Confronto tra l'accesso retroperitoneale transperitoneale e la puntura percutanea per la modellazione della degenerazione del disco lombare nei conigli

Riepilogo

Questo protocollo ha confrontato le punture percutanee e trans-retroperitoneali in un modello di degenerazione del disco intervertebrale di coniglio (IVDD). Entrambi i metodi hanno indotto IVDD; Tuttavia, l'approccio trans-retroperitoneale ha portato a cambiamenti più estesi e a una minore mortalità.

Abstract

Questo studio confronta l'efficacia di due metodi per indurre la degenerazione del disco intervertebrale (IVDD) nei conigli: la puntura percutanea e trans-retroperitoneale dell'anulus fibrosus. Quindici conigli bianchi maschi sani della Nuova Zelanda sono stati assegnati in modo casuale a tre gruppi: sham, puntura percutanea e puntura trans-retroperitoneale. È stata condotta una valutazione completa, che include i tassi di mortalità, le valutazioni morfologiche e istologiche, l'imaging radiologico e l'analisi dei biomarcatori, per garantire un confronto accurato e dettagliato tra i due metodi. I risultati dimostrano che entrambe le tecniche di puntura hanno indotto con successo l'IVDD nel modello di coniglio. Tuttavia, l'approccio trans-retroperitoneale ha determinato alterazioni degenerative più pronunciate nei dischi intervertebrali, mantenendo un tasso di mortalità significativamente inferiore rispetto al metodo percutaneo. Questi risultati evidenziano i vantaggi dell'approccio trans-retroperitoneale nella modellazione IVDD. Questo studio fornisce preziose informazioni sulla creazione di modelli IVDD e getta le basi per future indagini su strategie di trattamento efficaci per la lombalgia, migliorando in ultima analisi i risultati dei pazienti.

Introduzione

Negli ultimi decenni, la lombalgia (LBP) è emersa come il disturbo muscoloscheletrico più significativo che influisce sulla qualità^{della vita1}. La lombalgia è diventata una preoccupazione sempre più importante per la salute pubblica, imponendo un notevole onere economico alla società a causa della perdita di manodopera e delle spese mediche aggiuntive ^2,3. Solo negli Stati Uniti, i costi diretti e indiretti associati al LBP superano i 100 miliardi di dollari all'anno, comprese le spese mediche, le perdite di reddito e le perdite di manodopera⁴. La lombalgia è spesso causata dalla degenerazione del disco intervertebrale (IVDD)5,6,7,8. Data l'elevata prevalenza e l'impatto economico del LBP, una modellazione accurata dell'IVDD è fondamentale per esplorare le strategie di trattamento.

Per comprendere la fisiopatologia dell'IVDD e valutare le strategie di trattamento, sono stati sviluppati e utilizzati vari modelli animali preclinici in vivo ⁹. In questi modelli sono stati impiegati diversi metodi per indurre la degenerazione del disco, tra cui lesioni chirurgiche o chimiche del disco, stress meccanico non invasivo, modificazione genetica e evento naturale¹⁰. Tra questi metodi, la lesione chirurgica rappresenta fino al 64,9% dell'induzione dell'IVDD, con la puntura dell'ago che è la tecnica chirurgica primaria¹¹. Il modello di puntura dell'ago si caratterizza per la sua facilità di insediamento e il minimo danno agli animali da esperimento. Gli approcci comuni alla puntura con ago includono l'accesso retroperitoneale aperto allo spazio del disco lombare e la puntura posterolaterale percutanea. La profondità di inserimento può essere determinata utilizzando il monitoraggio radiografico o la lunghezza dell'ago. In particolare, l'approccio percutaneo può ridurre il danno tissutale iatrogeno rispetto ai metodi chirurgici a cielo aperto, mentre l'accesso retroperitoneale offre il vantaggio di caratteristiche di visualizzazione diretta che non sono state confrontate quantitativamente nella letteratura precedente. Mentre gli studi hanno studiato gli effetti dell'uso di aghi di diverso diametro¹² e della perforazione di dischi diversi¹⁰ sull'induzione IVDD, gli studi comparativi incentrati su diversi approcci di puntura dell'ago rimangono limitati. Il modello di coniglio selezionato offre una particolare utilità per i ricercatori che richiedono studi longitudinali convenienti con frequenti valutazioni di imaging, data la sua somiglianza anatomica con i dischi umani e i suoi vantaggi rispetto ai modelli di roditori in termini di dimensioni e struttura¹³.

