolay ve daha uygulanabilirdir.

Protokol

Tüm hayvan deney prosedürleri, Guangzhou Tıp Üniversitesi (20230656) Birinci Bağlı Hastanesi Laboratuvar Hayvanları Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada 8-10 haftalık ve 20-25 g ağırlığında yetişkin erkek spesifik patojen içermeyen C57BL / 6 fareler kullanıldı. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Kimyasal reaktif hazırlama

  1. Sitrik asit (CA) çözeltisi hazırlama
    1. Öksürük değerlendirmesi için, 3.84 g sitrik asit tozunu normal salin içinde 50 mL'lik bir nihai hacme çözerek 0.4 M'lik bir çözelti hazırlayın.
    2. Hayvan muamelesi için, 9.6 g sitrik asit tozunu normal tuzlu su içinde 500 mL'lik bir nihai hacme çözerek 0.1 M'lik bir çözelti hazırlayın.
  2. Kapsaisin çözeltisi hazırlama
    1. 10 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için% 10 etanol ve% 10 Tween-80 içeren PBS'de 30.5 mg kapsaisin tozunu çözün.
    2. 100 μM'lik bir çalışma çözeltisi elde etmek için stok çözeltisini normal tuzlu suda 1:100 oranında seyreltin.
  3. Metakolin çözeltisi hazırlama
    1. 50 mg / mL'lik bir çözelti yapmak için 100 mg metakolin tozunu PBS'de 2 mL'lik bir nihai hacme çözün.
    2. 25 mg / mL, 12.5 mg / mL, 6.25 mg / mL ve 3.125 mg / mL konsantrasyonlar elde etmek için bu çözeltiyi PBS ile seyreltin.

2. Hayvan hazırlama

  1. Barınma koşulları
    1. Yiyecek ve suya serbest erişimi olan kafeslerdeki ev fareleri, standart 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü ile 22 ± 1 °C sıcaklıkta tutulur. Deneysel manipülasyonlar, beslenme ortamına alıştıktan 1 hafta sonra gerçekleştirildi.
  2. İklimlendirme
    1. Deneysel manipülasyonlar yapmadan önce farelerin 1 hafta boyunca beslenme ortamına alışmasına izin verin.

3. Modelin geliştirilmesi

  1. Grup ödevi
    1. Fareleri rastgele bir model grubuna ve bir kontrol grubuna bölün ve her grupta 8 fare bulun.
  2. Pozlama kurulumu
    1. Fareleri, her biri ultrasonik bir nebülizöre bağlı iki bağımsız odaya (Şekil 1'de gösterildiği gibi) yerleştirin.
    2. Model grubunu 0.1 M sitrik asit (CA) aerosolüne ve kontrol grubunu 0.9 hafta boyunca günde 3 saat boyunca 3 mL / dk'lık bir atomizasyon hızında% 2 normal salin (NS) aerosolüne maruz bırakın ( Şekil 2'de gösterildiği gibi). Her maruziyetten sonra fareleri kafeslerine geri koyun.
  3. Öksürük duyarlılığı değerlendirmesi
    1. Son maruziyetten sonra, refleksif öksürüğü (NS, CA (0.4 M) ve kapsaisin (100 μM) ile zorlanan) ve spontan öksürüğü (herhangi bir zorluk olmadan) değerlendirerek öksürük duyarlılığını değerlendirin.
      NOT: Model geliştirme sırasında öksürük duyarlılığındaki dinamik değişiklikleri izlemek için 0, 3, 7 ve 10. günlerde bir CA (0.4 M) zorluğu kullanarak öksürük duyarlılığını değerlendirin.

4. Öksürük duyarlılığı değerlendirmesi

  1. Enstrüman hazırlığı
    1. Öksürük duyarlılığını ölçmek için non-invaziv bir tüm vücut pletismografi (WBP) sistemi kullanın. Odaları, akış dönüştürücülerini, önyargı akışını ve diğer bileşenleri uygulama kılavuzuna göre bağlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
    2. Kalibre Et düğmesine tıklayarak doğru ölçümleri sağlamak için bir kalibrasyon işlemi gerçekleştirin. Bir durum ekranı ilerlemeyi gösterecek ve durum çubuğu %100'e ulaştığında kalibrasyon tamamlanacaktır.
  2. Öksürük tespiti
    1. Fareler için bir öksürük çalışması oluşturun ve parametreleri 1 dakika alışma, 10 dakika yanıt süresi ve 10 dakika kimyasal çözelti iletimi için yapılandırın.
    2. Bilinçli fareleri ayrı bölmelere yerleştirin ve oda başına yalnızca bir fare olduğundan emin olun.
      NOT: Kuyruğuna ve parmaklarına zarar vermemek için kapağı kapatmadan önce farenin haznenin içinde olduğundan emin olun.
    3. Nebülizöre 1 mL kimyasal çözelti (NS, CA veya kapsaisin) ekleyin.
      NOT: Her biri üç fazdan oluşan öksürük olaylarının sayısı: inspiratuar, kompresyon ve ekspulsif15 ( Şekil 3'te gösterildiği gibi) - çalışma başladıktan sonra kaydedilecektir. 10 dakikalık kayıttan sonra öksürük tespiti tamamlanacaktır. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her bir hayvanı tespit ettikten sonra hazneyi temizleyin.

