Istituzione di un modello murino con ipersensibilità alla tosse tramite inalazione di acido citrico

Riepilogo

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un modello murino con ipersensibilità alla tosse, che può fungere da modello ideale per studiare i meccanismi della tosse cronica.

Abstract

La tosse è uno dei sintomi più comuni di molte malattie respiratorie. La tosse cronica ha un impatto significativo sulla qualità della vita e impone un notevole onere economico. L'aumento della sensibilità alla tosse è un segno fisiopatologico della tosse cronica. È stato osservato che l'ipersensibilità alla tosse è correlata all'infiammazione delle vie aeree, al rimodellamento dei nervi sensoriali delle vie aeree e alle alterazioni del sistema nervoso centrale. Tuttavia, i precisi meccanismi molecolari rimangono poco chiari e richiedono ulteriori chiarimenti utilizzando modelli animali adeguati. Studi precedenti hanno utilizzato cavie come modelli per studiare la tosse, ma questi modelli presentano diverse limitazioni sperimentali, tra cui costi elevati, mancanza di strumenti transgenici e scarsità di reagenti commerciali. Inoltre, i porcellini d'india mostrano tipicamente una scarsa tolleranza ambientale e un'elevata mortalità quando esposti agli stimoli. Al contrario, i topi sono più piccoli, più facili da mantenere, più economici e suscettibili di manipolazione genetica, il che li rende più adatti per le indagini meccanicistiche. In questo studio, abbiamo stabilito un modello murino con ipersensibilità alla tosse tramite inalazione continua di acido citrico (CA). Questo modello è semplice da utilizzare e produce risultati riproducibili, il che lo rende uno strumento prezioso per ulteriori studi sui meccanismi e sui potenziali nuovi trattamenti per la tosse cronica.

Introduzione

La tosse è un riflesso difensivo cruciale che aiuta a eliminare le secrezioni respiratorie o i materiali estranei dalle vie aeree. Tuttavia, è anche uno dei sintomi più comuni di molte malattie respiratorie, che spesso spinge i pazienti a rivolgersi a un medico¹. La tosse cronica, definita come una tosse persistente che dura più di 8 settimane negli adulti, ha un impatto significativo sulla qualità della vita, causando problemi come incontinenza, insonnia, reflusso e altre esperienze spiacevoli, insieme a un notevole onere economico ^2,3,4. È opinione diffusa che l'aumento della sensibilità alla tosse sia un segno fisiopatologico della tosse cronica, in cui bassi livelli di irritanti termici, meccanici e chimici possono scatenare la tosse⁵. L'ipersensibilità alla tosse è associata all'infiammazione delle vie aeree⁶, al rimodellamento dei nervi sensoriali delle vie aeree⁷ e alle alterazioni del sistema nervoso centrale⁸, sebbene i precisi meccanismi molecolari rimangano poco chiari e richiedano ulteriori chiarimenti attraverso modelli animali adeguati.

Vari animali, tra cui porcellini d'India, gatti, conigli, cani e maiali, sono stati utilizzati per studiare i meccanismi della tosse⁹. I porcellini d'India sono stati tradizionalmente riconosciuti come il modello più adatto per studiare i meccanismi della tosse e l'efficacia dei farmaci antitosse 9,10,11,12. Tuttavia, questi modelli hanno diverse limitazioni sperimentali, tra cui costi elevati, mancanza di strumenti transgenici e scarsità di reagenti commerciali. Inoltre, i porcellini d'india mostrano spesso una scarsa tolleranza ambientale e un'elevata mortalità quando esposti agli stimoli. Al contrario, i topi sono più piccoli, più facili da mantenere, più economici e suscettibili di manipolazione genetica, il che li rende più adatti per le indagini meccanicistiche. Precedenti studi su modelli di tosse si sono concentrati principalmente sulla tosse indotta dall'infiammazione delle vie aeree, utilizzata principalmente per valutare l'efficacia dei farmaci antitosse e dei meccanismi periferici^13,14. Attualmente mancano modelli animali per l'ipersensibilità alla tosse.

In risposta, introduciamo un metodo per stabilire un modello murino di ipersensibilità alla tosse attraverso l'inalazione continua di acido citrico (CA). Questo modello è più semplice, più facile da costruire e più fattibile rispetto ad altri modelli animali.

