Comparación del acceso retroperitoneal transperitoneal y la punción percutánea para la degeneración discal lumbar en conejos

Resumen

Este protocolo comparó las punciones percutáneas y transretroperitoneales en un modelo de degeneración del disco intervertebral (IVDD) de conejo. Ambos métodos indujeron la IVDD; sin embargo, el abordaje transretroperitoneal produjo cambios más extensos y menor mortalidad.

Resumen

Este estudio compara la eficacia de dos métodos para inducir la degeneración del disco intervertebral (IVDD) en conejos: la punción percutánea y la punción transretroperitoneal del anillo fibroso. Quince conejos blancos machos sanos de Nueva Zelanda fueron asignados aleatoriamente a tres grupos: simulación, punción percutánea y punción transretroperitoneal. Se llevó a cabo una evaluación exhaustiva, que incluyó tasas de mortalidad, evaluaciones morfológicas e histológicas, imágenes radiológicas y análisis de biomarcadores, para garantizar una comparación precisa y detallada entre los dos métodos. Los resultados demuestran que ambas técnicas de punción indujeron con éxito la IVDD en el modelo de conejo. Sin embargo, el abordaje transretroperitoneal dio lugar a cambios degenerativos más pronunciados en los discos intervertebrales, manteniendo una tasa de mortalidad significativamente menor en comparación con el método percutáneo. Estos hallazgos ponen de manifiesto las ventajas del abordaje transretroperitoneal en el modelado de la IVDD. Este estudio proporciona información valiosa sobre el establecimiento de modelos de IVDD y sienta las bases para futuras investigaciones sobre estrategias de tratamiento efectivas para el dolor lumbar, mejorando en última instancia los resultados de los pacientes.

Introducción

En las últimas décadas, el dolor lumbar (LUMB) se ha convertido en el trastorno musculoesquelético más importante que afecta a la calidad de vida¹. El dolor lumbar se ha convertido en un problema de salud pública cada vez más importante, imponiendo una carga económica sustancial a la sociedad debido a la pérdida de mano de obra y los gastos médicos adicionales ^2,3. Solo en los Estados Unidos, los costos directos e indirectos asociados con el LBP superan los $100 mil millones anuales, incluidos los gastos médicos, las pérdidas de ingresos y las pérdidas laborales⁴. El dolor lumbar suele estar causado por la degeneración del disco intervertebral (IVDD)5,6,7,8. Dada la alta prevalencia y el impacto económico del dolor lumbar, el modelado preciso de la IVDD es crucial para explorar estrategias de tratamiento.

Para comprender la fisiopatología de la IVDD y evaluar las estrategias de tratamiento, se han desarrollado y utilizado varios modelos animales preclínicos in vivo ⁹. Se han empleado múltiples métodos en estos modelos para inducir la degeneración del disco, incluida la lesión quirúrgica o química del disco, el estrés mecánico no invasivo, la modificación genética y la ocurrencia natural¹⁰. Entre estos métodos, la lesión quirúrgica representa hasta el 64,9% de la inducción de IVDD, siendo la punción con aguja la principal técnica quirúrgica¹¹. El modelo de punción con aguja se caracteriza por su facilidad de establecimiento y el mínimo daño a los animales de experimentación. Los abordajes comunes de punción con aguja incluyen el acceso retroperitoneal abierto al espacio del disco lumbar y la punción posterolateral percutánea. La profundidad de inserción se puede determinar mediante monitorización radiográfica o la longitud de la aguja. En particular, el abordaje percutáneo puede reducir el daño tisular iatrogénico en comparación con los métodos quirúrgicos abiertos, mientras que el acceso retroperitoneal proporciona el beneficio de la visualización directa, características que no se han comparado cuantitativamente en la literatura previa. Si bien los estudios han investigado los efectos del uso de agujas de diferentes diámetros¹² y la punción de diferentes discos¹⁰ en la inducción de la IVDD, los estudios comparativos centrados en diferentes enfoques de punción con aguja siguen siendo limitados. El modelo de conejo seleccionado ofrece una utilidad particular para los investigadores que requieren estudios longitudinales rentables con evaluaciones de imagen frecuentes, dada su similitud anatómica con los discos humanos y sus ventajas sobre los modelos de roedores en términos de tamaño y estructura¹³.

