Complemento Micro-Manager de código abierto para imágenes de visualización en vivo de dipolos fluorescentes

Resumen

Desarrollamos un complemento Micro-Manager de código abierto, que permite la observación en vivo de dipolos fluorescentes en un microscopio de iluminación estructurada. El plugin admite la observación de la orientación del dipolo 2D y 3D.

Resumen

La microscopía de polarización de fluorescencia (FPM) puede obtener imágenes de la posición y la orientación del dipolo de los fluoróforos. A pesar de los logros de la microscopía de polarización de fluorescencia de superresolución, su dependencia de la posterior adquisición dificulta la observación en tiempo real. La microscopía de iluminación estructurada polarizada (pSIM) ofrece imágenes de súper resolución de dipolos fluorescentes con una velocidad de imagen rápida y es adecuada para aplicaciones de células vivas. Desarrollamos una implementación de código abierto para la reconstrucción en tiempo real de imágenes de polarización y visualización de los dipolos fluorescentes. Además, ampliamos el método para lograr el mapeo de orientación 3D (3DOM), ampliando su utilidad para estudios biológicos complejos. Además, hemos presentado una introducción completa a la extensión de un microscopio SIM existente en imágenes de polarización y hemos proporcionado una guía de configuración detallada de Micro-Manager 2.0 para controlar el microscopio, lo que permite una vista previa en tiempo real de las imágenes polarizadas. Además, hemos proporcionado el código de MATLAB para la reconstrucción completa que abarca tanto pSIM como 3DOM. Esta guía completa tiene como objetivo ayudar a los principiantes a dominar rápidamente y comenzar fácilmente con las operaciones.

Introducción

La microscopía de polarización de fluorescencia (FPM) se ha convertido en una técnica potente para obtener imágenes simultáneas de la posición y la orientación dipolar de los fluoróforos, ofreciendo una visión profunda de las imágenes biológicas ^1,2. Al facilitar la observación de la dirección de las orientaciones de las biomoléculas, FPM revela la intrincada disposición de macromoléculas como la actina ^3,4,5, el microtúbulo⁵, la septina⁶, el filamento^{de ADN 7-9}, el complejo de poros nucleares¹⁰ y las proteínas de membrana¹¹. Sus capacidades de alta velocidad, no invasivas y compatibles con células vivas permiten el seguimiento de la dinámica de rotación molecular con alta resolución temporal^11,12. Cuando se integra con sondas de biofuerza, FPM no solo mapea magnitudes de fuerza a resolución subcelular, sino que también mide direcciones de fuerza, avanzando así en nuestra comprensión de los procesos biomecánicos al revelar la dirección de las fuerzas¹³.

En las últimas décadas, la microscopía de polarización de fluorescencia de superresolución ha experimentado una rápida evolución. Un avance notable en este campo es la microscopía de localización de orientación de una sola molécula, también denominada SMOLM, que puede localizar tanto la posición como la orientación de los fluoróforos, permitiendo así la localización multidimensional. La medición de la polarización en SMOLM se puede realizar utilizando la modulación de excitación de polarización⁷, la detección polarizada multicanal³ o la función de dispersión de puntos sensible a la polarización (PSF) ^diseñada14. A pesar de que SMOLM logra una resolución espacial del orden de decenas de nanómetros y mide la polarización de moléculas individuales, sufre de un tiempo de imagen prolongado. Esto se debe a los ciclos repetitivos de parpadeo y localización de fluoróforos, que plantean un desafío para las imágenes de velocidad de video y las aplicaciones de células vivas.

Por el contrario, la microscopía de iluminación estructurada polarizada (pSIM) ofrece una resolución espacial de aproximadamente hasta 100 nm, junto con la adquisición de información de polarización con el mismo conjunto de datos SIM. En particular, pSIM puede alcanzar velocidades de imagen de velocidad de video y es altamente compatible con imágenes de células vivas, sin requisitos estrictos para las moléculas fluorescentes. Recientemente, pSIM ha revelado con éxito la estructura del anillo de actina en el esqueleto periódico asociado a la membrana (MPS)⁵ y ha permitido el mapeo de superresolución de las fuerzas biológicas¹³.

Sin embargo, pSIM requiere la reconstrucción de la imagen posterior a la adquisición, lo que impide la visualización en tiempo real de los resultados de polarización. Este retraso dificulta la observación inmediata de los fenómenos biológicos, lo que impide a los investigadores capturar rápidamente los fenómenos biológicos de interés y realizar ajustes en tiempo real a las muestras y las condiciones de imagen. Para abordar esta limitación, hemos desarrollado una implementación de código abierto que facilita la adquisición de imágenes y la reconstrucción en tiempo real y la visualización de los resultados de polarización, basada en la plataforma ImageJ y Micro-Manager (https://github.com/KarlZhanghao/live-pol-imaging).

Además, mientras que pSIM se ha limitado a proporcionar información de polarización 2D en el plano, recientemente hemos ampliado sus capacidades para lograr el mapeo de orientación 3D utilizando casi el mismo equipo¹⁵, denominado mapeo de orientación 3D (3DOM). Este software de código abierto también proporciona el control, la reconstrucción y la visualización de 3DOM. Los módulos de reconstrucción y visualización también son compatibles con la aplicación de seguimiento de orientación de molécula única. Todas estas funcionalidades mejoran la utilidad de las imágenes de polarización en estudios biológicos complejos.

Protocolo

1. Ampliación de un microscopio de iluminación estructurada existente para la obtención de imágenes de polarización

1. Prepara un microscopio SIM.
   NOTA: Suponemos que los lectores tienen una cierta base en la configuración del microscopio y ya poseen un microscopio de luz estructurada. Si carece de experiencia relevante, consulte este documento, que proporciona una descripción detallada de cómo construir un microscopio SIM¹⁶. La unidad de control de polarización de "HWP+WQP+LCVR" puede ser sustituida por una placa de onda de vórtice de pizza en nuestro pSIM work⁵ o una placa de media onda de pizza¹⁷.
2. Mida las relaciones de extinción de polarización de tres direcciones de rayas cargando diferentes patrones en el modulador de luz espacial (SLM). Coloque y gire un polarizador justo después del objetivo y use un medidor de potencia para medir la potencia del láser. Para pSIM, gire la placa de onda para mantener la polarización s de tres direcciones con una relación de extinción > 10.
3. Para 3DOM, gire el HWP2 para mantener la polarización p de seis direcciones. Reemplace la máscara espacial SIM por la máscara espacial 3DOM para permitir el paso de haces de 1 orden de seis direcciones (consulte la Figura 1B).
   NOTA: se requiere polarización s en pSIM, mientras que la polarización p se requiere en 3DOM. La configuración detallada se incluye en otra parte para pSIM⁵ y 3DOM¹⁵.

2. Configuración de Micro-Manager

1. Descargue la versión Micro-Manager 2.0 desde el sitio web oficial, instale el software siguiendo las instrucciones.
2. Prepare los controladores de dispositivo y el software correspondientes para conectarse correctamente al sistema Micro-Manager. En este sistema de microscopio, utilice Micro-Manager para controlar la cámara, la etapa de traslación, el láser, la placa DAQ y el microscopio.
   NOTA: Los instrumentos compatibles se enumeran en https://micro-manager.org/Device_Support. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los instrumentos que se van a conectar. Instale los controladores o el software oficial/de soporte y conecte el instrumento a la computadora mediante un cable USB.
3. Añada los instrumentos a Micro-Manager mediante el Asistente de configuración de hardware.
   1. Abra el software y seleccione Ninguno en la lista desplegable inicial.
   2. Seleccionar dispositivos | Asistente de configuración de hardware... | Cree una nueva configuración y haga clic en Siguiente para ingresar a la página de configuración.
   3. Localice el complemento Camera / Laser / Stage / DAQ / Microscope en la lista desplegable de hardware y haga clic en Agregar | DE ACUERDO | Siguiente.
   4. Vaya a Seleccionar dispositivos predeterminados y elija la configuración del obturador automático. Establezca la cámara predeterminada, el obturador predeterminado y la etapa de enfoque predeterminada. Haga clic en Siguiente hasta que se alcance Guardar configuración y salida , y guarde el nombre del archivo de configuración. Haga clic en Finalizar.
4. Configuración común de plantillas
   1. Guarde una plantilla para el modo en vivo y el modo de ajuste de SIM.
   2. Configure el tiempo de exposición y el modo de disparo de la siguiente manera: elija Grupo ' +' en Ajustes de configuración, asigne un nombre al grupo como 'Modo', seleccione Modo de exposición y disparo, haga clic en Aceptar.
   3. Elija Preset '+' para agregar diferentes presets para el grupo 'Mode'. Asigne un nombre preestablecido "live" para los ajustes de exposición del modo en vivo y otro "SIM" para el modo SIM. Por ejemplo, en el modo 'en vivo', establezca el tiempo de exposición en 15 ms, mientras que para el modo de ajuste de SIM, establezca 10 ms para el tiempo de exposición y el modo de disparo es Estándar (Superposición).
      NOTA: Se incluye un archivo de configuración (MMConfig_psim_demo.cfg) en nuestro repositorio de código, que puede ser cargado directamente por Micro-Manager 2.0.

3. Calibración del sistema con perlas fluorescentes

1. Sumerja los cubreobjetos en etanol al 75%, enjuague los cubreobjetos 3 veces con agua desionizada (ddH₂O) y séquelos.
2. Agite las perlas fluorescentes de 100 nm (diluidas a 1:1.000 con solución salina tamponada con fosfato [PBS]) y pipetee la suspensión directamente sobre los cubreobjetos. Incubar durante 5-10 minutos en un ambiente oscuro, luego lavar suavemente con PBS.
3. Añada 20 μl de medio de montaje en el portaobjetos del microscopio y coloque el cubreobjetos sobre él, asegurándose de evitar cualquier burbuja. Mantenga la temperatura a 4 °C y mantenga el portaobjetos en la oscuridad, de modo que el portaobjetos con perlas fluorescentes de 100 nm esté preparado para la calibración del sistema.
4. Para pSIM, adquiera tres imágenes de las tres fases diferentes de las perlas fluorescentes. Un código de MATLAB personalizado (Bead_calib.m) toma las imágenes como entrada y genera dos imágenes de calibración (calib1.tif, calib2.tif) para su posterior análisis.
   NOTA: Como se demostró anteriormente⁵, el experimento pSIM se puede realizar en la mayoría de los sistemas comerciales. En los microscopios SIM caseros o comerciales, se requiere una calibración del sistema para eliminar el error de medición de los dipolos fluorescentes, causado por la iluminación no uniforme durante tres direcciones de patrón. El experimento de calibración asume la polarización isotrópica de las perlas fluorescentes y solo requiere las imágenes en bruto durante la adquisición de SIM. El procedimiento de calibración detallado está incluido en nuestro trabajo original⁵. La salida de dos imágenes de calibración calib1.tif y calib2.tif es necesaria para la reconstrucción de pSIM, que indica la energía de iluminación píxel a píxel de la dirección del patrón 2; 3 se refiere a la dirección del patrón 1.

4. Preparación de la muestra: actina en células fijas

1. Sumerja los cubreobjetos en etanol al 75%, enjuague los cubreobjetos 3 veces con ddH₂O. Coloque los cubreobjetos en una placa de cultivo celular de seis pocillos.
2. Cultivo de células U2OS (línea celular ATCC HTB-96) en Medio de Águila Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (v/v) de Suero Fetal Bovino (FBS) a 37 °C y 5% de CO₂ en cubreobjetos hasta alcanzar aproximadamente el 75% de confluencia.
3. Lave suavemente las celdas 3 veces con PBS. Para la fijación celular, aplique paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente. Después de la fijación, lave las células 3 veces nuevamente con PBS.
4. Para mejorar la permeabilidad de la membrana, trate las células con Triton X-100 al 0,1% en PBS durante 5 minutos, luego lave las células 3 veces con PBS.
5. Disuelva la faloidina fluorescente con 150 μL de DMSO para la solución madre (66 μM). Prepare la solución de trabajo del colorante Phalloidin diluyendo 5 μL de la solución madre en 995 μL de PBS. Incubar las células en la oscuridad con una solución de trabajo de colorante de faloidina a temperatura ambiente durante ~ 1 h. Lave las celdas durante 3 x 3 minutos con PBS.
6. Añada 20 μL de medio de montaje en el portaobjetos del microscopio. Coloque con cuidado el cubreobjetos en la corredera sin que queden burbujas. Guarde el portaobjetos a 4 °C y manténgalo en un lugar oscuro.

5. Preparación de la muestra: λ-DNA in vitro

1. Disuelva 0,5 g de polimetilmetacrilato en 10 mL de materiales base para dentaduras postizas. Después de una disolución completa, aplique uniformemente la solución sobre la superficie del portaobjetos y luego espere a que se evapore para formar una película.
2. Diluir 0,3 μL de λ-ADN y 32 μL de 1.000x Tinción de ácido nucleico SYTOX Orange en 968 μL de PBS. Agregue 1 μL de la solución preparada al portaobjetos y deje que se seque.
3. Selle el cubreobjetos en el portaobjetos con el soporte para proteger y preservar la muestra. Guarde el portaobjetos a 4 °C en un ambiente oscuro.

6. Imágenes

1. Coloque el cubreobjetos en el portamuestras y ajústelo al plano focal en el modo en vivo. Selecciona un ROI de 512 x 512 píxeles y ajusta el tiempo de exposición y la intensidad del láser.
2. Abra el software de control independiente del modulador de luz espacial y elija la ruta de secuencia del patrón de iluminación adecuada para pSIM / 3DOM o modo en vivo.
   NOTA: Para pSIM, el patrón de iluminación incluye tres ángulos de polarización diferentes y tres fases diferentes. Para 3DOM, el patrón de iluminación incluye seis ángulos de polarización diferentes.
3. Seleccione el modo de captura de SIM , seleccione Multi-D Acq., elija Puntos de tiempo y configure el Recuento (9 o 6 imágenes para pSIM o 3DOM) y el Intervalo (0 ms) en la ventana abierta. ¡Haz clic en Adquirir!
4. Haga clic en TriggerSLM.bsh (se incluye un archivo de configuración en nuestro repositorio de código), la tarjeta de adquisición MyDaq activa el modulador de luz espacial para tomar las imágenes.

7. Plugin de visualización en vivo de pSIM y 3DOM

1. Configure la FakeCamera y la ruta de acceso a la imagen: cargue el scrip (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) haciendo clic en Dispositivos | Cargar configuración de hardware.... Configurar el directorio local de imágenes en Dispositivos | Explorador de propiedades de dispositivos... | Máscara de trayectoria de la cámara (Figura 2A-C).
   NOTA: La parte de adquisición del script depende de la configuración del hardware, por lo que hemos proporcionado una versión (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) utilizando el dispositivo FakeCamera para leer imágenes locales en el disco duro para su demostración. Los usuarios pueden realizar cambios en nuestra versión. Recuerde cambiar la ruta de lectura de la imagen (máscara Camera-Path).
2. Configure el Panel de acceso rápido haciendo clic en Herramientas | Panel de acceso rápido | Crear nuevo panel. Haga clic en el icono de Configuración en la esquina inferior izquierda, fármaco 'Ejecutar script' en la parte superior, que puede cargar el 'psim.bsh' y '3DOM.bsh' (Figura 2D) .
   NOTA: El sistema de panel de acceso rápido permite a los usuarios crear ventanas personalizadas y acceder fácilmente a los controles de Micro-Manager, que es lo que se necesita con mayor frecuencia. También se pueden agregar canales 'Live', 'Snap' u otros, como se muestra en la Figura 2D.
3. Tomando pSIM como ejemplo, realice la reconstrucción de la imagen de polarización en tiempo real haciendo clic en 'psim.bsh'; observe las imágenes reconstruidas en tiempo real con resultados de polarización (Figura 2E). Recuerde cambiar la ruta de las imágenes de calibración en el archivo 'psim.bsh' (calibPath = " ruta al archivo de imágenes de calibración").
   NOTA: El complemento de visualización en vivo es un script de infierno (psim.bsh y 3DOM.bsh), que se puede ejecutar en el Panel de script. El plugin adquiere nueve imágenes para pSIM o seis imágenes para 3DOM y calcula los resultados del mapeo de orientación en función de las imágenes de campo amplio. Las imágenes de mapeo de orientación se muestran para proporcionar información de polarización en tiempo real, lo que facilita la inspección inmediata, a pesar de su baja resolución.