5. Havayolu Aşırı Duyarlılığı (AHR) ölçümü

  1. Enstrüman hazırlığı
    1. Aletleri adım 4.1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
  2. AHR ölçümü
    1. Fareler için bir doz-yanıt çalışması oluşturun, ölçüm türlerini, parametreleri ve görev sırasını yapılandırın: iklimlendirme için 1 dakika, metakolin çözeltisi iletimi için 30 saniye, yanıt süresi için 3 dakika ve kurtarma için 1 dakika.
    2. Bilinçli fareleri ayrı bölmelere yerleştirin ve oda başına yalnızca bir fare olduğundan emin olun.
    3. Nebulizatöre 50 μL kimyasal çözelti (PBS veya metakolin) ekleyin ve çalışmayı başlatın.
    4. Farklı metakolin konsantrasyonlarına (0 mg / mL, 3.125 mg / mL, 6.25 mg / mL, 12.5 mg / mL, 25 mg / mL, 25 mg / mL, 50 mg / mL) yanıt olarak bronkokonstriksiyonun bir göstergesi olan Penh'in değerini kaydedin.

6. Bronkoalveoler lavaj toplama

  1. Kurban
    1. İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla uygulanan pentobarbital sodyum (50 mg / kg) ile hiperanestezi kullanarak fareleri sakit edin (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
  2. Numune toplama
    1. Farenin orbital sinüsünden kanı 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın, ardından tüpü buzun üzerine yerleştirin. Kanı 3000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı toplamak için bir pipet kullanın, ayırın ve -80 °C'de saklayın.
    2. Trakeayı açığa çıkarmak için göğsü açarak, trakeaya 22 G'lik bir kalıcı iğne sokarak, ardından 0.5 mL önceden soğutulmuş PBS ile üç kez lavaj yaparak ve sıvıyı toplayarak bronkoalveoler lavaj sıvısını (BALF) toplayın.
    3. Toplandıktan sonra, BALIF'ı 500 °C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın, ayırın ve -80 °C'de saklayın. Peleti 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin ve daha fazla analiz için hücre yaymalarını hazırlayın.
    4. Akciğerleri açığa çıkarmak için göğsü açarak, akciğer dokularını çıkararak ve bunları kriyojenik şişelere yerleştirerek akciğer dokularını toplayın. Gelecekteki çalışmalar için şişeleri -80 ° C'de saklayın.

7. Kantitatif RT-PCR

  1. TRIzol reaktifi kullanarak akciğer dokusundan toplam RNA'yı çıkarın. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir Birinci iplikli cDNA sentez kiti kullanarak cDNA sentezi gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. SYBR yeşil floresan kullanarak gerçek zamanlı kantitatif bir PCR tespit sisteminde PCR gerçekleştirin. Bağıl SP ve CGRP mRNA ekspresyonunun nicelleştirilmesini β-Aktin9 ekspresyonuna normalleştirin.

8. İstatistiksel analiz

  1. Verileri ortalama ± SEM olarak sunun. P < 0.05'i istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul ederek iki grup arasındaki verileri karşılaştırmak için bir t-testi kullanın. İstatistik ve grafik yazılımı kullanarak tüm istatistiksel analizleri yapın.

Sonuçlar

Şekil 4A'da gösterildiği gibi, model grubundaki (CA grubu) öksürük duyarlılığı, kontrol grubuna (NS grubu) kıyasla 1 haftalık maruziyetten sonra önemli ölçüde artmıştır ve bu yüksek duyarlılık maruziyet süresi boyunca devam etmiştir. Ne kontrol grubu ne de model grubu fareleri, modelleme işlemi sırasında mortalite yaşamamıştır (Şekil 4B). Şekil 4C ve Şekil 4D, ...

Tartışmalar

Bu çalışma, sitrik asidin (CA) sürekli solunması yoluyla öksürük aşırı duyarlılığı olan bir fare modelini başarıyla oluşturmuştur. Bu model, sitrik asit ve kapsaisin tarafından ortaya çıkan hem spontan öksürükler hem de refleksif öksürükler için öksürük duyarlılığında güvenilir bir artış göstermiştir. Sitrik asit ve kapsaisin, öksürük refleks duyarlılığını değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmakta...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC 82100034), Guangzhou Bilim ve Teknoloji Planlama Projesi (202102010168) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% normal salineBiosharpBL158A
CapsaicinCayman chemical92350
Citric AcidSigma-AldrichC2404
EthanolGuangzhou chemical reagent factoryGSHB15-AR-0.5L
First-strand cDNA synthesis kitTransGen BiotechAT341
MethacholineSigma-AldrichA2251
Non-invasive whole-body plethysmography (WBP) systemDSI601-1400-001
Pentobarbital sodiumMerkP3761
PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen BiotechAQ601
Phosphate Buffered Saline (PBS)MeilunbioMA0015
Real-time quantitative PCR detecting systemBio-rad CFX  Connect
TRIzol reagentInvitrogen15596026CN
Tween-80SolarbioT8360-100
Ultrasonic nebulizerYuwell402AI

