Estabelecimento de um modelo de camundongo com hipersensibilidade à tosse por inalação de ácido cítrico

Resumo

Este protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo de camundongo com hipersensibilidade à tosse, que pode servir como um modelo ideal para estudar os mecanismos da tosse crônica.

Resumo

A tosse é um dos sintomas mais comuns de muitas doenças respiratórias. A tosse crônica afeta significativamente a qualidade de vida e impõe um ônus econômico considerável. O aumento da sensibilidade à tosse é uma característica fisiopatológica da tosse crônica. Observou-se que a hipersensibilidade à tosse está relacionada à inflamação das vias aéreas, remodelamento dos nervos sensoriais das vias aéreas e alterações no sistema nervoso central. No entanto, os mecanismos moleculares precisos permanecem obscuros e requerem mais elucidação usando modelos animais adequados. Estudos anteriores utilizaram cobaias como modelos para estudar a tosse, mas esses modelos apresentam várias limitações experimentais, incluindo altos custos, falta de ferramentas transgênicas e escassez de reagentes comerciais. Além disso, os porquinhos-da-índia geralmente exibem baixa tolerância ambiental e alta mortalidade quando expostos a estímulos. Em contraste, os camundongos são menores, mais fáceis de manter, mais econômicos e passíveis de manipulação genética, tornando-os mais adequados para investigações mecanicistas. Neste estudo, estabelecemos um modelo de camundongo com hipersensibilidade à tosse por inalação contínua de ácido cítrico (CA). Este modelo é simples de operar e produz resultados reprodutíveis, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos adicionais sobre os mecanismos e potenciais novos tratamentos para a tosse crônica.

Introdução

A tosse é um reflexo defensivo crucial que ajuda a limpar secreções respiratórias ou materiais estranhos das vias aéreas. No entanto, é também um dos sintomas mais comuns de muitas doenças respiratórias, muitas vezes levando os pacientes a procurar atendimento médico¹. A tosse crônica, definida como uma tosse persistente com duração superior a 8 semanas em adultos, afeta significativamente a qualidade de vida, causando problemas como incontinência, insônia, refluxo e outras experiências desagradáveis, além de um ônus econômico substancial ^2,3,4. Acredita-se amplamente que o aumento da sensibilidade à tosse é uma característica fisiopatológica da tosse crônica, onde baixos níveis de irritantes térmicos, mecânicos e químicos podem desencadear a tosse⁵. A hipersensibilidade à tosse está associada à inflamação das vias aéreas⁶, remodelação dos nervos sensoriais das vias aéreas⁷ e alterações no sistema nervoso central⁸, embora os mecanismos moleculares precisos permaneçam obscuros e exijam maior elucidação por meio de modelos animais adequados.

Vários animais, incluindo porquinhos-da-índia, gatos, coelhos, cães e porcos, têm sido usados para estudar os mecanismos da tosse⁹. As cobaias têm sido tradicionalmente reconhecidas como o modelo mais adequado para estudar os mecanismos da tosse e a eficácia das drogas antitússicas 9,10,11,12. No entanto, esses modelos têm várias limitações experimentais, incluindo altos custos, falta de ferramentas transgênicas e escassez de reagentes comerciais. Além disso, os porquinhos-da-índia geralmente exibem baixa tolerância ambiental e alta mortalidade quando expostos a estímulos. Em contraste, os camundongos são menores, mais fáceis de manter, mais econômicos e passíveis de manipulação genética, tornando-os mais adequados para investigações mecanicistas. Estudos anteriores sobre modelos de tosse se concentraram principalmente na tosse induzida por inflamação das vias aéreas, usada principalmente para avaliar a eficácia de drogas antitússicas e mecanismos periféricos^13,14. Atualmente, faltam modelos animais para hipersensibilidade à tosse.

Em resposta, introduzimos um método para estabelecer um modelo de camundongo de hipersensibilidade à tosse por inalação contínua de ácido cítrico (CA). Este modelo é mais simples, mais fácil de construir e mais viável em comparação com outros modelos animais.