Protocollo

Tutte le procedure di sperimentazione animale sono state approvate dal Comitato Etico degli Animali da Laboratorio del Primo Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina di Guangzhou (20230656). In questo studio sono stati utilizzati topi maschi adulti C57BL/6 privi di patogeni specifici, di età compresa tra 8 e 10 settimane e del peso di 20-25 g. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del reagente chimico

1. Preparazione della soluzione di acido citrico (CA)
   1. Per la valutazione della tosse, preparare una soluzione 0,4 M sciogliendo 3,84 g di polvere di acido citrico in soluzione fisiologica normale fino a un volume finale di 50 ml.
   2. Per il trattamento degli animali, preparare una soluzione 0,1 M sciogliendo 9,6 g di polvere di acido citrico in soluzione fisiologica normale fino a un volume finale di 500 ml.
2. Preparazione della soluzione di capsaicina
   1. Sciogliere 30,5 mg di capsaicina in polvere in PBS contenente il 10% di etanolo e il 10% di Tween-80 per ottenere una soluzione madre da 10 mM.
   2. Diluire la soluzione madre 1:100 in soluzione fisiologica normale per ottenere una soluzione di lavoro di 100 μM.
3. Preparazione della soluzione di metacolina
   1. Sciogliere 100 mg di polvere di metacolina in PBS fino a un volume finale di 2 mL per ottenere una soluzione da 50 mg/mL.
   2. Diluire questa soluzione con PBS per ottenere concentrazioni di 25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 6,25 mg/mL e 3,125 mg/mL.

2. Preparazione degli animali

1. Condizioni abitative
   1. Topi domestici in gabbie con libero accesso a cibo e acqua, mantenuti a una temperatura di 22 ± 1 °C con un ciclo standard di luce/buio di 12 ore. Le manipolazioni sperimentali sono state eseguite dopo 1 settimana di acclimatazione all'ambiente di alimentazione.
2. Acclimatazione
   1. Lasciare che i topi si acclimatino all'ambiente di alimentazione per 1 settimana prima di condurre manipolazioni sperimentali.

3. Sviluppo del modello

1. Assegnazione di gruppo
   1. Dividi casualmente i topi in un gruppo modello e un gruppo di controllo, con 8 topi in ogni gruppo.
2. Configurazione dell'esposizione
   1. Posizionare i topi in due camere indipendenti (come mostrato nella Figura 1), ciascuna collegata a un nebulizzatore a ultrasuoni.
   2. Esporre il gruppo modello a 0,1 M di aerosol di acido citrico (CA) e il gruppo di controllo a 0,9% di aerosol di soluzione salina normale (NS) a una velocità di atomizzazione di 3 ml/min per 2 ore al giorno per 2 settimane (come mostrato nella Figura 2). Rimetti i topi nelle loro gabbie dopo ogni esposizione.
3. Valutazione della sensibilità alla tosse
   1. Dopo l'ultima esposizione, valutare la sensibilità alla tosse valutando la tosse riflessiva (provocata con NS, CA (0,4 M) e capsaicina (100 μM)) e la tosse spontanea (senza alcuna provocazione).
      NOTA: per monitorare i cambiamenti dinamici nella sensibilità alla tosse durante lo sviluppo del modello, valutare la sensibilità alla tosse nei giorni 0, 3, 7 e 10 utilizzando una verifica CA (0,4 M).

4. Valutazione della sensibilità alla tosse

1. Preparazione dello strumento
   1. Utilizzare un sistema di pletismografia di tutto il corpo (WBP) non invasivo per misurare la sensibilità alla tosse. Collegare le camere, i trasduttori di flusso, il flusso di polarizzazione e altri componenti secondo il manuale dell'applicazione (vedere la tabella dei materiali).
   2. Eseguire un processo di calibrazione per garantire misurazioni accurate facendo clic sul pulsante Calibra. Una schermata di stato visualizzerà l'avanzamento e, una volta che la barra di stato raggiunge il 100%, la calibrazione è completa.
2. Rilevamento della tosse
   1. Crea uno studio della tosse per i topi e configura i parametri per 1 minuto di acclimatazione, 10 minuti di tempo di risposta e 10 minuti di erogazione della soluzione chimica.
   2. Posiziona i topi coscienti in camere individuali, assicurandoti che ci sia un solo topo per camera.
      NOTA: Assicurati che il mouse sia completamente all'interno della camera prima di chiudere il coperchio per evitare di danneggiare la coda e le dita.
   3. Aggiungere 1 mL di soluzioni chimiche (NS, CA o capsaicina) al nebulizzatore.
      NOTA: Il numero di eventi di tosse, ciascuno composto da tre fasi: inspiratoria, compressiva ed espulsiva¹⁵ (come mostrato nella Figura 3), verrà registrato una volta iniziato lo studio. Dopo 10 minuti di registrazione, il rilevamento della tosse sarà completo. Pulire la camera dopo aver rilevato ogni animale per evitare la contaminazione incrociata.

