Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר פיתוח של מודל עכבר עם רגישות יתר לשיעול, שיכול לשמש מודל אידיאלי לחקר מנגנוני השיעול הכרוני.

Abstract

שיעול הוא אחד התסמינים השכיחים ביותר של מחלות נשימה רבות. שיעול כרוני משפיע באופן משמעותי על איכות החיים ומטיל נטל כלכלי ניכר. רגישות מוגברת לשיעול היא סימן היכר פתופיזיולוגי של שיעול כרוני. נצפה כי רגישות יתר לשיעול קשורה לדלקת בדרכי הנשימה, עיצוב מחדש של עצבים תחושתיים בדרכי הנשימה ושינויים במערכת העצבים המרכזית. עם זאת, המנגנונים המולקולריים המדויקים נותרו לא ברורים ודורשים הבהרה נוספת באמצעות מודלים מתאימים של בעלי חיים. מחקרים קודמים השתמשו בשרקנים כמודלים לחקר שיעול, אך מודלים אלה מציגים מספר מגבלות ניסיוניות, כולל עלויות גבוהות, מחסור בכלים טרנסגניים ומחסור בריאגנטים מסחריים. בנוסף, שרקנים בדרך כלל מפגינים סובלנות סביבתית ירודה ותמותה גבוהה כאשר הם נחשפים לגירויים. לעומת זאת, עכברים קטנים יותר, קלים יותר לתחזוקה, חסכוניים יותר וניתנים למניפולציה גנטית, מה שהופך אותם למתאימים יותר לחקירות מכניסטיות. במחקר זה, ביססנו מודל עכבר עם רגישות יתר לשיעול באמצעות שאיפה מתמשכת של חומצת לימון (CA). מודל זה פשוט לתפעול ומניב תוצאות הניתנות לשחזור, מה שהופך אותו לכלי רב ערך למחקרים נוספים על המנגנונים והטיפולים החדשים הפוטנציאליים לשיעול כרוני.

Introduction

שיעול הוא רפלקס הגנתי חיוני המסייע בפינוי הפרשות נשימה או חומרים זרים מדרכי הנשימה. עם זאת, זהו גם אחד התסמינים השכיחים ביותר של מחלות נשימה רבות, ולעתים קרובות גורם לחולים לפנות לטיפול רפואי1. שיעול כרוני, המוגדר כשיעול מתמשך הנמשך יותר מ-8 שבועות אצל מבוגרים, משפיע באופן משמעותי על איכות החיים, וגורם לבעיות כמו בריחת שתן, נדודי שינה, ריפלוקס וחוויות לא נעימות אחרות, יחד עם נטל כלכלי משמעותי 2,3,4. הדעה הרווחת היא שרגישות מוגברת לשיעול היא סימן היכר פתופיזיולוגי של שיעול כרוני, שבו רמות נמוכות של גירויים תרמיים, מכניים וכימיים עלולות לעורר שיעול5. רגישות יתר לשיעול קשורה לדלקת בדרכי הנשימה6, עיצוב מחדש של עצבי תחושת דרכי הנשימה7 ושינויים במערכת העצבים המרכזית8, אם כי המנגנונים המולקולריים המדויקים נותרים לא ברורים ודורשים הבהרה נוספת באמצעות מודלים מתאימים של בעלי חיים.

בעלי חיים שונים, כולל שרקנים, חתולים, ארנבות, כלבים וחזירים, שימשו לחקר מנגנוני השיעול9. שרקנים הוכרו באופן מסורתי כמודל המתאים ביותר לחקר מנגנוני שיעול ויעילותן של תרופות נוגדות שיעול 9,10,11,12. עם זאת, למודלים אלה יש מספר מגבלות ניסיוניות, כולל עלויות גבוהות, מחסור בכלים טרנסגניים ומחסור בריאגנטים מסחריים. בנוסף, שרקנים מפגינים לעתים קרובות סובלנות סביבתית ירודה ותמותה גבוהה כאשר הם נחשפים לגירויים. לעומת זאת, עכברים קטנים יותר, קלים יותר לתחזוקה, חסכוניים יותר וניתנים למניפולציה גנטית, מה שהופך אותם למתאימים יותר לחקירות מכניסטיות. מחקרים קודמים על מודלים של שיעול התמקדו בעיקר בשיעול הנגרם על ידי דלקת בדרכי הנשימה, המשמש בעיקר להערכת היעילות של תרופות נוגדות שיעול ומנגנונים היקפיים13,14. כיום חסרים מודלים של בעלי חיים לרגישות יתר לשיעול.