En este estudio, se establecieron modelos de conejos de IVDD lumbar utilizando dos métodos: acceso retroperitoneal abierto para la punción del espacio del disco lumbar y punción posterolateral percutánea. Se analizó un conjunto completo de medidas de resultado, incluidos cambios morfológicos, histológicos y radiológicos.

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Protocolo

Los procedimientos experimentales con animales se adhirieron estrictamente a la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio emitida por los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité de Ética de Animales Experimentales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Número de aprobación de ética: 2021-23). Se utilizaron quince conejos blancos de Nueva Zelanda sanos, de 4 meses de edad y de grado limpio (2,25 kg ± 0,25 kg), incluidos siete machos y ocho hembras. Los animales fueron alojados en un ambiente con una temperatura ambiente de 23 °C ± 3 °C y una humedad de aproximadamente 60% ± 10% durante una semana de adaptación, con libre acceso a agua y alimento. Antes del experimento, los 15 conejos fueron asignados aleatoriamente a uno de tres grupos: el grupo simulado (Grupo A), el grupo de punción del anillo fibroso percutáneo (Grupo B) y el grupo de punción del anillo fibroso del espacio transretroperitoneal (Grupo C), con cinco conejos en cada grupo. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Establecimiento de un modelo de IVDD de conejo mediante punción percutánea del anillo fibroso

NOTA: El modelo de IVDD en conejo se estableció utilizando el método de punción percutánea del anillo fibroso. El procedimiento siguió el método de modelado de punción descrito por Luo TD et ^al.14 y se realizó bajo guía radiológica (Figura 1).

1. Prepara el conejo.
   1. Ayunar los conejos durante 24 horas antes de la cirugía, asegurando el acceso al agua.
   2. Administrar la anestesia mediante inyección intravenosa de pentobarbital sódico al 3% (1,3 mL/kg) en la vena del oído (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).
   3. Confirme el éxito de la anestesia comprobando si hay inmovilidad, músculos relajados, falta de reflejo corneal y ausencia de respuesta al dolor.
2. Coloca y marca al conejo.
   1. Fija al conejo en posición prona sobre una tabla de fijación.
   2. Afeita y prepara el área quirúrgica, luego palpa los puntos de referencia de los huesos.
   3. Acaricia los puntos de referencia óseos en la espalda lumbar del conejo. Ubica la costilla más baja del conejo, que generalmente corresponde a la vértebra justo encima de la apófisis espinosa L1.
   4. Identifique la apófisis espinosa inmediatamente debajo de esta vértebra para determinar la apófisis espinosa L1.
   5. Localiza los puntos más altos de las crestas ilíacas, aproximadamente al nivel de la vértebra L6.
   6. Traza desde la apófisis espinosa L1 para identificar secuencialmente cada apófisis espinosa hasta L7.
   7. Usa un rotulador para marcar claramente la apófisis espinosa L1 en el lomo del conejo.
   8. Pasa a la siguiente apófisis espinosa y márcala como L2.
   9. Continúe marcando cada proceso espinoso subsiguiente como L3, L4, L5, L6 y L7. Asegúrese de que cada marca sea distinta y esté en orden secuencial para una identificación clara.
3. Localice y marque el sitio de la punción.
   1. Palpa las apófisis transversas y localiza el punto medio entre los extremos distales de L5 y L6.
   2. Marque este punto y prepárese para insertar la aguja de punción aproximadamente 1 cm por encima de él.
4. Inserte la aguja de punción.
   1. Sostenga la aguja de punción horizontalmente e insértela hacia el suelo, rompiendo la piel.
   2. Avance la aguja hasta llegar al cuerpo vertebral L4 y verifique la posición correcta bajo la guía de rayos X.
   3. Incline la aguja ligeramente cefálica en un ángulo de aproximadamente 20° hacia el disco intervertebral L4-5. Perfore el disco y confirme la precisión de la punción bajo un examen de rayos X.
5. Realizar pinchazos de disco.
   1. Punción precisa del anillo fibroso, utilizando la guía de rayos X si es necesario.
   2. Repita el proceso de punción para los discos intervertebrales L2-3 y L3-4, perforando cada uno una vez.
   3. Mantenga una profundidad de perforación de aproximadamente 5 mm con un tiempo de permanencia de 5 s para cada disco.
6. Cuidados posteriores al procedimiento
   1. Desinfecte y venda el sitio de la punción.
   2. Inyectar penicilina por vía intramuscular en el glúteo mayor a una dosis de 40.000 U por conejo al día durante 3 días.
      NOTA: Ajuste el enfoque si la aguja entra en contacto con tejido duro. Utilice la guía de rayos X para una perforación precisa. Supervise la recuperación del conejo y brinde los cuidados adecuados.