In questo studio, sono stati stabiliti modelli di coniglio di IVDD lombare utilizzando due metodi: accesso retroperitoneale aperto per perforare lo spazio del disco lombare e puntura posterolaterale percutanea. È stata analizzata una serie completa di misure di esito, tra cui cambiamenti morfologici, istologici e radiologici.

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Protocollo

Le procedure sperimentali sugli animali hanno aderito rigorosamente alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio emessa dal National Institutes of Health e sono state approvate dal Comitato etico per gli animali sperimentali dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (Numero di approvazione etica: 2021-23). Sono stati utilizzati quindici conigli bianchi della Nuova Zelanda sani, di 4 mesi, di qualità pulita (2,25 kg ± 0,25 kg), tra cui sette maschi e otto femmine. Gli animali sono stati alloggiati in un ambiente con una temperatura ambiente compresa tra 23 °C ± 3 °C e un'umidità di circa il 60% ± il 10% per una settimana di adattamento, con libero accesso ad acqua e cibo. Prima dell'esperimento, i 15 conigli sono stati assegnati in modo casuale a uno dei tre gruppi: il gruppo fittizio (Gruppo A), il gruppo di puntura percutanea dell'anello fibroso (Gruppo B) e il gruppo di puntura dell'anello fibroso dello spazio trans-retroperitoneale (Gruppo C), con cinque conigli in ciascun gruppo. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Definizione del modello IVDD di coniglio tramite puntura percutanea dell'anulus fibroso

NOTA: Il modello IVDD di coniglio è stato stabilito utilizzando il metodo di puntura percutanea dell'anulus fibroso. La procedura ha seguito il metodo di modellazione della puntura descritto da Luo TD et ^al.14 ed è stata eseguita sotto guida a raggi X (Figura 1).

1. Preparate il coniglio.
   1. Digiunare i conigli per 24 ore prima dell'intervento, garantendo l'accesso all'acqua.
   2. Somministrare l'anestesia tramite iniezione endovenosa di pentobarbital sodico al 3% (1,3 ml/kg) nella vena dell'orecchio (seguendo protocolli approvati istituzionalmente).
   3. Confermare l'esito positivo dell'anestesia controllando l'immobilità, i muscoli rilassati, la mancanza di riflesso corneale e l'assenza di risposta al dolore.
2. Posiziona e segna il coniglio.
   1. Fissa il coniglio in posizione prona su una tavola di fissaggio.
   2. Radere e preparare l'area chirurgica, quindi palpare i punti di riferimento ossei.
   3. Palpare i punti di riferimento ossei sul dorso lombare del coniglio. Individua la costola più bassa del coniglio, che in genere corrisponde alla vertebra appena sopra il processo spinoso L1.
   4. Identificare il processo spinoso immediatamente sotto questa vertebra per determinare il processo spinoso L1.
   5. Individuare i punti più alti delle creste iliache, approssimativamente all'altezza della vertebra L6.
   6. Tracciare il processo spinoso L1 per identificare in sequenza ogni processo spinoso fino a L7.
   7. Usa un pennarello per marcare chiaramente il processo spinoso L1 sul dorso del coniglio.
   8. Passa al processo spinoso successivo e contrassegnalo come L2.
   9. Continua a contrassegnare ogni processo spinoso successivo come L3, L4, L5, L6 e L7. Assicurarsi che ogni segno sia distinto e in ordine sequenziale per una chiara identificazione.
3. Individuare e contrassegnare il sito di puntura.
   1. Palpare i processi trasversali e individuare il punto medio tra le estremità distali di L5 e L6.
   2. Segna questo punto e preparati a inserire l'ago da puntura a circa 1 cm sopra di esso.
4. Inserire l'ago per puntura.
   1. Tenere l'ago della puntura orizzontalmente e inserirlo verso il suolo, rompendo la pelle.
   2. Far avanzare l'ago per raggiungere il corpo vertebrale L4 e verificare il corretto posizionamento sotto guida radiografica.
   3. Inclinare leggermente l'ago cefalico con un angolo di circa 20° verso il disco intervertebrale L4-5. Forare il disco e confermare l'accuratezza della puntura durante l'esame a raggi X.
5. Eseguire le forature del disco.
   1. Perforare con precisione l'anulus fibroso, utilizzando la guida a raggi X se necessario.
   2. Ripetere il processo di puntura per i dischi intervertebrali L2-3 e L3-4, forandoli una volta.
   3. Mantenere una profondità di foratura di circa 5 mm con un tempo di permanenza di 5 s per ogni disco.
6. Assistenza post-procedura
   1. Disinfettare e fasciare il sito di puntura.
   2. Iniettare la penicillina per via intramuscolare nel grande gluteo alla dose di 40.000 U per coniglio al giorno per 3 giorni.
      NOTA: Regolare l'approccio se l'ago incontra il tessuto duro. Utilizzare la guida a raggi X per una foratura precisa. Monitora il recupero del coniglio e fornisci cure adeguate.