בתגובה, אנו מציגים שיטה לביסוס מודל עכברי של רגישות יתר לשיעול באמצעות שאיפה מתמשכת של חומצת לימון (CA). מודל זה פשוט יותר, קל יותר לבנייה ואפשרי יותר בהשוואה למודלים אחרים של בעלי חיים.

Protocol

כל הליכי הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של חיות מעבדה של בית החולים המסונף הראשון של האוניברסיטה הרפואית גואנגג'ואו (20230656). במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6 זכרים בוגרים ללא פתוגן ספציפי, בגילאי 8-10 שבועות ובמשקל 20-25 גרם. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת ריאגנטים כימיים

  1. הכנת תמיסת חומצת לימון (CA).
    1. להערכת שיעול, הכינו תמיסה של 0.4 M על ידי המסת 3.84 גרם אבקת חומצת לימון במי מלח רגילים לנפח סופי של 50 מ"ל.
    2. לטיפול בבעלי חיים, הכינו תמיסה של 0.1 M על ידי המסת 9.6 גרם אבקת חומצת לימון במי מלח רגילים לנפח סופי של 500 מ"ל.
  2. הכנת תמיסת קפסאיצין
    1. יש להמיס 30.5 מ"ג של אבקת קפסאיצין ב-PBS המכיל 10% אתנול ו-10% טווין-80 כדי ליצור תמיסת מלאי של 10 מ"מ.
    2. יש לדלל את תמיסת המלאי ביחס של 1:100 במי מלח רגילים כדי ליצור תמיסת עבודה של 100 מיקרומטר.
  3. הכנת תמיסת מתכולין
    1. ממיסים 100 מ"ג אבקת מתכולין ב-PBS לנפח סופי של 2 מ"ל כדי ליצור תמיסה של 50 מ"ג/מ"ל.
    2. יש לדלל תמיסה זו עם PBS כדי לקבל ריכוזים של 25 מ"ג/מ"ל, 12.5 מ"ג/מ"ל, 6.25 מ"ג/מ"ל ו-3.125 מ"ג/מ"ל.

2. הכנת בעלי חיים

  1. תנאי דיור
    1. עכברי בית בכלובים עם גישה חופשית למזון ומים, נשמרים בטמפרטורה של 22 ± 1 מעלות צלזיוס עם מחזור אור/חושך סטנדרטי של 12 שעות. מניפולציות ניסיוניות בוצעו לאחר שבוע של הסתגלות לסביבת האכילה.
  2. התאקלמות
    1. אפשר לעכברים להתאקלם בסביבת ההאכלה במשך שבוע לפני ביצוע מניפולציות ניסיוניות.

