토끼의 요추 디스크 퇴행 모델링을 위한 경복강 후복막 접근과 경피적 천자 비교

요약

이 프로토콜은 토끼 추간판 변성(IVDD) 모델에서 경피적 및 경후복막 천자를 비교했습니다. 두 방법 모두 IVDD를 유도했습니다. 그러나 경후복막 접근법은 더 광범위한 변화와 더 낮은 사망률을 가져왔다.

초록

이 연구는 토끼에서 추간판 변성(IVDD)을 유도하는 두 가지 방법, 즉 고리 섬유의 경피적 및 경복막 천자의 효능을 비교합니다. 15마리의 건강한 수컷 뉴질랜드 흰 토끼를 무작위로 3개 그룹, 즉 가짜, 경피적 천자, 경복막 천자에 배정했습니다. 두 방법 간의 정확하고 상세한 비교를 보장하기 위해 사망률, 형태학적 및 조직학적 평가, 방사선 이미징 및 바이오마커 분석을 포함한 포괄적인 평가가 수행되었습니다. 결과는 두 펑크 기법 모두 토끼 모델에서 IVDD를 성공적으로 유도했음을 보여줍니다. 그러나 경후복막(trans-retroperitoneal) 접근법은 경피적 방법에 비해 현저히 낮은 사망률을 유지하면서 추간판에서 더 뚜렷한 퇴행성 변화를 일으켰습니다. 이러한 결과는 IVDD 모델링에서 경후복막 접근법의 장점을 강조합니다. 이 연구는 IVDD 모델 구축에 대한 귀중한 통찰력을 제공하고 요통에 대한 효과적인 치료 전략에 대한 향후 조사의 토대를 마련하여 궁극적으로 환자 결과를 개선합니다.

서문

지난 수십 년 동안 요통(low-back pain, LBP)은 삶의 질에 영향을 미치는 가장 중요한 근골격계 질환으로 부상했다¹. 요통은 점점 더 중요한 공중 보건 문제가 되고 있으며, 노동력 손실과 추가 의료비로 인해 사회에 상당한 경제적 부담을 안겨주고 있다 ^2,3. 미국에서만 LBP와 관련된 직간접 비용은 의료비, 소득 손실, 노동 손실을 포함하여 연간 1,000억 달러를 초과합니다⁴. 요통은 종종 추간판 변성(IVDD^)5,6,7,8에 의해 발생합니다. 요통의 높은 유병률과 경제적 영향을 감안할 때, IVDD를 정확하게 모델링하는 것은 치료 전략을 탐색하는 데 매우 중요합니다.

IVDD의 병태생리학을 이해하고 치료 전략을 평가하기 위해 다양한 전임상 in vivo 동물 모델을 개발하여 활용하고 있습니다⁹. 이러한 모델에서는 디스크 퇴행을 유도하기 위해 외과적 또는 화학적 디스크 손상, 비침습적 기계적 스트레스, 유전자 변형 및 자연 발생 등 다양한 방법이 사용되었다¹⁰. 이러한 방법 중 외과적 손상은 IVDD 유도의 최대 64.9%를 차지하며, 바늘 천자가 주요 수술 기법이다¹¹. 바늘 펑크 모델은 설치가 쉽고 실험 동물에 대한 손상이 최소화된 것이 특징입니다. 일반적인 바늘 천자 접근법에는 요추 디스크 공간에 대한 개방 후복막 접근과 경피적 후외측 천자가 포함됩니다. 삽입 깊이는 방사선 모니터링 또는 바늘 길이를 사용하여 결정할 수 있습니다. 특히, 경피적 접근법은 개복 수술 방법에 비해 의원성 조직 손상을 줄일 수 있으며, 후복막 접근은 이전 문헌에서 정량적으로 비교되지 않은 직접 시각화 기능의 이점을 제공합니다. 서로 다른 직경의 바늘¹² 을 사용하는 것과 다른 디스크¹⁰ 를 뚫는 것이 IVDD 유도에 미치는 영향을 조사한 연구가 있지만, 다른 바늘 뚫는 방법에 초점을 맞춘 비교 연구는 여전히 제한적이다. 선택된 토끼 모델은 인간 디스크와 해부학적으로 유사하고 크기 및 구조 측면에서 설치류 모델에 비해 장점이 있다는 점을 감안할 때 빈번한 이미징 평가를 통해 비용 효율적인 종단 연구를 필요로 하는 연구자에게 특히 유용하다¹³.