2. Establecimiento de un modelo de IVDD en conejo mediante punción del anillo fibroso del espacio transretroperitoneal

NOTA: El modelo de IVDD en conejo se estableció utilizando el método de punción del anillo fibroso del espacio transretroperitoneal¹² (Figura 2).

1. Ayunar los conejos durante 24 horas antes de la cirugía, permitiendo el acceso al agua.
2. Anestesiar al conejo inyectando pentobarbital sódico al 3% (1,3 mL/kg) en la vena del oído (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).
3. Asegúrese de que el conejo esté inmóvil, con los músculos relajados, sin reflejos corneales y sin respuesta de dolor a la presión para confirmar el éxito de la anestesia.
4. Fija al conejo en posición prona sobre una tabla de fijación.
5. Afeitar y preparar el área quirúrgica.
6. Palpar los puntos de referencia óseos, marcando las apófisis espinosas lumbares L1-L7 en el lomo lumbar del conejo con un rotulador.
7. Vuelva a palpar las apófisis transversas del conejo para determinar la ubicación de la incisión quirúrgica.
8. Coloque un paño estéril y desinfecte la piel local para garantizar condiciones asépticas.
9. Utilice un abordaje retroperitoneal posterior para diseccionar la fascia y los músculos capa por capa, exponiendo la cara lateral del disco intervertebral lumbar.
10. Punción del anillo fibroso con una aguja de punción hasta una profundidad aproximada de 5 mm y un tiempo de permanencia de 5 s.
11. Punción secuencial de los discos intervertebrales L3-4, L4-5 y L5-6, asegurándose de que cada disco se perfore una sola vez.
12. Suturar los tejidos capa por capa con un hilo de sutura de 0,25 mm de diámetro.
13. Desinfecte y venda el sitio de la punción después de modelar.
14. Inyectar penicilina por vía intramuscular en el glúteo mayor del conejo diariamente a una dosis de 40.000 U por conejo durante tres días consecutivos.
    NOTA: Use penicilina con una especificación de 800,000 unidades/vial y número de aprobación de 140051251 de medicamentos veterinarios.