2. Definizione del modello IVDD del coniglio tramite puntura dell'anello fibroso dello spazio trans-retroperitoneale

NOTA: Il modello IVDD di coniglio è stato stabilito utilizzando il metodo di puntura dell'anulus fibroso dello spazio trans-retroperitoneale¹² (Figura 2).

1. Digiunare i conigli per 24 ore prima dell'intervento, consentendo l'accesso all'acqua.
2. Anestetizzare il coniglio iniettando per via endovenosa il 3% di pentobarbital sodico (1,3 ml/kg) nella vena dell'orecchio (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
3. Assicurati che il coniglio sia immobile, con i muscoli rilassati, nessun riflesso corneale e nessuna risposta al dolore alla pressione per confermare il successo dell'anestesia.
4. Fissa il coniglio in posizione prona su una tavola di fissaggio.
5. Radersi e preparare l'area chirurgica.
6. Palpare i punti di riferimento ossei, segnando i processi spinosi lombari L1-L7 sulla schiena lombare del coniglio con un pennarello.
7. Ripalpare i processi trasversali del coniglio per determinare la posizione dell'incisione chirurgica.
8. Posizionare un telo sterile e disinfettare la pelle locale per garantire condizioni asettiche.
9. Utilizzare un approccio retroperitoneale posteriore per sezionare la fascia e i muscoli strato per strato, esponendo l'aspetto laterale del disco intervertebrale lombare.
10. Perforare l'anulus fibroso con un ago da puntura a una profondità di circa 5 mm e un tempo di permanenza di 5 s.
11. Forare in sequenza i dischi intervertebrali L3-4, L4-5 e L5-6, assicurandosi che ogni disco venga forato una sola volta.
12. Sutura i tessuti strato per strato utilizzando un filo di sutura di 0,25 mm di diametro.
13. Disinfettare e fasciare il sito di puntura dopo la modellazione.
14. Iniettare la penicillina per via intramuscolare nel grande gluteo del coniglio ogni giorno alla dose di 40.000 U per coniglio per tre giorni consecutivi.
    NOTA: Utilizzare la penicillina con una specifica di 800.000 unità/fiala e numero di approvazione Veterinary Drug 140051251.