이 연구에서는 요추 디스크 공간을 천공하기 위한 개방 후복막 접근과 경피적 후외측 천자의 두 가지 방법을 사용하여 요추 IVDD의 토끼 모델을 확립했습니다. 형태학적, 조직학적, 방사선학적 변화를 포함한 포괄적인 결과 측정치를 분석했습니다.

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프로토콜

동물 실험 절차는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에서 발행한 실험 동물 관리 및 사용 지침(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)을 엄격히 준수했으며 청두 중국 전통 의학 대학의 실험 동물 윤리 위원회(윤리 승인 번호: 2021-23)의 승인을 받았습니다. 수컷 7마리와 암컷 8마리를 포함하여 4개월 된 클린 그레이드 뉴질랜드 흰 토끼 15마리(2.25kg ± 0.25kg)를 사용했습니다. 동물들은 실내 온도가 23°C± 3°C이고 습도가 약 60%± 10%인 환경에서 일주일 동안 물과 음식을 자유롭게 이용할 수 있는 환경에서 지냈습니다. 실험에 앞서, 15마리의 토끼는 세 그룹 중 하나에 무작위로 할당되었습니다: 가짜 그룹(그룹 A), 경피적 고리 섬유질 천자 그룹(그룹 B), 경후복막 공간 고리 섬유 천자 그룹(그룹 C), 각 그룹에는 5마리의 토끼가 있습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 경피적 고리 섬유화 천자를 통한 토끼 IVDD 모델 확립

참고: 토끼 IVDD 모델은 경피적 고리 섬유질 천자 방법을 사용하여 확립되었습니다. 이 절차는 Luo TD et ^al.14 에 설명된 펑크 모델링 방법을 따랐으며 X선 안내에 따라 수행되었습니다(그림 1).

1. 토끼를 준비합니다.
   1. 수술 전 24시간 동안 토끼를 금식시켜 물에 접근할 수 있도록 합니다.
   2. 3% 펜토바르비탈 나트륨(1.3mL/kg)을 귓정맥에 정 맥 주사 하여 마취를 시행합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름).
   3. 움직이지 못함, 이완된 근육, 각막 반사 부족 및 통증 반응의 부재를 확인하여 성공적인 마취를 확인합니다.
2. 토끼의 위치를 지정하고 표시합니다.
   1. 토끼를 고정 보드에 엎드린 자세로 고정하십시오.
   2. 수술 부위를 면도하고 준비한 다음 뼈 랜드마크를 촉진합니다.
   3. 토끼의 요추 등에 있는 뼈 표식을 촉진합니다. 토끼에서 가장 낮은 갈비뼈를 찾는데, 이는 일반적으로 L1 가시돌기 바로 위의 척추뼈에 해당합니다.
   4. 이 척추 바로 아래에 있는 가시돌기를 식별하여 L1 척추돌기를 결정합니다.
   5. 장골능의 가장 높은 지점을 L6 척추와 대략 같은 높이로 찾습니다.
   6. L1 spinous process에서 추적하여 L7까지 각 spinous process를 순차적으로 식별합니다.
   7. 마킹 펜을 사용하여 토끼의 등에 L1 가시돌기를 명확하게 표시합니다.
   8. 다음 spinous process로 이동하여 L2로 표시합니다.
   9. 이후의 각 가시 돌기를 L3, L4, L5, L6 및 L7로 계속 표시합니다. 명확한 식별을 위해 각 표시가 고유하고 순차적인지 확인하십시오.
3. 펑크 부위를 찾아 표시합니다.
   1. 횡돌기를 촉진하고 L5와 L6의 원위 끝 사이의 중간점을 찾습니다.
   2. 이 점을 표시하고 그 위에 약 1cm 위에 천자 바늘을 삽입할 준비를 합니다.
4. 펑크 바늘을 삽입하십시오.
   1. 찔린 바늘을 수평으로 잡고 지면을 향해 삽입하여 피부를 찢습니다.
   2. 바늘을 L4 척추체에 도달하도록 전진시키고 X선 안내에 따라 올바른 위치를 확인합니다.
   3. 바늘을 L4-5 추간판 쪽으로 약 20° 각도로 약간 두부 방향으로 기울입니다. 디스크에 구멍을 뚫고 X선 검사에서 펑크의 정확도를 확인합니다.
5. 디스크 펑크를 수행합니다.
   1. 필요한 경우 X선 유도를 사용하여 고리 섬유에 정확하게 구멍을 뚫습니다.
   2. L2-3 및 L3-4 추간판에 대해 각각 한 번씩 구멍을 뚫는 과정을 반복합니다.
   3. 각 디스크에 대해 5초의 체류 시간으로 약 5mm의 천공 깊이를 유지합니다.
6. 시술 후 관리
   1. 천자 부위를 소독하고 붕대를 감습니다.
   2. 페니실린을 대둔근 막시무스에 3일 동안 매일 토끼당 40,000U의 투여량으로 근육 주사합니다.
      알림: 바늘이 단단한 조직을 만나면 접근 방식을 조정하십시오. 정확한 천공을 위해 X선 안내를 사용하십시오. 토끼의 회복 상태를 모니터링하고 적절한 보살핌을 제공하십시오.