3. Selección de modelos de IVDD y evaluación de resultados

1. Evaluación de la mortalidad y del estado general de los conejos
   1. Observe a los conejos semanalmente para determinar la supervivencia y registrar el estado general, incluido el estado mental, los patrones de actividad, la ingesta de alimentos y agua, así como la producción fecal y urinaria.
   2. Registre las observaciones con precisión y anote cualquier cambio en la condición.
2. Control de peso de conejos
   1. Registre el peso corporal de los conejos antes y después del establecimiento del modelo, así como antes de la recolección de tejidos.
   2. Garantice un registro preciso del peso y anote cualquier cambio significativo.
3. Valoración radiológica
   1. Obtener imágenes de resonancia magnética sagital 1.5T T2 de toda la secuencia de explantes vertebrales lumbares de cada conejo blanco antes y 4 semanas después del establecimiento del modelo.
   2. Observar el grado de degeneración del disco intervertebral.
   3. Realizar una evaluación cuantitativa de la degeneración del disco intervertebral utilizando el sistema de clasificación de Pfirrmann modificado propuesto por Griffith et ^al.15. Pida a tres radiólogos ciegos independientes que evalúen las secuencias de resonancia magnética ponderadas en T2 de acuerdo con los criterios establecidos: altura del disco, intensidad de la señal del núcleo pulposo e integridad del anillo fibroso.
   4. Determinar las calificaciones finales por consenso cuando las discrepancias excedan un nivel de calificación. Realice todas las evaluaciones utilizando el software de visualización DICOM estandarizado con configuraciones de pantalla calibradas.
4. Evaluación histopatológica y puntuación
   1. Eutanasiar a los conejos 4 semanas después del modelado utilizando una sobredosis intravenosa de pentobarbital sódico (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente), luego cosechar rápidamente los discos intervertebrales L2-L3, L3-L4 y L4-L5 en hielo¹⁵.
   2. Fije los discos L2-L3 en paraformaldehído al 4% y almacene las muestras restantes a -80 °C.
   3. Sumerja los discos fijos en una solución descalcificante, como EDTA al 10%, asegurando una inmersión completa. Cambie la solución descalcificante cada 2-3 días para mantener la efectividad.
   4. Monitoree el proceso de descalcificación con regularidad hasta que se logre la descalcificación completa, lo que puede demorar de varios días a una semana, dependiendo del tamaño y el grosor del disco.
   5. Enjuague bien los discos descalcificados con agua corriente para eliminar cualquier rastro de la solución descalcificante.
   6. Deshidrate los discos sumergiéndolos en una serie de soluciones de etanol graduadas, comenzando con un 70% de etanol y aumentando gradualmente hasta el 100% de etanol. Realice cada paso de deshidratación durante 1-2 h por grado.
   7. Infiltrar los discos deshidratados con cera de parafina (punto de fusión 56-58 °C) durante un mínimo de 2 h, asegurando una infiltración completa.
   8. Incruste los discos infiltrados en un bloque de cera, colocándolos para el seccionamiento. Deje que el bloque de cera se enfríe y solidifique por completo.
   9. Divida los discos incrustados en rodajas finas y uniformes (5-10 μm) con un micrótomo. Monte las secciones en portaobjetos de vidrio para su posterior análisis, como la tinción histológica o la inmunohistoquímica^12,13.
   10. Realice tinciones con hematoxilina y eosina (HE), capture imágenes bajo un microscopio óptico y asigne puntuaciones de tinción HE utilizando la escala de clasificación histopatológica IVD¹².
5. Ensayo TUNEL:
   1. Desparafinar y rehidratar las secciones de tejido del disco intervertebral, luego realizar la recuperación de antígenos y la permeabilización de la membrana.
   2. Añadir una mezcla de reactivo 1 (TdT) y reactivo 2 (dUTP) en una proporción de 1:9 e incubar en una cámara humidificada.
   3. Lave las secciones con tampón PBS, aplique el tinte DAPI e incube en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos.
   4. Capture imágenes utilizando un escáner panorámico totalmente automatizado y un software de procesamiento.
6. Detección de citocinas
   1. Sacrificar a los conejos experimentales (paso 3.4.1) y recoger muestras de sangre de la aorta abdominal.
   2. Centrifugar muestras de sangre de conejo a 2000 × g durante 10 min a 25 °C para separar el suero de las células sanguíneas. Recoja cuidadosamente el sobrenadante (suero), asegurándose de que no se incluyan restos celulares.
   3. Siga las instrucciones proporcionadas en el kit ELISA para detectar la expresión de TGF-β en muestras de suero.
   4. Prepare los reactivos y los patrones como se indica en el kit ELISA.
   5. Agregue muestras de suero a los pocillos apropiados en la placa ELISA.
   6. Incubar la placa a la temperatura y duración recomendadas según las instrucciones del kit.
   7. Lave la placa según las instrucciones para eliminar los reactivos no unidos.
   8. Añadir el anticuerpo de detección y otros reactivos necesarios, siguiendo el protocolo del kit.
   9. Vuelva a incubar la placa durante el tiempo y la temperatura especificados.
   10. Lave bien la placa para eliminar el exceso de reactivos.
   11. Agregue la solución de sustrato a los pocillos e incube durante el período recomendado para permitir el desarrollo del color.
   12. Mida la densidad óptica (OD) utilizando un espectrofotómetro a la longitud de onda especificada en las instrucciones del kit.
   13. Calcule las concentraciones de la muestra sustituyendo los valores de OD en la ecuación proporcionada o utilizando la curva estándar generada a partir de las concentraciones conocidas de los estándares.