8. Análisis de datos con reconstrucción de superresolución

1. Instale MATLAB R2019b desde el sitio web (consulte la Tabla de materiales).
2. Abra el software; para la reconstrucción de pSIM, obtenga nueve imágenes, que constan de tres fases diferentes para cada uno de los tres ángulos de orientación. Asegúrese de que los nombres de las nueve imágenes estén de '1.tif' a '9.tif', colóquelos en el archivo llamado 'Input' y ejecute el programa llamado 'PSIM.m'. Observe la imagen de campo amplio, la imagen SIM y la imagen pSIM reconstruidas con la rueda de colores.
   NOTA: La reconstrucción de pSIM necesita dos pasos: un paso de SIM y un paso PM. Los datos se analizan mediante un programa de MATLAB escrito a medida para facilitar la depuración. Obtenga el código de reconstrucción de la carpeta 'reconsr' en GitHub.
3. Para 3DOM, capture seis figuras de direcciones de polarización diferentes. Combine las seis imágenes, asigne al archivo resultante el nombre 'Raw_data.tif' y ejecute el programa llamado 'Recon_3DOM.m'. Observe la imagen de campo amplio reconstruida y la imagen 3DOM con resultados acimutales y los resultados de ángulo polar.
   NOTA: Durante el proceso de reconstrucción, puede ocurrir un error: no se reconoce la función o la variable 'bfopen'. 'bfopen' es una función de la biblioteca de bioformatos y se utiliza habitualmente para abrir y leer archivos de imagen. Escriba addpath ('path_to_bioformats_toolbox') en la ventana de comandos de MATLAB. Reemplace 'path_to_bioformats_toolbox' por la ruta de la carpeta de la biblioteca real. También agregamos la dependencia Bio-Formats al repositorio de GitHub.

Resultados

El método pSIM se puede realizar en microscopios SIM en función de la interferencia utilizando rayos láser polarizados s. La interferencia de polarización s es el tipo de SIM más utilizado y genera franjas de iluminación de alto contraste. El prototipo académico de una configuración de microscopio está incluido en el trabajo original de pSIM⁵. Brevemente presentado en la Figura 1, un modulador...

Discusión

En nuestro estudio, desarrollamos un complemento que permite la vista previa en tiempo real de dos técnicas de imagen de polarización, pSIM y 3DOM. Ambas tecnologías se pueden realizar en un sistema SIM existente con ligeras modificaciones. Hemos proporcionado los pasos detallados para instalar el microscopio pSIM y 3DOM y configurar Micro-Manager para controlar el microscopio y demostrar cómo obtener los resultados de polarización de vista en vivo. Los resultados experimentales inc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nm Fluorescent beads	Invitrogen	F8801
4% Formaldehyde solution	Invitrogen	R37814
Camera	Tucsen	Dhyana 400BSI V3	https://www.tucsen.com/download-software/
Denture base materials (Type I Thermally setting type, liquid)	New Century Dental	N/A
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Gibco	C11995500BT
Eclipse TE2000 Inverted Microscope	Nikon	TE2000 E
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141C
MATLAB R2019b	MathWorks	Version R2019b	https://ww2.mathworks.cn/downloads/
MetroCon V4.0	Kopin	Version 4.0	Software of Spatial light modulator
Micro-Manager 2.0	μΜanager	Version 2.0	Download Micro-Manager Latest Release
MS-2000 XYZ Automated Stage	Applied Scientific Instrumentation	MIM3	https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/
myDAQ	National Instruments	781325-01	Software and Driver Downloads - NI
OBIS 561 nm LS 20 mW Laser	Coherent	1325777
Phalloidin-AF568	Invitrogen	A12380
Phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
Poly Methyl Methacrylate	Solarbio	M9810
ProLong Diamond	Invitrogen	P36980
Spatial light modulator	Kopin	SXGA-12
SYTOX orange nucleic acid stain	Invitrogen	S11368
Triton X-100	Invitrogen	HFH10
Trypsin	Gibco	25200056
λ-DNA	Invitrogen	S11368