3. Selezione dei modelli IVDD e valutazione degli esiti

1. Valutazione della mortalità e dello stato generale dei conigli
   1. Osservare i conigli settimanalmente per determinare la sopravvivenza e registrare le condizioni generali, compreso lo stato mentale, i modelli di attività, l'assunzione di cibo e acqua, nonché la produzione fecale e urinaria.
   2. Registra le osservazioni in modo accurato e annota eventuali cambiamenti nelle condizioni.
2. Monitoraggio del peso dei conigli
   1. Registrare il peso corporeo dei conigli prima e dopo l'istituzione del modello, nonché prima della raccolta dei tessuti.
   2. Garantisci una registrazione accurata del peso e annota eventuali modifiche significative.
3. Valutazione radiologica
   1. Ottenere la risonanza magnetica sagittale 1.5T pesata in T2 dell'intera sequenza di espianti vertebrali lombari di ciascun coniglio bianco prima e 4 settimane dopo l'istituzione del modello.
   2. Osservare l'entità della degenerazione del disco intervertebrale.
   3. Eseguire una valutazione quantitativa della degenerazione del disco intervertebrale utilizzando il sistema di classificazione Pfirrmann modificato proposto da Griffith et ^al.15. Chiedere a tre radiologi indipendenti in cieco di valutare le sequenze di risonanza magnetica pesate in T2 secondo criteri stabiliti: altezza del disco, intensità del segnale del nucleo polposo e integrità dell'anulus fibroso.
   4. Determinare i voti finali attraverso il consenso quando le discrepanze superano un livello di classe. Conduci tutte le valutazioni utilizzando un software di visualizzazione DICOM standardizzato con impostazioni di visualizzazione calibrate.
4. Valutazione istopatologica e scoring
   1. Eutanasia dei conigli 4 settimane dopo la modellazione utilizzando un sovradosaggio endovenoso di pentobarbital sodico (seguendo protocolli istituzionalmente approvati), quindi raccogliere rapidamente i dischi intervertebrali L2-L3, L3-L4 e L4-L5 su ghiaccio¹⁵.
   2. Fissare i dischi L2-L3 in paraformaldeide al 4% e conservare i campioni rimanenti a -80 °C.
   3. Immergere i dischi fissati in una soluzione decalcificante, come EDTA al 10%, garantendo la completa immersione. Cambiare la soluzione decalcificante ogni 2-3 giorni per mantenere l'efficacia.
   4. Monitorare regolarmente il processo di decalcificazione fino al raggiungimento della completa decalcificazione, che può richiedere da diversi giorni a una settimana, a seconda delle dimensioni e dello spessore del disco.
   5. Sciacquare accuratamente i dischi decalcificati con acqua corrente per rimuovere eventuali tracce della soluzione decalcificante.
   6. Disidratare i dischi immergendoli in una serie di soluzioni di etanolo graduato, iniziando con etanolo al 70% e aumentando gradualmente fino al 100% di etanolo. Condurre ogni fase di disidratazione per 1-2 ore per grado.
   7. Infiltrare i dischi disidratati con cera di paraffina (punto di fusione 56-58 °C) per un minimo di 2 ore, garantendo la completa infiltrazione.
   8. Incorporare i dischi infiltrati in un blocco di cera, posizionandoli per il sezionamento. Lasciare raffreddare il blocco di cera e solidificarlo completamente.
   9. Sezionare i dischi incorporati in fette sottili e uniformi (5-10 μm) utilizzando un microtomo. Montare le sezioni su vetrini per ulteriori analisi, come la colorazione istologica o l'immunoistochimica^12,13.
   10. Eseguire la colorazione con ematossilina ed eosina (HE), acquisire immagini al microscopio ottico e assegnare punteggi di colorazione HE utilizzando la scala di classificazione istopatologica IVD¹².
5. Saggio TUNEL
   1. Decerare e reidratare le sezioni di tessuto del disco intervertebrale, quindi eseguire il recupero dell'antigene e la permeabilizzazione della membrana.
   2. Aggiungere una miscela di reagente 1 (TdT) e reagente 2 (dUTP) in un rapporto di 1:9 e incubare in una camera umidificata.
   3. Lavare le sezioni con tampone PBS, applicare il colorante DAPI e incubare al buio a temperatura ambiente per 10 minuti.
   4. Acquisisci immagini utilizzando uno scanner panoramico completamente automatizzato e un software di elaborazione.
6. Rilevamento di citochine
   1. Eutanasia dei conigli sperimentali (passaggio 3.4.1) e raccolta di campioni di sangue dall'aorta addominale.
   2. Centrifugare campioni di sangue di coniglio a 2000 × g per 10 minuti a 25 °C per separare il siero dalle cellule del sangue. Raccogliere con cura il surnatante (siero), assicurandosi che non siano inclusi detriti cellulari.
   3. Seguire le istruzioni fornite nel kit ELISA per rilevare l'espressione di TGF-β nei campioni di siero.
   4. Preparare i reagenti e gli standard come indicato nel kit ELISA.
   5. Aggiungere campioni di siero nei pozzetti appropriati nella piastra ELISA.
   6. Incubare la piastra alla temperatura e alla durata consigliate secondo le istruzioni del kit.
   7. Lavare la piastra come indicato per rimuovere i reagenti non legati.
   8. Aggiungere l'anticorpo di rilevamento e gli altri reagenti necessari, seguendo il protocollo del kit.
   9. Incubare nuovamente la piastra per il tempo e la temperatura specificati.
   10. Lavare accuratamente la piastra per rimuovere i reagenti in eccesso.
   11. Aggiungere la soluzione di substrato ai pozzetti e incubare per il periodo consigliato per consentire lo sviluppo del colore.
   12. Misurare la densità ottica (OD) utilizzando uno spettrofotometro alla lunghezza d'onda specificata nelle istruzioni del kit.
   13. Calcolare le concentrazioni del campione sostituendo i valori OD nell'equazione fornita o utilizzando la curva standard generata dalle concentrazioni note degli standard.