Referanslar

  1. Morice, A. H. Epidemiology of cough. Pulm Pharmacol Ther. 15 (3), 253-259 (2002).
  2. Lai, K., Long, L. Current status and future directions of chronic cough in China. Lung. 198 (1), 23-29 (2020).
  3. Zeiger, R. S., et al. Patient-reported burden of chronic cough in a managed care organization. J Allergy Clin Immunol Pract. 9 (4), 1624-1637.e10 (2021).
  4. Chamberlain, S. A., et al. The impact of chronic cough: A cross-sectional European survey. Lung. 193 (3), 401-408 (2015).
  5. Morice, A. H., et al. Expert opinion on the cough hypersensitivity syndrome in respiratory medicine. Eur Respir J. 44 (5), 1132-1148 (2014).
  6. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiol Rev. 96 (3), 975-1024 (2016).
  7. Shapiro, C. O., et al. Airway sensory nerve density is increased in chronic cough. Am J Respir Crit Care Med. 203 (3), 348-355 (2021).
  8. Ando, A., et al. Neural correlates of cough hypersensitivity in humans: Evidence for central sensitization and dysfunctional inhibitory control. Thorax. 71 (4), 323-329 (2016).
  9. Plevkova, J., et al. Animal models of cough. Respir Physiol Neurobiol. 290, 103656 (2021).
  10. Smith, J. A., Hilton, E. C. Y., Saulsberry, L., Canning, B. J. Antitussive effects of memantine in guinea pigs. Chest. 141 (4), 996-1002 (2012).
  11. Hewitt, M. M., et al. Pharmacology of bradykinin-evoked coughing in guinea pigs. J Pharmacol Exp Ther. 357 (3), 620-628 (2016).
  12. Zhong, S., et al. Antitussive activity of the Schisandra chinensis fruit polysaccharide (SCFP-1) in guinea pigs models. J Ethnopharmacol. 194, 378-385 (2016).
  13. Zhong, S., et al. Effects of Schisandra chinensis extracts on cough and pulmonary inflammation in a cough hypersensitivity guinea pig model induced by cigarette smoke exposure. J Ethnopharmacol. 165, 73-82 (2015).
  14. Wei, L., et al. Effects of Shiwei longdanhua formula on LPS-induced airway mucus hypersecretion, cough hypersensitivity, oxidative stress and pulmonary inflammation. Biomed Pharmacother. 163, 114793 (2023).
  15. Chen, L., Lai, K., Lomask, J. M., Jiang, B., Zhong, N. Detection of mouse cough based on sound monitoring and respiratory airflow waveforms. PLoS One. 8 (3), e59263 (2013).
  16. Gibson, P., et al. Treatment of unexplained chronic cough: Chest guideline and expert panel report. Chest. 149 (1), 27-44 (2016).
  17. Nakaji, H., et al. Airway remodeling associated with cough hypersensitivity as a consequence of persistent cough: An experimental study. Respir Investig. 54 (6), 419-427 (2016).
  18. Xu, X., et al. Association of cough hypersensitivity with tracheal trpv1 activation and neurogenic inflammation in a novel guinea pig model of citric acid-induced chronic cough. J Int Med Res. 46 (7), 2913-2924 (2018).
  19. Iwata, T., et al. Mechanical stimulation by postnasal drip evokes cough. PLoS One. 10 (11), e0141823 (2015).
  20. Chen, L., et al. Establishment of a mouse model with all four clinical features of eosinophilic bronchitis. Sci Rep. 10 (1), 10557 (2020).
  21. Zhang, C., Lin, R. L., Hong, J., Khosravi, M., Lee, L. Y. Cough and expiration reflexes elicited by inhaled irritant gases are intensified in ovalbumin-sensitized mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 312 (5), R718-R726 (2017).
  22. Amato, A., Becci, A., Beolchini, F. Citric acid bioproduction: The technological innovation change. Crit Rev Biotechnol. 40 (2), 199-212 (2020).
  23. Hu, W., Li, W. J., Yang, H. Q., Chen, J. H. Current strategies and future prospects for enhancing microbial production of citric acid. Appl Microbiol Biotechnol. 103 (1), 201-209 (2019).
  24. Morice, A. H., Kastelik, J. A., Thompson, R. Cough challenge in the assessment of cough reflex. Br J Clin Pharmacol. 52 (4), 365-375 (2001).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Fare Modeliks r k A r Duyarl lSitrik AsitSolunum Yolu Hastal klarHava Yolu ltihabDuyu SinirleriMerkezi Sinir SistemiKronik ks r kHayvan ModelleriGine DomuzlarGenetik Manip lasyonMekanistik Ara t rmalarEkonomik Y kevresel Tolerans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır