Etablierung eines Mausmodells mit Hustenüberempfindlichkeit durch Inhalation von Zitronensäure

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung eines Mausmodells mit Hustenüberempfindlichkeit, das als ideales Modell für die Untersuchung der Mechanismen des chronischen Hustens dienen kann.

Zusammenfassung

Husten ist eines der häufigsten Symptome vieler Atemwegserkrankungen. Chronischer Husten beeinträchtigt die Lebensqualität erheblich und stellt eine erhebliche wirtschaftliche Belastung dar. Eine erhöhte Hustenempfindlichkeit ist ein pathophysiologisches Kennzeichen des chronischen Hustens. Es wurde beobachtet, dass Hustenüberempfindlichkeit mit einer Entzündung der Atemwege, dem Umbau der sensorischen Nerven der Atemwege und Veränderungen im Zentralnervensystem zusammenhängt. Die genauen molekularen Mechanismen sind jedoch noch unklar und bedürfen weiterer Aufklärung mit geeigneten Tiermodellen. Frühere Studien haben Meerschweinchen als Modelle für die Untersuchung von Husten verwendet, aber diese Modelle weisen mehrere experimentelle Einschränkungen auf, darunter hohe Kosten, einen Mangel an transgenen Werkzeugen und einen Mangel an kommerziellen Reagenzien. Darüber hinaus weisen Meerschweinchen in der Regel eine geringe Umweltverträglichkeit und eine hohe Sterblichkeit auf, wenn sie Reizen ausgesetzt sind. Im Gegensatz dazu sind Mäuse kleiner, pflegeleichter, kostengünstiger und anfällig für genetische Manipulationen, wodurch sie sich besser für mechanistische Untersuchungen eignen. In dieser Studie haben wir ein Mausmodell mit Hustenüberempfindlichkeit durch kontinuierliche Inhalation von Zitronensäure (CA) etabliert. Dieses Modell ist einfach zu bedienen und liefert reproduzierbare Ergebnisse, was es zu einem wertvollen Werkzeug für weitere Studien über die Mechanismen und potenziellen neuen Behandlungen von chronischem Husten macht.

Einleitung

Husten ist ein wichtiger Abwehrreflex, der hilft, Atemwegssekrete oder Fremdstoffe aus den Atemwegen zu entfernen. Sie ist aber auch eines der häufigsten Symptome vieler Atemwegserkrankungen und veranlasst Patienten oft, einen Arzt aufzusuchen¹. Chronischer Husten, definiert als ein anhaltender Husten, der bei Erwachsenen länger als 8 Wochen anhält, beeinträchtigt die Lebensqualität erheblich und verursacht Probleme wie Inkontinenz, Schlaflosigkeit, Reflux und andere unangenehme Erfahrungen sowie eine erhebliche wirtschaftliche Belastung ^2,3,4. Es wird allgemein angenommen, dass eine erhöhte Hustenempfindlichkeit ein pathophysiologisches Kennzeichen von chronischem Husten ist, bei dem geringe Mengen an thermischen, mechanischen und chemischen Reizstoffen Husten auslösen können⁵. Hustenüberempfindlichkeit ist mit einer Entzündung der Atemwege⁶, einem Umbau der sensorischen Nerven der Atemwege⁷ und Veränderungen im Zentralnervensystem⁸ verbunden, obwohl die genauen molekularen Mechanismen unklar bleiben und einer weiteren Aufklärung durch geeignete Tiermodelle bedürfen.

Verschiedene Tiere, darunter Meerschweinchen, Katzen, Kaninchen, Hunde und Schweine, wurden verwendet, um die Mechanismen des Hustens zu untersuchen⁹. Meerschweinchen gelten traditionell als das am besten geeignete Modell für die Untersuchung der Hustenmechanismen und der Wirksamkeit von Hustenmitteln 9,10,11,12. Diese Modelle weisen jedoch mehrere experimentelle Einschränkungen auf, darunter hohe Kosten, einen Mangel an transgenen Werkzeugen und einen Mangel an kommerziellen Reagenzien. Darüber hinaus weisen Meerschweinchen oft eine geringe Umweltverträglichkeit und eine hohe Sterblichkeit auf, wenn sie Reizen ausgesetzt sind. Im Gegensatz dazu sind Mäuse kleiner, pflegeleichter, kostengünstiger und anfällig für genetische Manipulationen, wodurch sie sich besser für mechanistische Untersuchungen eignen. Frühere Studien zu Hustenmodellen konzentrierten sich hauptsächlich auf Husten, der durch Atemwegsentzündungen induziert wurde, und wurden hauptsächlich zur Bewertung der Wirksamkeit von Hustenmitteln und peripheren Mechanismen verwendet^13,14. Derzeit fehlt es an Tiermodellen für die Hustenüberempfindlichkeit.

Als Reaktion darauf stellen wir eine Methode vor, mit der ein Mausmodell für Hustenüberempfindlichkeit durch kontinuierliche Inhalation von Zitronensäure (CA) etabliert werden kann. Dieses Modell ist einfacher, leichter zu konstruieren und im Vergleich zu anderen Tiermodellen praktikabler.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission für Labortiere des First Affiliated Hospital der Guangzhou Medical University (20230656) genehmigt. In dieser Studie wurden adulte männliche spezifisch pathogenfreie C57BL/6-Mäuse im Alter von 8-10 Wochen und mit einem Gewicht von 20-25 g verwendet. Die Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung chemischer Reagenzien

1. Zubereitung der Zitronensäure (CA)-Lösung
   1. Für die Beurteilung des Hustens bereiten Sie eine 0,4-M-Lösung vor, indem Sie 3,84 g Zitronensäurepulver in normaler Kochsalzlösung auf ein Endvolumen von 50 ml auflösen.
   2. Für die Behandlung von Tieren ist eine 0,1-M-Lösung herzustellen, indem 9,6 g Zitronensäurepulver in normaler Kochsalzlösung auf ein Endvolumen von 500 ml aufgelöst werden.
2. Zubereitung der Capsaicin-Lösung
   1. 30,5 mg Capsaicin-Pulver werden in PBS gelöst, das 10 % Ethanol und 10 % Tween-80 enthält, um eine 10 mM Stammlösung herzustellen.
   2. Verdünnen Sie die Stammlösung 1:100 in normaler Kochsalzlösung, um eine Arbeitslösung von 100 μM herzustellen.
3. Zubereitung der Methacholinlösung
   1. Lösen Sie 100 mg Methacholinpulver in PBS auf ein Endvolumen von 2 ml, um eine Lösung von 50 mg/ml herzustellen.
   2. Verdünnen Sie diese Lösung mit PBS, um Konzentrationen von 25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 6,25 mg/ml und 3,125 mg/ml zu erhalten.

2. Vorbereitung der Tiere

1. Bedingungen der Unterbringung
   1. Halten Sie Mäuse in Käfigen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser, die bei einer Temperatur von 22 ± 1 °C mit einem standardmäßigen Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden gehalten werden. Experimentelle Manipulationen wurden nach 1 Woche Eingewöhnung an die Fütterungsumgebung durchgeführt.
2. Akklimatisierung
   1. Lassen Sie die Mäuse sich 1 Woche lang an die Fütterungsumgebung gewöhnen, bevor Sie experimentelle Manipulationen durchführen.