3. פיתוח המודל

  1. הקצאה קבוצתית
    1. חלקו את העכברים באופן אקראי לקבוצת מודל וקבוצת ביקורת, עם 8 עכברים בכל קבוצה.
  2. הגדרת חשיפה
    1. הנח את העכברים בשני תאים עצמאיים (כפי שמוצג באיור 1), כל אחד מחובר לנבולייזר קולי.
    2. חשוף את קבוצת המודל לתרסיס חומצת לימון (CA) של 0.1 M ואת קבוצת הביקורת לתרסיס של 0.9% תמיסת מלח (NS) רגילה בקצב אטומיזציה של 3 מ"ל/דקה למשך שעתיים ביום במשך שבועיים (כפי שמוצג באיור 2). החזירו את העכברים לכלובים שלהם לאחר כל חשיפה.
  3. הערכת רגישות לשיעול
    1. לאחר החשיפה האחרונה, העריכו את הרגישות לשיעול על ידי הערכת שיעול רפלקסיבי (מאותגר עם NS, CA (0.4 M) וקפסאיצין (100 מיקרומטר)) ושיעול ספונטני (ללא כל אתגר).
      הערה: כדי לעקוב אחר שינויים דינמיים ברגישות לשיעול במהלך פיתוח המודל, הערך את הרגישות לשיעול בימים 0, 3, 7 ו-10 באמצעות אתגר CA (0.4 M).

4. הערכת רגישות לשיעול

  1. הכנת מכשירים
    1. השתמש במערכת פלתיסמוגרפיה לא פולשנית של כל הגוף (WBP) כדי למדוד רגישות לשיעול. חבר את התאים, מתמרי הזרימה, זרימת ההטיה ורכיבים אחרים בהתאם למדריך היישום (ראה טבלת חומרים).
    2. בצע תהליך כיול כדי להבטיח מדידות מדויקות על ידי לחיצה על כפתור הכיול . מסך סטטוס יציג את ההתקדמות, וברגע ששורת המצב תגיע ל-100%, הכיול הושלם.
  2. זיהוי שיעול
    1. צור מחקר שיעול לעכברים והגדר את הפרמטרים לדקה אחת של התאקלמות, 10 דקות של זמן תגובה ו-10 דקות של אספקת תמיסה כימית.
    2. הנח את העכברים המודעים לתאים בודדים, וודא שיש רק עכבר אחד בכל תא.
      הערה: ודא שהעכבר נמצא לחלוטין בתוך החדר לפני סגירת המכסה כדי למנוע נזק לזנב ולאצבעות שלו.
    3. הוסף 1 מ"ל של התמיסות הכימיות (NS, CA או קפסאיצין) לנבולייזר.
      הערה: מספר אירועי השיעול - כל אחד מורכב משלושה שלבים: שאיפה דחיסה וגירוש15 (כפי שמוצג באיור 3) - יירשם עם תחילת המחקר. לאחר 10 דקות של הקלטה, זיהוי השיעול יושלם. נקה את החדר לאחר זיהוי כל בעל חיים כדי למנוע זיהום צולב.

5. מדידת תגובתיות יתר של דרכי הנשימה (AHR).

  1. הכנת מכשירים
    1. הכן מכשירים כמתואר בשלב 4.1.
  2. מדידת AHR
    1. צור מחקר מינון-תגובה לעכברים, הגדרת סוגי המדידה, הפרמטרים ורצף המשימות: דקה אחת להתאקלמות, 30 שניות למתן תמיסת מתכולין, 3 דקות לזמן תגובה ודקה אחת להתאוששות.
    2. הנח את העכברים המודעים לתאים בודדים, וודא שיש רק עכבר אחד בכל תא.
    3. הוסף 50 מיקרוליטר של התמיסות הכימיות (PBS או מתכולין) לנבולייזר והתחל את המחקר.
    4. רשום את הערך של Penh, אינדיקטור להתכווצות הסימפונות, בתגובה לריכוזים שונים של מתכולין (0 מ"ג/מ"ל, 3.125 מ"ג/מ"ל, 6.25 מ"ג/מ"ל, 12.5 מ"ג/מ"ל, 25 מ"ג/מ"ל, 50 מ"ג/מ"ל).