Protocolo

Todos os procedimentos de experimentação animal foram aprovados pelo Comitê de Ética em Animais de Laboratório do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Guangzhou (20230656). Camundongos C57BL/6 adultos machos livres de patógenos específicos, com idade entre 8 e 10 semanas e pesando 20 a 25 g, foram usados neste estudo. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de reagentes químicos

1. Preparação da solução de ácido cítrico (CA)
   1. Para avaliação da tosse, prepare uma solução 0,4 M dissolvendo 3,84 g de ácido cítrico em pó em solução salina normal até um volume final de 50 mL.
   2. Para o tratamento animal, prepare uma solução 0,1 M dissolvendo 9,6 g de ácido cítrico em pó em solução salina normal até um volume final de 500 mL.
2. Preparação da solução de capsaicina
   1. Dissolva 30,5 mg de pó de capsaicina em PBS contendo 10% de etanol e 10% de Tween-80 para fazer uma solução estoque de 10 mM.
   2. Dilua a solução estoque 1:100 em solução salina normal para fazer uma solução de trabalho de 100 μM.
3. Preparação da solução de metacolina
   1. Dissolva 100 mg de metacolina em pó em PBS até um volume final de 2 mL para fazer uma solução de 50 mg / mL.
   2. Dilua esta solução com PBS para obter concentrações de 25 mg / mL, 12,5 mg / mL, 6,25 mg / mL e 3,125 mg / mL.

2. Preparação animal

1. Condições de moradia
   1. Ratos domésticos em gaiolas com livre acesso a comida e água, mantidos a uma temperatura de 22 ± 1 °C com um ciclo padrão de 12 horas claro/escuro. As manipulações experimentais foram realizadas após 1 semana de aclimatação ao ambiente alimentar.
2. Aclimatação
   1. Permita que os ratos se aclimatem ao ambiente de alimentação por 1 semana antes de realizar manipulações experimentais.

3. Desenvolvimento do modelo

1. Atribuição em grupo
   1. Divida aleatoriamente os camundongos em um grupo modelo e um grupo controle, com 8 camundongos em cada grupo.
2. Configuração de exposição
   1. Coloque os camundongos em duas câmaras independentes (conforme mostrado na Figura 1), cada uma conectada a um nebulizador ultrassônico.
   2. Exponha o grupo modelo ao aerossol de ácido cítrico (CA) 0,1 M e o grupo controle ao aerossol de solução salina normal (NS) a 0,9% a uma taxa de atomização de 3 mL / min por 2 h por dia durante 2 semanas (conforme mostrado na Figura 2). Devolva os ratos às suas gaiolas após cada exposição.
3. Avaliação da sensibilidade à tosse
   1. Após a última exposição, avalie a sensibilidade à tosse avaliando a tosse reflexa (desafiada com SN, CA (0,4 M) e capsaicina (100 μM)) e tosse espontânea (sem qualquer desafio).
      NOTA: Para monitorar as mudanças dinâmicas na sensibilidade à tosse durante o desenvolvimento do modelo, avalie a sensibilidade à tosse nos dias 0, 3, 7 e 10 usando um desafio CA (0,4 M).

4. Avaliação da sensibilidade à tosse

1. Preparação do instrumento
   1. Use um sistema não invasivo de pletismografia de corpo inteiro (WBP) para medir a sensibilidade à tosse. Conecte as câmaras, transdutores de fluxo, fluxo de polarização e outros componentes de acordo com o manual de aplicação (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Execute um processo de calibração para garantir medições precisas clicando no botão Calibrar . Uma tela de status exibirá o progresso e, quando a barra de status atingir 100%, a calibração estará concluída.
2. Detecção de tosse
   1. Crie um estudo de tosse para camundongos e configure os parâmetros para 1 minuto de aclimatação, 10 minutos de tempo de resposta e 10 minutos de administração de solução química.
   2. Coloque os ratos conscientes em câmaras individuais, garantindo que haja apenas um rato por câmara.
      NOTA: Certifique-se de que o mouse esteja completamente dentro da câmara antes de fechar a tampa para evitar danificar sua cauda e dedos.
   3. Adicione 1 mL das soluções químicas (NS, CA ou capsaicina) ao nebulizador.
      NOTA: O número de eventos de tosse - cada um consistindo em três fases: inspiratória, compressiva e expulsiva¹⁵ (conforme mostrado na Figura 3) - será registrado assim que o estudo começar. Após 10 minutos de gravação, a detecção da tosse estará completa. Limpe a câmara após detectar cada animal para evitar contaminação cruzada.