2. 경후복막공간 고리 섬유성 천자를 통한 토끼 IVDD 모델 구축

참고: 토끼 IVDD 모델은 trans-retroperitoneal space annulus fibrosus puncture method¹² 를 사용하여 확립되었습니다(그림 2).

1. 수술 전 24시간 동안 토끼를 금식시켜 물을 마실 수 있도록 합니다.
2. 3% 펜토바르비탈 나트륨(1.3mL/kg)을 귓정맥에 정맥 주사하여 토끼를 마취합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름).
3. 토끼가 움직이지 않고, 근육이 이완되고, 각막 반사가 없고, 압력에 통증 반응이 없는지 확인하여 성공적인 마취를 확인합니다.
4. 토끼를 고정 보드에 엎드린 자세로 고정하십시오.
5. 수술 부위를 면도하고 준비합니다.
6. 촉진 뼈 랜드마크, 토끼의 요추 등에 있는 L1-L7 요추 가시돌기를 마킹 펜으로 표시합니다.
7. 외과적 절개 위치를 결정하기 위해 토끼의 횡돌기를 다시 촉진합니다.
8. 멸균 드레이프를 놓고 무균 상태를 보장하기 위해 현지 피부를 소독합니다.
9. 후방 후복막 접근법을 사용하여 근막과 근육을 층별로 절개하여 요추 추간판의 측면측면을 노출시킵니다.
10. 천자 바늘로 고리 섬유를 약 5mm 깊이와 5초의 체류 시간까지 뚫습니다.
11. L3-4, L4-5 및 L5-6 추간판에 순차적으로 구멍을 뚫어 각 디스크에 한 번만 구멍을 뚫습니다.
12. 0.25mm 직경의 봉합사 실을 사용하여 조직을 층별로 봉합합니다.
13. 모델링 후 천공 부위를 소독하고 붕대를 감습니다.
14. 페니실린을 3일 연속 토끼 당 40,000U의 복용량으로 매일 토끼의 대둔근에 근육 주사합니다.
    참고: 사양이 800,000개/바이알 및 승인 번호 동물용 의약품 140051251인 페니실린을 사용하십시오.