3. Entwicklung des Modells

1. Gruppenzuordnung
   1. Teilen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in eine Modellgruppe und eine Kontrollgruppe mit jeweils 8 Mäusen auf.
2. Belichtung einrichten
   1. Platzieren Sie die Mäuse in zwei unabhängigen Kammern (wie in Abbildung 1 gezeigt), die jeweils mit einem Ultraschallvernebler verbunden sind.
   2. Die Modellgruppe wurde 2 Wochen lang 2 h pro Tag 0,1 M Zitronensäure (CA) Aerosol und die Kontrollgruppe 0,9 % normalem Kochsalz (NS) Aerosol bei einer Zerstäubungsrate von 3 ml/min ausgesetzt (wie in Abbildung 2 gezeigt). Bringen Sie die Mäuse nach jeder Exposition in ihre Käfige zurück.
3. Bewertung der Hustenempfindlichkeit
   1. Nach der letzten Exposition ist die Hustenempfindlichkeit zu beurteilen, indem der reflexive Husten (kontradiktorisch mit NS, CA (0,4 M) und Capsaicin (100 μM)) und der spontane Husten (ohne jegliche Provokation) untersucht werden.
      HINWEIS: Um dynamische Veränderungen der Hustenempfindlichkeit während der Modellentwicklung zu überwachen, beurteilen Sie die Hustenempfindlichkeit an den Tagen 0, 3, 7 und 10 mit einer CA (0,4 M) Challenge.

4. Bewertung der Hustenempfindlichkeit

1. Vorbereitung des Instruments
   1. Verwenden Sie ein nicht-invasives Ganzkörperplethysmographie-System (WBP), um die Hustenempfindlichkeit zu messen. Schließen Sie die Kammern, die Durchflussmessumformer, die Bias-Strömung und andere Komponenten gemäß dem Anwendungshandbuch an (siehe Materialtabelle).
   2. Führen Sie einen Kalibrierungsprozess durch, um genaue Messungen zu gewährleisten, indem Sie auf die Schaltfläche Kalibrieren klicken. Ein Statusbildschirm zeigt den Fortschritt an, und sobald die Statusleiste 100 % erreicht, ist die Kalibrierung abgeschlossen.
2. Husten-Erkennung
   1. Erstellen Sie eine Hustenstudie für Mäuse und konfigurieren Sie die Parameter für 1 Minute Akklimatisierung, 10 Minuten Reaktionszeit und 10 Minuten Verabreichung chemischer Lösung.
   2. Platzieren Sie die bewussten Mäuse in einzelnen Kammern, so dass nur eine Maus pro Kammer vorhanden ist.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Maus vollständig in der Kammer befindet, bevor Sie den Deckel schließen, um eine Beschädigung des Schwanzes und der Finger zu vermeiden.
   3. Geben Sie 1 ml der chemischen Lösungen (NS, CA oder Capsaicin) in den Vernebler.
      HINWEIS: Die Anzahl der Hustenereignisse, die jeweils aus drei Phasen bestehen: inspiratorisch, kompressiv und expultiv¹⁵ (wie in Abbildung 3 gezeigt), wird aufgezeichnet, sobald die Studie beginnt. Nach 10 Minuten der Aufzeichnung ist die Hustenerkennung abgeschlossen. Reinigen Sie die Kammer nach der Erkennung jedes Tieres, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.

5. Messung der Hyperreagibilität der Atemwege (AHR)

1. Vorbereitung des Instruments
   1. Bereiten Sie die Instrumente wie in Schritt 4.1 beschrieben vor.
2. AHR-Messung
   1. Erstellen Sie eine Dosis-Wirkungs-Studie für Mäuse, indem Sie die Messtypen, Parameter und Aufgabensequenz konfigurieren: 1 Minute für die Akklimatisierung, 30 s für die Abgabe von Methacholinlösung, 3 Minuten für die Reaktionszeit und 1 Minute für die Erholung.
   2. Platzieren Sie die bewussten Mäuse in einzelnen Kammern, so dass nur eine Maus pro Kammer vorhanden ist.
   3. Geben Sie 50 μl der chemischen Lösungen (PBS oder Methacholin) in den Vernebler und starten Sie die Studie.
   4. Notieren Sie den Wert von Penh, einem Indikator für Bronchokonstriktion, als Reaktion auf unterschiedliche Konzentrationen von Methacholin (0 mg/ml, 3,125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml).