5. Medição da hiperresponsividade das vias aéreas (AHR)

1. Preparação do instrumento
   1. Prepare os instrumentos conforme descrito na etapa 4.1.
2. Medição de AHR
   1. Crie um estudo dose-resposta para camundongos, configurando os tipos de medição, parâmetros e sequência de tarefas: 1 min para aclimatação, 30 s para entrega de solução de metacolina, 3 min para tempo de resposta e 1 min para recuperação.
   2. Coloque os ratos conscientes em câmaras individuais, garantindo que haja apenas um rato por câmara.
   3. Adicione 50 μL das soluções químicas (PBS ou metacolina) ao nebulizador e inicie o estudo.
   4. Registre o valor de Penh, um indicador de broncoconstrição, em resposta a diferentes concentrações de metacolina (0 mg / mL, 3,125 mg / mL, 6,25 mg / mL, 12,5 mg / mL, 25 mg / mL, 50 mg / mL).

6. Coleta de lavado broncoalveolar

1. Sacrifício
   1. Sacrifique os camundongos usando hiperanestesia com pentobarbital sódico (50 mg / kg) administrado por injeção intraperitoneal (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
2. Coleta de amostras
   1. Colete sangue do seio orbital do camundongo em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e coloque o tubo no gelo. Centrifugue o sangue a 3000 x g por 10 min a 4 ° C. Utilizar uma pipeta para recolher o sobrenadante, alíquota e armazená-lo a -80 °C.
   2. Colete o fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) abrindo o tórax para expor a traqueia, inserindo uma agulha de demora de 22 G na traqueia, lavando-a três vezes com 0,5 mL de PBS pré-resfriado e coletando o fluido.
   3. Após a colheita, centrifugar o LBA a 500 x g durante 10 min a 4 °C. Recolher o sobrenadante, alíquota e armazená-lo a -80 °C. Ressuspenda o pellet em 100 μL de PBS e prepare esfregaços celulares para análise posterior.
   4. Colete tecidos pulmonares abrindo o tórax para expor os pulmões, removendo os tecidos pulmonares e colocando-os em frascos criogênicos. Conservar os frascos para injetáveis a -80 °C para estudos futuros.

7. RT-PCR quantitativo

1. Extraia o RNA total do tecido pulmonar usando o reagente TRIzol. Realize a síntese de cDNA usando um kit de síntese de cDNA de primeira fita, seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
2. Realize PCR em um sistema de detecção de PCR quantitativo em tempo real usando fluorescência verde SYBR. Normalize a quantificação da expressão relativa de mRNA de SP e CGRP para a expressão de β-Actina⁹.

8. Análise estatística

1. Apresentar os dados como média ± EPM. Utilizar o teste t para comparar os dados entre dois grupos, considerando P < 0,05 como estatisticamente significativo. Realize todas as análises estatísticas usando software estatístico e gráfico.

Resultados

Conforme mostrado na Figura 4A, a sensibilidade à tosse no grupo modelo (grupo CA) aumentou significativamente após 1 semana de exposição em comparação com o grupo controle (grupo NS), e essa sensibilidade aumentada persistiu durante todo o período de exposição. Nem o grupo controle nem os camundongos do grupo modelo experimentaram mortalidade durante o processo de modelagem (Figura 4B). A Figura 4C e ...

Discussão

Este estudo estabeleceu com sucesso um modelo de camundongo com hipersensibilidade à tosse por inalação contínua de ácido cítrico (CA). Este modelo demonstrou um aumento confiável na sensibilidade à tosse tanto para tosse espontânea quanto para tosses reflexivas provocadas por ácido cítrico e capsaicina. O ácido cítrico e a capsaicina são amplamente utilizados para avaliar a sensibilidade ao reflexo da tosse¹⁶.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% normal saline	Biosharp	BL158A
Capsaicin	Cayman chemical	92350
Citric Acid	Sigma-Aldrich	C2404
Ethanol	Guangzhou chemical reagent factory	GSHB15-AR-0.5L
First-strand cDNA synthesis kit	TransGen Biotech	AT341
Methacholine	Sigma-Aldrich	A2251
Non-invasive whole-body plethysmography (WBP) system	DSI	601-1400-001
Pentobarbital sodium	Merk	P3761
PerfectStart Green qPCR SuperMix	TransGen Biotech	AQ601
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Meilunbio	MA0015
Real-time quantitative PCR detecting system	Bio-rad	CFX  Connect
TRIzol reagent	Invitrogen	15596026CN
Tween-80	Solarbio	T8360-100
Ultrasonic nebulizer	Yuwell	402AI