3. IVDD 모델 선정 및 결과 평가

1. 토끼의 폐사율 및 일반적인 상태 평가
   1. 매주 토끼를 관찰하여 생존 여부를 확인하고 정신 상태, 활동 패턴, 음식 및 수분 섭취량, 배설물 및 소변 배출량을 포함한 일반적인 상태를 기록합니다.
   2. 관찰 결과를 정확하게 기록하고 상태 변화를 기록합니다.
2. 토끼의 체중 모니터링
   1. 모델 수립 전후, 조직 채취 전과 전후 토끼의 체중을 기록합니다.
   2. 정확한 체중 기록을 보장하고 중요한 변경 사항을 기록하십시오.
3. 방사선 평가
   1. 모델 수립 전과 후 4주 동안 각 흰 토끼의 전체 요추 척추 이식 순서에 대한 시상 1.5T T2 가중 자기 공명 영상을 얻습니다.
   2. 추간판 퇴행의 정도를 관찰하십시오.
   3. Griffith et ^al.15이 제안한 수정된 Pfirrmann 등급 시스템을 사용하여 추간판 변성에 대한 정량적 평가를 수행합니다. 3명의 독립적인 맹검 방사선 전문의가 확립된 기준(디스크 높이, 핵 펄프보수스 신호 강도 및 고리 섬유성 무결성)에 따라 T2 가중 MRI 시퀀스를 평가합니다.
   4. 불일치가 한 학년 수준을 초과하는 경우 합의를 통해 최종 성적을 결정합니다. 보정된 디스플레이 설정으로 표준화된 DICOM 보기 소프트웨어를 사용하여 모든 평가를 수행합니다.
4. 조직병리학적 평가 및 채점
   1. 펜토바르비탈 나트륨을 정맥 주사로 과다 투여하여 모델링한 지 4주 후(제도적으로 승인된 프로토콜에 따름) 토끼를 안락사시킨 다음 얼음¹⁵에서 L2-L3, L3-L4 및 L4-L5 추간판을 빠르게 채취합니다.
   2. L2-L3 디스크를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 나머지 샘플은 -80°C에서 보관합니다.
   3. 고정 디스크를 10% EDTA와 같은 석회질 제거 용액에 담궈 완전히 담그십시오. 효과를 유지하기 위해 석회질 제거 용액을 2-3일마다 교체하십시오.
   4. 완전한 석회질화가 완료될 때까지 석회질 제거 과정을 정기적으로 모니터링하며, 이는 디스크 크기와 두께에 따라 며칠에서 일주일이 걸릴 수 있습니다.
   5. 석회질 제거 용액의 흔적을 제거하기 위해 석회질 처리된 디스크를 흐르는 물로 철저히 헹굽니다.
   6. 70% 에탄올에서 시작하여 점차 100% 에탄올까지 증가시키는 일련의 등급이 매겨진 에탄올 용액에 디스크를 담그어 디스크를 탈수합니다. 등급당 1-2시간 동안 각 탈수 단계를 수행합니다.
   7. 파라핀 왁스(녹는점 56-58°C)로 탈수된 디스크를 최소 2시간 동안 침투시켜 완전한 침투를 보장합니다.
   8. 침투된 디스크를 왁스 블록에 삽입하고 절단을 위해 배치합니다. 왁스 블록이 완전히 식고 굳어지도록 합니다.
   9. 마이크로톰을 사용하여 내장된 디스크를 얇고 균일한 조각(5-10μm)으로 자릅니다. 조직학적 염색 또는 면역조직화학과 같은 추가 분석을 위해 절편을 유리 슬라이드에 장착합니다^12,13.
   10. 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색을 수행하고, 광학 현미경으로 이미지를 캡처하고, IVD 조직병리학적 등급 척도¹²를 사용하여 HE 염색 점수를 할당합니다.
5. TUNEL 분석
   1. 추간판 조직 절편을 탈랍하고 재수화한 다음 항원 회수 및 막 투과화를 수행합니다.
   2. 시약 1(TdT)과 시약 2(dUTP)의 혼합물을 1:9 비율로 첨가하고 가습 챔버에서 배양합니다.
   3. PBS 버퍼로 절편을 세척하고 DAPI 염색제를 바르고 실온에서 10분 동안 암흑 속에서 배양합니다.
   4. 완전 자동화된 파노라마 스캐너 및 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 캡처합니다.
6. 사이토카인 검출
   1. 실험용 토끼를 안락사시키고(3.4.1단계) 복부 대동맥에서 혈액 샘플을 채취합니다.
   2. 토끼 혈액을 2000 × g 에서 25 °C에서 10 분 동안 원심 분리기로 추출하여 혈액 세포에서 혈청을 분리합니다. 상층액(혈청)을 조심스럽게 수집하여 세포 파편이 포함되지 않도록 합니다.
   3. 혈청 샘플에서 TGF-β의 발현을 검출하기 위해 ELISA 키트에 제공된 지침을 따르십시오.
   4. ELISA 키트의 지시에 따라 시약과 표준물질을 준비합니다.
   5. 혈청 샘플을 ELISA 플레이트의 적절한 웰에 추가합니다.
   6. 키트 지침에 따라 권장 온도와 지속 시간으로 플레이트를 배양합니다.
   7. 결합되지 않은 시약을 제거하기 위해 지시에 따라 플레이트를 세척합니다.
   8. 키트의 프로토콜에 따라 검출 항체 및 기타 필요한 시약을 추가합니다.
   9. 지정된 시간과 온도로 플레이트를 다시 배양합니다.
   10. 플레이트를 철저히 세척하여 과도한 시약을 제거하십시오.
   11. 웰에 기질 용액을 추가하고 권장 기간 동안 배양하여 발색이 가능하게합니다.
   12. 키트 지침에 지정된 파장에서 분광 광도계를 사용하여 광학 밀도(OD)를 측정합니다.
   13. 제공된 방정식에 OD 값을 대체하거나 알려진 표준 농도에서 생성된 표준 곡선을 사용하여 샘플 농도를 계산합니다.