4. Analisi statistica

1. Eseguire analisi statistiche utilizzando software disponibili in commercio.
2. Esprimere le variabili continue come media ± deviazione standard.
3. Utilizzare l'ANOVA unidirezionale per testare le differenze tra i gruppi.
4. Applica i test LSD per confronti a coppie.
5. Utilizzare l'ANOVA a misure ripetute per analizzare i dati delle misure ripetute.
6. Esegui l'analisi di correlazione di Spearman per valutare la correlazione tra le variabili.
7. Imposta il livello di significatività a α = 0,05 e considera i valori P inferiori a 0,05 come statisticamente significativi.

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Risultati

Le procedure chirurgiche sono state eseguite senza complicazioni. Un coniglio del gruppo B (gruppo di puntura percutanea) è morto dopo la procedura. Tutti gli altri animali hanno ripreso i normali modelli di alimentazione e attività dopo l'intervento e sono sopravvissuti per tutto il periodo sperimentale. Non sono stati osservati sanguinamenti o infezioni prolungate nei siti chirurgici.

Valutazione della mortalità e dello stato generale
...

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Discussione

I risultati di questo studio indicano che sia l'approccio di puntura percutanea che quello trans-retroperitoneale sono efficaci nell'indurre la degenerazione del disco intervertebrale (IVDD) nei modelli di coniglio. In particolare, sulla base di una valutazione completa delle condizioni generali, della mortalità, della valutazione istopatologica, del dosaggio TUNEL e dei livelli sierici di TGF-β, il modello di puntura trans-retroperitoneale ha determinato alterazioni degenerative più ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 T Veterinary Maenetic Resonance lmaging(MRI)	NINGBO CHUANSHANJIA	CSJ-MR
Alcohol medical	LIRCON	20230107
Benzylpenicillin potassium	Jiangxi Keda Animal Pharmaceutical	140051251
Haemostatic forceps	SHINVA	20211239
Injection syringe	CONPUVON	20153151307
Knife blades	Hons Medincal	20210615
Medical absorbent cotton ball	Cofoe	20210006
Medical suture needle	Shanghai Xiaoyi Medical Devices	20192020430
Medullo-puncture needle	Yangzhou Jiangzhou Medical Devices	20190902	Used to puncture lumbar disc
Physiological saline	NeilMed	C1210504D2
Povidone iodine solution	Sichuan IJIS Medical Technology	20221209
Quasi-microbalance	Explorer
Rabbit dissection operating table	Zhenhua Biomedical	ZH-BXT-3Z
Shaver	AUX
Statistical analysis softeare	IBM	SPSS
Sterile gauze	Cofoe	20202140675
Surgical gloves	DR.LERSH	20172140028
Surgical knife	Hons Medinca	20210019
Surgical tweezers	SHINVA	20210233
USB-C data transmission line	KINI
White light photography microscope	Nikon	Eclipse Ci-L