4. Análisis estadístico

1. Realizar análisis estadísticos utilizando software disponible en el mercado.
2. Exprese las variables continuas como media ± desviación estándar.
3. Utilice el ANOVA de un factor para probar las diferencias entre los grupos.
4. Aplica pruebas de LSD para realizar comparaciones por pares.
5. Utilice el ANOVA de medidas repetidas para analizar los datos de medidas repetidas.
6. Realizar un análisis de correlación de Spearman para evaluar la correlación entre variables.
7. Establezca el nivel de significación en α = 0,05 y considere los valores de P inferiores a 0,05 como estadísticamente significativos.

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Resultados

Los procedimientos quirúrgicos se realizaron sin complicaciones. Un conejo del grupo B (grupo de punción percutánea) murió después del procedimiento. Todos los demás animales reanudaron los patrones normales de alimentación y actividad en el postoperatorio y sobrevivieron durante todo el período experimental. No se observó sangrado prolongado ni infección en los sitios quirúrgicos.

Evaluación de la mortalidad y del estado general

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Discusión

Los hallazgos de este estudio indican que tanto los abordajes de punción percutánea como los transretroperitoneales son efectivos para inducir la degeneración del disco intervertebral (IVDD) en modelos de conejo. En particular, sobre la base de una evaluación exhaustiva del estado general, la mortalidad, la evaluación histopatológica, el ensayo TUNEL y los niveles séricos de TGF-β, el modelo de punción transretroperitoneal dio lugar a cambios degenerativos más extensos en los d...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 T Veterinary Maenetic Resonance lmaging(MRI)	NINGBO CHUANSHANJIA	CSJ-MR
Alcohol medical	LIRCON	20230107
Benzylpenicillin potassium	Jiangxi Keda Animal Pharmaceutical	140051251
Haemostatic forceps	SHINVA	20211239
Injection syringe	CONPUVON	20153151307
Knife blades	Hons Medincal	20210615
Medical absorbent cotton ball	Cofoe	20210006
Medical suture needle	Shanghai Xiaoyi Medical Devices	20192020430
Medullo-puncture needle	Yangzhou Jiangzhou Medical Devices	20190902	Used to puncture lumbar disc
Physiological saline	NeilMed	C1210504D2
Povidone iodine solution	Sichuan IJIS Medical Technology	20221209
Quasi-microbalance	Explorer
Rabbit dissection operating table	Zhenhua Biomedical	ZH-BXT-3Z
Shaver	AUX
Statistical analysis softeare	IBM	SPSS
Sterile gauze	Cofoe	20202140675
Surgical gloves	DR.LERSH	20172140028
Surgical knife	Hons Medinca	20210019
Surgical tweezers	SHINVA	20210233
USB-C data transmission line	KINI
White light photography microscope	Nikon	Eclipse Ci-L