4. 통계 분석

1. 상용 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
2. 계량형 변수를 표준 편차± 평균으로 표현합니다.
3. 일원 분산 분석을 사용하여 그룹 간의 차이를 테스트합니다.
4. 쌍별 비교를 위해 LSD 테스트를 적용합니다.
5. 반복 측도 ANOVA를 사용하여 반복 측도 데이터를 분석할 수 있습니다.
6. Spearman 상관 분석을 수행하여 변수 간의 상관 관계를 평가합니다.
7. 유의 수준을 α = 0.05로 설정하고 0.05보다 작은 P 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.

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결과

수술 절차는 합병증 없이 수행되었습니다. 그룹 B(경피적 천자 그룹)의 토끼 1마리가 시술 후 사망했습니다. 다른 모든 동물은 수술 후 정상적인 섭식 및 활동 패턴을 재개했으며 실험 기간 동안 생존했습니다. 수술 부위에서 장기간의 출혈이나 감염은 관찰되지 않았다.

사망률 및 일반적인 상태 평가
사망률은 그룹 A와 그룹 C 모두 0%인 ...

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토론

이 연구의 결과는 경피적 및 경후복막 천자 접근법 모두 토끼 모델에서 추간판 변성(IVDD)을 유도하는 데 효과적임을 나타냅니다. 특히, 일반적인 상태, 사망률, 조직병리학적 평가, TUNEL 분석 및 혈청 TGF-β 수치에 대한 포괄적인 평가를 기반으로 한 경복막 천자 모델은 더 낮은 사망률을 유지하면서 추간판에서 보다 광범위한 퇴행성 변화를 가져왔습니다.

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 T Veterinary Maenetic Resonance lmaging(MRI)	NINGBO CHUANSHANJIA	CSJ-MR
Alcohol medical	LIRCON	20230107
Benzylpenicillin potassium	Jiangxi Keda Animal Pharmaceutical	140051251
Haemostatic forceps	SHINVA	20211239
Injection syringe	CONPUVON	20153151307
Knife blades	Hons Medincal	20210615
Medical absorbent cotton ball	Cofoe	20210006
Medical suture needle	Shanghai Xiaoyi Medical Devices	20192020430
Medullo-puncture needle	Yangzhou Jiangzhou Medical Devices	20190902	Used to puncture lumbar disc
Physiological saline	NeilMed	C1210504D2
Povidone iodine solution	Sichuan IJIS Medical Technology	20221209
Quasi-microbalance	Explorer
Rabbit dissection operating table	Zhenhua Biomedical	ZH-BXT-3Z
Shaver	AUX
Statistical analysis softeare	IBM	SPSS
Sterile gauze	Cofoe	20202140675
Surgical gloves	DR.LERSH	20172140028
Surgical knife	Hons Medinca	20210019
Surgical tweezers	SHINVA	20210233
USB-C data transmission line	KINI
White light photography microscope	Nikon	Eclipse Ci-L