6. Bronchoalveoläre Lavage-Kollektion

1. Opfer
   1. Die Mäuse werden unter Verwendung einer Hyperanästhesie mit Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg) getötet, das über intraperitoneale Injektion verabreicht wird (gemäß institutionell anerkannten Protokollen).
2. Musterkollektion
   1. Sammeln Sie Blut aus dem Orbitalsinus der Maus in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie das Röhrchen dann auf Eis. Das Blut bei 3000 x g für 10 min bei 4°C zentrifugieren. Den Überstand mit einer Pipette auffangen, aliquotieren und bei -80 °C lagern.
   2. Sammeln Sie die bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF), indem Sie den Brustkorb öffnen, um die Luftröhre freizulegen, eine 22-G-Verweilnadel in die Luftröhre einführen, dann dreimal mit 0,5 ml vorgekühltem PBS spülen und die Flüssigkeit auffangen.
   3. Nach der Entnahme zentrifugieren Sie den BALF bei 500 x g für 10 min bei 4 °C. Der Überstand wird aufgefangen, aliquotiert und bei -80 °C gelagert. Resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl PBS und bereiten Sie Zellabstriche für die weitere Analyse vor.
   4. Sammeln Sie Lungengewebe, indem Sie den Brustkorb öffnen, um die Lunge freizulegen, das Lungengewebe entfernen und in kryogene Fläschchen legen. Lagern Sie die Fläschchen bei -80 °C für zukünftige Studien.

7. Quantitative RT-PCR

1. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus Lungengewebe mit dem TRIzol-Reagenz. Führen Sie die cDNA-Synthese mit einem Erststrang-cDNA-Synthesekit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch (siehe Materialtabelle).
2. Führen Sie die PCR in einem quantitativen Echtzeit-PCR-Nachweissystem mit grüner SYBR-Fluoreszenz durch. Normalisieren Sie die Quantifizierung der relativen SP- und CGRP-mRNA-Expression auf die Expression von β-Aktin⁹.

8. Statistische Auswertung

1. Präsentieren Sie die Daten als Mittelwert ± SEM. Verwenden Sie einen t-Test , um Daten zwischen zwei Gruppen zu vergleichen, wobei P < 0,05 als statistisch signifikant betrachtet wird. Führen Sie alle statistischen Analysen mit Hilfe von Statistik- und Grafiksoftware durch.

Ergebnisse

Wie in Abbildung 4A gezeigt, stieg die Hustenempfindlichkeit in der Modellgruppe (CA-Gruppe) nach 1 Woche Exposition im Vergleich zur Kontrollgruppe (NS-Gruppe) signifikant an, und diese erhöhte Empfindlichkeit blieb während des gesamten Expositionszeitraums bestehen. Weder in der Kontrollgruppe noch in der Modellgruppe kam es während des Modellierungsprozesses zu Mortalität (Abbildung 4B). Abbildung 4C und...

Diskussion

In dieser Studie wurde erfolgreich ein Mausmodell mit Hustenüberempfindlichkeit durch kontinuierliche Inhalation von Zitronensäure (CA) etabliert. Dieses Modell zeigte eine zuverlässige Erhöhung der Hustenempfindlichkeit sowohl bei spontanem Husten als auch bei reflexivem Husten, der durch Zitronensäure und Capsaicin ausgelöst wurde. Zitronensäure und Capsaicin werden häufig zur Beurteilung der Hustenreflexempfindlichkeit verwendet

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% normal saline	Biosharp	BL158A
Capsaicin	Cayman chemical	92350
Citric Acid	Sigma-Aldrich	C2404
Ethanol	Guangzhou chemical reagent factory	GSHB15-AR-0.5L
First-strand cDNA synthesis kit	TransGen Biotech	AT341
Methacholine	Sigma-Aldrich	A2251
Non-invasive whole-body plethysmography (WBP) system	DSI	601-1400-001
Pentobarbital sodium	Merk	P3761
PerfectStart Green qPCR SuperMix	TransGen Biotech	AQ601
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Meilunbio	MA0015
Real-time quantitative PCR detecting system	Bio-rad	CFX  Connect
TRIzol reagent	Invitrogen	15596026CN
Tween-80	Solarbio	T8360-100
Ultrasonic nebulizer	Yuwell	402AI