5. Misurazione dell'iperreattività delle vie aeree (AHR)

1. Preparazione dello strumento
   1. Preparare gli strumenti come descritto al punto 4.1.
2. Misurazione AHR
   1. Creare uno studio dose-risposta per i topi, configurando i tipi di misurazione, i parametri e la sequenza delle attività: 1 minuto per l'acclimatazione, 30 secondi per l'erogazione della soluzione di metacolina, 3 minuti per il tempo di risposta e 1 minuto per il recupero.
   2. Posiziona i topi coscienti in camere individuali, assicurandoti che ci sia un solo topo per camera.
   3. Aggiungere 50 μl di soluzioni chimiche (PBS o metacolina) al nebulizzatore e iniziare lo studio.
   4. Registrare il valore di Penh, un indicatore di broncocostrizione, in risposta a diverse concentrazioni di metacolina (0 mg/mL, 3,125 mg/mL, 6,25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL).

6. Raccolta del lavaggio broncoalveolare

1. Sacrificio
   1. Sacrificare i topi usando l'iperanestesia con pentobarbital sodico (50 mg/kg) somministrato tramite iniezione intraperitoneale (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
2. Raccolta campioni
   1. Raccogliere il sangue dal seno orbitale del topo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, quindi posizionare la provetta sul ghiaccio. Centrifugare il sangue a 3000 x g per 10 min a 4°C. Utilizzare una pipetta per raccogliere il surnatante, aliquotarlo e conservarlo a -80 °C.
   2. Raccogliere il liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) aprendo il torace per esporre la trachea, inserendo un ago a permanenza da 22 G nella trachea, quindi lavando tre volte con 0,5 ml di PBS pre-raffreddato e raccogliendo il fluido.
   3. Dopo la raccolta, centrifugare il BALF a 500 x g per 10 minuti a 4 °C. Raccogliere il surnatante, aliquotarlo e conservarlo a -80 °C. Risospendere il pellet in 100 μL di PBS e preparare gli strisci cellulari per ulteriori analisi.
   4. Raccogliere i tessuti polmonari aprendo il torace per esporre i polmoni, rimuovendo i tessuti polmonari e inserendoli in fiale criogeniche. Conservare i flaconcini a -80 °C per studi futuri.

7. RT-PCR quantitativa

1. Estrarre l'RNA totale dal tessuto polmonare utilizzando il reagente TRIzol. Eseguire la sintesi del cDNA utilizzando un kit di sintesi del cDNA del primo filamento, seguendo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali).
2. Conduci la PCR in un sistema di rilevamento PCR quantitativo in tempo reale utilizzando la fluorescenza verde SYBR. Normalizzare la quantificazione dell'espressione relativa dell'mRNA SP e CGRP rispetto all'espressione di β-actina⁹.

8. Analisi statistica

1. Utilizzare un test t per confrontare i dati tra due gruppi, considerando P ±< 0,05 come statisticamente significativi. Conduci tutte le analisi statistiche utilizzando software statistici e grafici.

Risultati

Come mostrato nella Figura 4A, la sensibilità alla tosse nel gruppo modello (gruppo CA) è aumentata significativamente dopo 1 settimana di esposizione rispetto al gruppo di controllo (gruppo NS) e questa maggiore sensibilità è persistita per tutto il periodo di esposizione. Né il gruppo di controllo né i topi del gruppo modello hanno sperimentato mortalità durante il processo di modellazione (Figura 4B). La Figur...

Discussione

Questo studio ha stabilito con successo un modello murino con ipersensibilità alla tosse attraverso l'inalazione continua di acido citrico (CA). Questo modello ha dimostrato un aumento affidabile della sensibilità alla tosse sia per la tosse spontanea che per la tosse riflessiva suscitata dall'acido citrico e dalla capsaicina. L'acido citrico e la capsaicina sono ampiamente utilizzati per valutare la sensibilità al riflesso della tosse

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% normal saline	Biosharp	BL158A
Capsaicin	Cayman chemical	92350
Citric Acid	Sigma-Aldrich	C2404
Ethanol	Guangzhou chemical reagent factory	GSHB15-AR-0.5L
First-strand cDNA synthesis kit	TransGen Biotech	AT341
Methacholine	Sigma-Aldrich	A2251
Non-invasive whole-body plethysmography (WBP) system	DSI	601-1400-001
Pentobarbital sodium	Merk	P3761
PerfectStart Green qPCR SuperMix	TransGen Biotech	AQ601
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Meilunbio	MA0015
Real-time quantitative PCR detecting system	Bio-rad	CFX  Connect
TRIzol reagent	Invitrogen	15596026CN
Tween-80	Solarbio	T8360-100
Ultrasonic nebulizer	Yuwell	402AI