6. אוסף שטיפת הסימפונות

  1. להקריב
    1. להקריב את העכברים באמצעות הרדמה יתר עם נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג) הניתן באמצעות הזרקה תוך צפקית (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד).
  2. איסוף דוגמאות
    1. אסוף דם מהסינוס האורביטלי של העכבר לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, ואז הנח את הצינור על קרח. צנטריפוגה בדם ב-3000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השתמש בפיפטה כדי לאסוף את הסופרנטנט, לחתוך אותו ולאחסן אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    2. אסוף נוזל שטיפת סימפונות (BALF) על ידי פתיחת בית החזה כדי לחשוף את קנה הנשימה, החדרת מחט שוכנת 22 גרם לקנה הנשימה, ולאחר מכן שטיפה שלוש פעמים עם 0.5 מ"ל PBS מקורר מראש ואיסוף הנוזל.
    3. לאחר האיסוף, צנטריפוגה את ה-BALF ב-500 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. אוספים את הסופרנטנט, מחסנים אותו ומאחסנים אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של PBS והכינו מריחות תאים לניתוח נוסף.
    4. אסוף רקמות ריאה על ידי פתיחת בית החזה כדי לחשוף את הריאות, הסרת רקמות הריאה והנחתן בבקבוקונים קריוגניים. אחסן את הבקבוקונים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למחקרים עתידיים.

7. RT-PCR כמותי

  1. חלץ את סך ה-RNA מרקמת הריאה באמצעות מגיב TRIzol. בצע סינתזת cDNA באמצעות ערכת סינתזת cDNA גדיל ראשון, בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
  2. לבצע PCR במערכת זיהוי PCR כמותית בזמן אמת באמצעות פלואורסצנטיות ירוקה SYBR. לנרמל את הכימות של ביטוי mRNA יחסי של SP ו-CGRP לביטוי של β-Actin9.

8. ניתוח סטטיסטי

  1. הצג נתונים כממוצע ± SEM. השתמש במבחן t כדי להשוות נתונים בין שתי קבוצות, תוך התחשבות ב-P < 0.05 כמובהקת סטטיסטית. לבצע את כל הניתוחים הסטטיסטיים באמצעות תוכנות סטטיסטיות וגרפיות.

תוצאות

כפי שמוצג באיור 4A, הרגישות לשיעול בקבוצת המודל (קבוצת CA) עלתה באופן משמעותי לאחר שבוע אחד של חשיפה בהשוואה לקבוצת הביקורת (קבוצת NS), ורגישות מוגברת זו נמשכה לאורך כל תקופת החשיפה. לא קבוצת הביקורת ולא עכברי קבוצת המודל חוו תמותה במהלך תהליך המידול (

Discussion

מחקר זה ביסס בהצלחה מודל עכבר עם רגישות יתר לשיעול באמצעות שאיפה מתמשכת של חומצת לימון (CA). מודל זה הראה עלייה אמינה ברגישות לשיעול הן לשיעול ספונטני והן לשיעול רפלקסיבי הנגרם על ידי חומצת לימון וקפסאיצין. חומצת לימון וקפסאיצין נמצאים בשימוש נרחב להערכ?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC 82100034), פרויקט תכנון המדע והטכנולוגיה של גואנגג'ואו (202102010168).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% normal salineBiosharpBL158A
CapsaicinCayman chemical92350
Citric AcidSigma-AldrichC2404
EthanolGuangzhou chemical reagent factoryGSHB15-AR-0.5L
First-strand cDNA synthesis kitTransGen BiotechAT341
MethacholineSigma-AldrichA2251
Non-invasive whole-body plethysmography (WBP) systemDSI601-1400-001
Pentobarbital sodiumMerkP3761
PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen BiotechAQ601
Phosphate Buffered Saline (PBS)MeilunbioMA0015
Real-time quantitative PCR detecting systemBio-rad CFX  Connect
TRIzol reagentInvitrogen15596026CN
Tween-80SolarbioT8360-100
Ultrasonic nebulizerYuwell402AI

References

  1. Morice, A. H. Epidemiology of cough. Pulm Pharmacol Ther. 15 (3), 253-259 (2002).
  2. Lai, K., Long, L. Current status and future directions of chronic cough in China. Lung. 198 (1), 23-29 (2020).
  3. Zeiger, R. S., et al. Patient-reported burden of chronic cough in a managed care organization. J Allergy Clin Immunol Pract. 9 (4), 1624-1637.e10 (2021).
  4. Chamberlain, S. A., et al. The impact of chronic cough: A cross-sectional European survey. Lung. 193 (3), 401-408 (2015).
  5. Morice, A. H., et al. Expert opinion on the cough hypersensitivity syndrome in respiratory medicine. Eur Respir J. 44 (5), 1132-1148 (2014).
  6. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiol Rev. 96 (3), 975-1024 (2016).
  7. Shapiro, C. O., et al. Airway sensory nerve density is increased in chronic cough. Am J Respir Crit Care Med. 203 (3), 348-355 (2021).
  8. Ando, A., et al. Neural correlates of cough hypersensitivity in humans: Evidence for central sensitization and dysfunctional inhibitory control. Thorax. 71 (4), 323-329 (2016).
  9. Plevkova, J., et al. Animal models of cough. Respir Physiol Neurobiol. 290, 103656 (2021).
  10. Smith, J. A., Hilton, E. C. Y., Saulsberry, L., Canning, B. J. Antitussive effects of memantine in guinea pigs. Chest. 141 (4), 996-1002 (2012).
  11. Hewitt, M. M., et al. Pharmacology of bradykinin-evoked coughing in guinea pigs. J Pharmacol Exp Ther. 357 (3), 620-628 (2016).
  12. Zhong, S., et al. Antitussive activity of the Schisandra chinensis fruit polysaccharide (SCFP-1) in guinea pigs models. J Ethnopharmacol. 194, 378-385 (2016).
  13. Zhong, S., et al. Effects of Schisandra chinensis extracts on cough and pulmonary inflammation in a cough hypersensitivity guinea pig model induced by cigarette smoke exposure. J Ethnopharmacol. 165, 73-82 (2015).
  14. Wei, L., et al. Effects of Shiwei longdanhua formula on LPS-induced airway mucus hypersecretion, cough hypersensitivity, oxidative stress and pulmonary inflammation. Biomed Pharmacother. 163, 114793 (2023).
  15. Chen, L., Lai, K., Lomask, J. M., Jiang, B., Zhong, N. Detection of mouse cough based on sound monitoring and respiratory airflow waveforms. PLoS One. 8 (3), e59263 (2013).
  16. Gibson, P., et al. Treatment of unexplained chronic cough: Chest guideline and expert panel report. Chest. 149 (1), 27-44 (2016).
  17. Nakaji, H., et al. Airway remodeling associated with cough hypersensitivity as a consequence of persistent cough: An experimental study. Respir Investig. 54 (6), 419-427 (2016).
  18. Xu, X., et al. Association of cough hypersensitivity with tracheal trpv1 activation and neurogenic inflammation in a novel guinea pig model of citric acid-induced chronic cough. J Int Med Res. 46 (7), 2913-2924 (2018).
  19. Iwata, T., et al. Mechanical stimulation by postnasal drip evokes cough. PLoS One. 10 (11), e0141823 (2015).
  20. Chen, L., et al. Establishment of a mouse model with all four clinical features of eosinophilic bronchitis. Sci Rep. 10 (1), 10557 (2020).
  21. Zhang, C., Lin, R. L., Hong, J., Khosravi, M., Lee, L. Y. Cough and expiration reflexes elicited by inhaled irritant gases are intensified in ovalbumin-sensitized mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 312 (5), R718-R726 (2017).
  22. Amato, A., Becci, A., Beolchini, F. Citric acid bioproduction: The technological innovation change. Crit Rev Biotechnol. 40 (2), 199-212 (2020).
  23. Hu, W., Li, W. J., Yang, H. Q., Chen, J. H. Current strategies and future prospects for enhancing microbial production of citric acid. Appl Microbiol Biotechnol. 103 (1), 201-209 (2019).
  24. Morice, A. H., Kastelik, J. A., Thompson, R. Cough challenge in the assessment of cough reflex. Br J Clin Pharmacol. 52 (4), 365-375 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved