Plug-in Micro-Manager open source per l'imaging live-view di dipoli fluorescenti

Riepilogo

Abbiamo sviluppato un plug-in Micro-Manager open source, che consente l'osservazione in tempo reale di dipoli fluorescenti su un microscopio a illuminazione strutturata. Il plug-in supporta l'osservazione dell'orientamento del dipolo 2D e 3D.

Abstract

La microscopia a polarizzazione a fluorescenza (FPM) è in grado di visualizzare la posizione e l'orientamento del dipolo dei fluorofori. Nonostante i risultati della microscopia a polarizzazione a fluorescenza a super-risoluzione, la loro dipendenza dalla post-acquisizione ostacola l'osservazione in tempo reale. La microscopia a illuminazione strutturata polarizzata (pSIM) offre immagini a super-risoluzione di dipoli fluorescenti con un'elevata velocità di imaging ed è particolarmente adatta per applicazioni su cellule vive. Abbiamo sviluppato un'implementazione open-source per la ricostruzione in tempo reale delle immagini di polarizzazione e la visualizzazione dei dipoli fluorescenti. Inoltre, abbiamo esteso il metodo per ottenere la mappatura dell'orientamento 3D (3DOM), ampliandone l'utilità per studi biologici complessi. Inoltre, abbiamo presentato un'introduzione completa all'estensione di un microscopio SIM esistente sull'imaging a polarizzazione e fornito una guida dettagliata alla configurazione di Micro-Manager 2.0 per controllare il microscopio, consentendo l'anteprima in tempo reale dell'imaging polarizzato. Inoltre, abbiamo fornito il codice MATLAB per la ricostruzione completa che comprende sia pSIM che 3DOM. Questa guida completa ha lo scopo di aiutare i principianti a padroneggiare rapidamente e iniziare facilmente le operazioni.

Introduzione

La microscopia a polarizzazione a fluorescenza (FPM) è emersa come una potente tecnica per l'imaging simultaneo sia della posizione che dell'orientamento del dipolo dei fluorofori, offrendo approfondimenti sull'imaging biologico ^1,2. Facilitando l'osservazione della direzione degli orientamenti delle biomolecole, FPM svela l'intricata disposizione di macromolecole come l'actina ^3,4,5, il microtubulo⁵, la septina⁶, il filamento di DNA ^7-9, il complesso dei pori nucleari¹⁰ e le proteine di membrana¹¹. Le sue capacità ad alta velocità, non invasive e compatibili con le cellule vive consentono il tracciamento delle dinamiche di rotazione molecolare con un'elevata risoluzione temporale^11,12. Quando integrato con le sonde bioforce, l'FPM non solo mappa le grandezze della forza a risoluzione subcellulare, ma misura anche le direzioni delle forze, facendo così progredire la nostra comprensione dei processi biomeccanici rivelando la direzione delle forze¹³.

Negli ultimi decenni, la microscopia a polarizzazione a fluorescenza a super-risoluzione ha subito una rapida evoluzione. Un notevole progresso in questo campo è la microscopia di localizzazione con orientamento a singola molecola, chiamata anche SMOLM, in grado di localizzare sia la posizione che l'orientamento dei fluorofori, consentendo così la localizzazione multidimensionale. La misurazione della polarizzazione in SMOLM può essere eseguita utilizzando la modulazione di eccitazione della polarizzazione⁷, il rilevamento polarizzato multicanale³ o la funzione di diffusione del punto sensibile alla polarizzazione (PSF)¹⁴. Nonostante SMOLM raggiunga una risoluzione spaziale dell'ordine di decine di nanometri e misuri la polarizzazione di singole molecole, soffre di un tempo di imaging prolungato. Ciò è dovuto ai cicli ripetitivi di lampeggio e localizzazione dei fluorofori, che rappresentano una sfida per l'imaging a velocità video e le applicazioni su cellule vive.

Al contrario, la microscopia a illuminazione strutturata polarizzata (pSIM) offre una risoluzione spaziale di circa 100 nm, insieme all'acquisizione di informazioni di polarizzazione con lo stesso set di dati SIM. In particolare, la pSIM è in grado di raggiungere velocità di imaging a velocità video ed è altamente compatibile con l'imaging di cellule vive, senza requisiti rigorosi per le molecole fluorescenti. Recentemente, la pSIM ha rivelato con successo la struttura dell'anello di actina nello scheletro periodico associato alla membrana (MPS)⁵ e ha permesso la mappatura a super-risoluzione delle forze biologiche¹³.

Tuttavia, la pSIM richiede la ricostruzione dell'immagine post-acquisizione, che impedisce la visualizzazione in tempo reale dei risultati della polarizzazione. Questo ritardo ostacola l'osservazione immediata dei fenomeni biologici, impedendo ai ricercatori di catturare rapidamente i fenomeni biologici di interesse e di apportare modifiche in tempo reale ai campioni e alle condizioni di imaging. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un'implementazione open source che facilita l'acquisizione delle immagini e la ricostruzione e la visualizzazione in tempo reale dei risultati della polarizzazione, basata sulla piattaforma ImageJ e Micro-Manager (https://github.com/KarlZhanghao/live-pol-imaging).

Inoltre, mentre la pSIM si è limitata a fornire informazioni di polarizzazione 2D nel piano, abbiamo recentemente esteso le sue capacità per ottenere la mappatura dell'orientamento 3D utilizzando quasi la stessa apparecchiatura¹⁵, definita mappatura dell'orientamento 3D (3DOM). Questo software open source fornisce anche il controllo, la ricostruzione e la visualizzazione di 3DOM. I moduli di ricostruzione e visualizzazione sono inoltre compatibili con l'applicazione di tracciamento dell'orientamento di singole molecole. Tutte queste funzionalità migliorano l'utilità dell'imaging a polarizzazione in studi biologici complessi.

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Protocollo

1. Estensione di un microscopio a illuminazione strutturata esistente per l'imaging a polarizzazione

1. Prepara un microscopio SIM.
   NOTA: Partiamo dal presupposto che i lettori abbiano una certa base nella configurazione del microscopio e possiedano già un microscopio ottico strutturato. Se non si ha esperienza in materia, fare riferimento a questo documento, che fornisce una descrizione dettagliata di come costruire un microscopio SIM¹⁶. L'unità di controllo della polarizzazione di "HWP+WQP+LCVR" può essere sostituita da una piastra a onda vortice per pizza nel nostro pSIM work⁵ o da una piastra a mezza onda per pizza¹⁷.
2. Misura i rapporti di estinzione della polarizzazione di tre direzioni di strisce caricando diversi modelli sul modulatore di luce spaziale (SLM). Posiziona e ruota un polarizzatore subito dopo l'obiettivo e usa un misuratore di potenza per misurare la potenza del laser. Per pSIM, ruotare la piastra d'onda per mantenere la polarizzazione s di tre direzioni con rapporto di estinzione > 10.
3. Per 3DOM, ruotare l'HWP2 per mantenere la polarizzazione p di sei direzioni. Sostituire la maschera spaziale SIM con la maschera spaziale 3DOM per consentire il passaggio di fasci di 1 ordine di sei direzioni (vedere la Figura 1B).
   NOTA: la polarizzazione s è richiesta in pSIM mentre la polarizzazione p è richiesta in 3DOM. La configurazione dettagliata è inclusa altrove per pSIM⁵ e 3DOM¹⁵.

2. Configurazione di Micro-Manager

1. Scarica la versione Micro-Manager 2.0 dal sito ufficiale, installa il software seguendo le istruzioni.
2. Preparare i driver di periferica e il software corrispondenti per connettersi correttamente al sistema Micro-Manager. In questo sistema di microscopio, è possibile utilizzare Micro-Manager per controllare la fotocamera, il tavolino traslazionale, il laser, la scheda DAQ e il microscopio.
   NOTA: Gli strumenti supportati sono elencati in https://micro-manager.org/Device_Support. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli sugli strumenti da collegare. Installare i driver o il software ufficiale/di supporto e collegare lo strumento al computer utilizzando un cavo USB.
3. Aggiungere gli strumenti a Micro-Manager utilizzando la procedura guidata di configurazione hardware.
   1. Apri il software e seleziona Nessuno dall'elenco a discesa iniziale.
   2. Seleziona dispositivi | Configurazione guidata hardware... | Creare una nuova configurazione e fare clic su Avanti per accedere alla pagina di configurazione.
   3. Individuare il plug-in Fotocamera/Laser/Tavolino/DAQ/microscopio nell'elenco a discesa dell'hardware e fare clic su Aggiungi | Va bene | Prossimo.
   4. Vai a Seleziona dispositivi predefiniti e scegli l'impostazione dell'otturatore automatico. Impostare la Fotocamera predefinita, l'otturatore predefinito e la fase di messa a fuoco predefinita. Fare clic su Avanti fino a raggiungere Salva configurazione ed esci e salvare il nome del file di configurazione. Fare clic su Fine.
4. Impostazioni comuni dei modelli
   1. Salva un modello per la modalità live e la modalità SIM snap.
   2. Impostare il tempo di esposizione e la modalità di attivazione come segue: scegliere Gruppo ' +' nelle impostazioni di configurazione, denominare il nome del gruppo come 'Modalità', selezionare Modalità esposizione e attivazione, fare clic su OK.
   3. Scegli Preset '+' per aggiungere diversi preset per il gruppo 'Modalità'. Assegna un nome a un preset "live" per le impostazioni di esposizione della modalità live e a un altro "SIM" per la modalità SIM. Ad esempio, in modalità 'live', impostare il tempo di esposizione su 15 ms, mentre per la modalità SIM snap, impostare 10 ms per il tempo di esposizione e la modalità di attivazione è Standard (Overlap).
      NOTA: Nel nostro repository di codice è incluso un file di configurazione (MMConfig_psim_demo.cfg), che può essere caricato direttamente da Micro-Manager 2.0.

3. Calibrazione del sistema con perline fluorescenti

1. Immergere i vetrini coprioggetti in etanolo al 75%, sciacquare i vetrini 3 volte con acqua deionizzata (ddH₂O) e asciugarli.
2. Agitare le perle fluorescenti da 100 nm (diluite a 1:1.000 con soluzione salina tamponata con fosfato [PBS]) e pipettare la sospensione direttamente sui vetrini. Incubare per 5-10 minuti in un ambiente buio, quindi lavare delicatamente con PBS.
3. Aggiungere 20 μl di terreno di montaggio sul vetrino del microscopio e posizionare il vetrino coprioggetti su di esso, assicurandosi di evitare bolle. Mantenere la temperatura a 4 °C e tenere il vetrino al buio, in modo che il vetrino con perline fluorescenti da 100 nm sia preparato per la calibrazione del sistema.
4. Per pSIM, acquisire tre immagini delle tre diverse fasi delle microsfere fluorescenti. Un codice MATLAB personalizzato (Bead_calib.m) prende le immagini come input e produce due immagini di calibrazione (calib1.tif, calib2.tif) per ulteriori analisi.
   NOTA: come dimostrato in precedenza⁵, l'esperimento pSIM può essere eseguito sulla maggior parte dei sistemi commerciali. Sia sui microscopi SIM costruiti in casa che in commercio, la calibrazione del sistema è necessaria per eliminare l'errore di misurazione dei dipoli fluorescenti, causato dall'illuminazione non uniforme durante tre direzioni del pattern. L'esperimento di calibrazione presuppone la polarizzazione isotropa delle sfere fluorescenti e richiede solo le immagini grezze durante l'acquisizione della SIM. La procedura di calibrazione dettagliata è inclusa nel nostro lavoro originale⁵. L'output di due immagini di calibrazione calib1.tif e calib2.tif è necessario per la ricostruzione pSIM, che indica l'energia di illuminazione pixelwise della direzione del pattern 2; 3 si riferisce alla direzione del modello 1.

4. Preparazione del campione: actina in cellule fissate

1. Immergere i vetrini coprioggetti in etanolo al 75%, sciacquare i vetrini coprioggetti 3 volte con ddH₂O. Posizionare i vetrini coprioggetti in una piastra di coltura cellulare a sei pozzetti.
2. Coltura di cellule U2OS (linea cellulare ATCC HTB-96) nel terreno di Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco integrate con il 10% (v/v) di siero fetale bovino (FBS) a 37 °C e il 5% di CO₂ su vetrini coprioggetti fino a raggiungere circa il 75% di confluenza.
3. Lavare delicatamente le celle 3 volte con PBS. Per la fissazione cellulare, applicare paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo il fissaggio, lavare nuovamente le celle 3 volte con PBS.
4. Per migliorare la permeabilità della membrana, trattare le cellule con Triton X-100 allo 0,1% in PBS per 5 minuti, quindi lavare le cellule 3 volte con PBS.
5. Sciogliere la falloidina fluorescente con 150 μL di DMSO per la soluzione madre (66μM). Preparare la soluzione di lavoro del colorante falloidina diluendo 5 μl della soluzione madre in 995 μl di PBS. Incubare le cellule al buio con la soluzione di lavoro del colorante falloidina a temperatura ambiente per ~1 ora. Lavare le celle per 3 x 3 minuti con PBS.
6. Aggiungere 20 μl di terreno di montaggio sul vetrino del microscopio. Posizionare con cautela il vetrino coprioggetti sul vetrino senza bolle. Conservare il vetrino a 4 °C e conservarlo in un luogo buio.

5. Preparazione del campione: λ-DNA in vitro

1. Sciogliere 0,5 g di polimetilmetacrilato in 10 mL di materiali di base per protesi. Dopo un'accurata dissoluzione, applicare uniformemente la soluzione sulla superficie del vetrino, quindi attendere che evapori per formare un film.
2. Diluire 0,3 μl di λ-DNA e 32 μl di 1.000x SYTOX Orange Nucleic Acid Stain in 968 μl di PBS. Aggiungere 1 μl della soluzione preparata al vetrino e lasciarlo asciugare.
3. Sigillare il vetrino coprioggetti sul vetrino con il montante per proteggere e preservare il campione. Conservare il vetrino a 4 °C in un ambiente buio.

6. Imaging

1. Posizionare il vetrino coprioggetti sul portacampioni e regolarlo sul piano focale in modalità live. Seleziona un ROI di 512 x 512 pixel e regola il tempo di esposizione e l'intensità del laser.
2. Aprire il software di controllo indipendente del modulatore di luce spaziale e scegliere il percorso di sequenza del modello di illuminazione appropriato per pSIM / 3DOM o modalità live.
   NOTA: Per pSIM, il modello di illuminazione include tre diversi angoli di polarizzazione e tre diverse fasi. Per 3DOM, il modello di illuminazione include sei diversi angoli di polarizzazione.
3. Selezionare la modalità di acquisizione SIM , selezionare Multi-D Acq., scegliere Punti temporali e impostare il conteggio (9 o 6 immagini per pSIM o 3DOM) e l'intervallo (0 ms) nella finestra aperta. Fai clic su Acquisisci!
4. Fare clic su TriggerSLM.bsh (un file di configurazione è incluso nel nostro repository di codice), la scheda di acquisizione MyDaq attiva il modulatore di luce spaziale per scattare le foto.

7. Plug-in di visualizzazione dal vivo di pSIM e 3DOM

1. Configura la FakeCamera e il percorso di accesso all'immagine: carica lo scrip (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) cliccando su Dispositivi | Carica configurazione hardware.... Configura la directory locale delle immagini in Dispositivi | Dispositivi Proprietà Browser... | Maschera del percorso della telecamera (Figura 2A-C).
   NOTA: La parte di acquisizione dello script dipende dalla configurazione hardware, quindi abbiamo fornito una versione (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) utilizzando il dispositivo FakeCamera per leggere le immagini locali sul disco rigido per la dimostrazione. Gli utenti possono apportare modifiche nella nostra versione. Ricordarsi di modificare il percorso di lettura dell'immagine (Camera-Path mask).
2. Impostare il pannello di accesso rapido facendo clic su Strumenti | Pannello di accesso rapido | Crea un nuovo pannello. Fare clic sull'icona Impostazioni nell'angolo in basso a sinistra, utilizzare 'Run Script' nella parte superiore, che può caricare 'psim.bsh' e '3DOM.bsh' (Figura 2D).
   NOTA: Il sistema Quick Access Panel consente agli utenti di creare finestre personalizzate e di accedere facilmente ai controlli in Micro-Manager, che è necessario più frequentemente. È inoltre possibile aggiungere 'Live', 'Snap' o altri canali, come mostrato nella Figura 2D.
3. Prendendo come esempio pSIM, eseguire la ricostruzione dell'immagine di polarizzazione in tempo reale facendo clic su 'psim.bsh'; osservare le immagini ricostruite in tempo reale con i risultati della polarizzazione (Figura 2E). Ricordarsi di modificare il percorso delle immagini di calibrazione nel file 'psim.bsh' (calibPath = " percorso del file delle immagini di calibrazione").
   NOTA: Il plugin live-view è uno script beanshell (psim.bsh e 3DOM.bsh), che può essere eseguito nel pannello degli script. Il plug-in acquisisce nove immagini per pSIM o sei immagini per 3DOM e calcola i risultati della mappatura dell'orientamento in base alle immagini a campo largo. Le immagini di mappatura dell'orientamento vengono visualizzate per fornire informazioni sulla polarizzazione in tempo reale, che facilitano l'ispezione immediata, nonostante la sua bassa risoluzione.

8. Analisi dei dati con ricostruzione a super-risoluzione

1. Installa MATLAB R2019b dal sito Web (consulta la Tabella dei materiali).
2. Apri il software; per la ricostruzione pSIM, ottenere nove immagini, composte da tre diverse fasi per ciascuno dei tre angoli di orientamento. Assicurati che i nomi delle nove immagini siano compresi tra "1.tif" e "9.tif", inseriscili nel file denominato "Input" ed esegui il programma denominato "PSIM.m". Osservare l'immagine Wide-Field ricostruita, l'immagine SIM e l'immagine pSIM con la ruota dei colori.
   NOTA: La ricostruzione per pSIM richiede due passaggi: un passaggio SIM e un passaggio PM. I dati vengono analizzati da un programma MATLAB scritto su misura per semplificare il debug. Ottenere il codice di ricostruzione dalla cartella 'reconsr' in GitHub.
3. Per 3DOM, cattura sei diverse cifre di direzioni di polarizzazione. Unisci le sei immagini insieme, denomina il file risultante "Raw_data.tif" ed esegui il programma denominato "Recon_3DOM.m". Osservare l'immagine a campo largo ricostruita e l'immagine 3DOM con i risultati azimutali e i risultati dell'angolo polare.
   NOTA: Durante il processo di ricostruzione, potrebbe verificarsi un errore '--'function o la variabile 'bfopen' non viene riconosciuta'. 'bfopen' è una funzione della libreria bio-formats ed è comunemente utilizzata per aprire e leggere file immagine. Immettere addpath ('path_to_bioformats_toolbox') nella finestra di comando di MATLAB. Sostituisci "path_to_bioformats_toolbox" con il percorso effettivo della cartella della libreria. Abbiamo anche aggiunto la dipendenza Bio-Formats al repository GitHub.

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Risultati

Il metodo pSIM può essere eseguito su microscopi SIM in base all'interferenza utilizzando raggi laser polarizzati s. L'interferenza di polarizzazione s è il tipo di SIM più utilizzato e genera strisce di illuminazione ad alto contrasto. Il prototipo accademico di una configurazione di microscopio è incluso nel lavoro originale di pSIM⁵. Brevemente introdotto nella Figura 1, un modulatore di luce sp...

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Discussione

Nel nostro studio, abbiamo sviluppato un plugin che consente l'anteprima in tempo reale di due tecniche di imaging a polarizzazione, pSIM e 3DOM. Entrambe le tecnologie possono essere eseguite in un sistema SIM esistente con lievi modifiche. Abbiamo fornito i passaggi dettagliati per installare il microscopio pSIM e 3DOM e configurare Micro-Manager per controllare il microscopio e dimostrare come ottenere i risultati della polarizzazione live-view. I risultati sperimentali includono il f...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nm Fluorescent beads	Invitrogen	F8801
4% Formaldehyde solution	Invitrogen	R37814
Camera	Tucsen	Dhyana 400BSI V3	https://www.tucsen.com/download-software/
Denture base materials (Type I Thermally setting type, liquid)	New Century Dental	N/A
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Gibco	C11995500BT
Eclipse TE2000 Inverted Microscope	Nikon	TE2000 E
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141C
MATLAB R2019b	MathWorks	Version R2019b	https://ww2.mathworks.cn/downloads/
MetroCon V4.0	Kopin	Version 4.0	Software of Spatial light modulator
Micro-Manager 2.0	μΜanager	Version 2.0	Download Micro-Manager Latest Release
MS-2000 XYZ Automated Stage	Applied Scientific Instrumentation	MIM3	https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/
myDAQ	National Instruments	781325-01	Software and Driver Downloads - NI
OBIS 561 nm LS 20 mW Laser	Coherent	1325777
Phalloidin-AF568	Invitrogen	A12380
Phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
Poly Methyl Methacrylate	Solarbio	M9810
ProLong Diamond	Invitrogen	P36980
Spatial light modulator	Kopin	SXGA-12
SYTOX orange nucleic acid stain	Invitrogen	S11368
Triton X-100	Invitrogen	HFH10
Trypsin	Gibco	25200056
λ-DNA	Invitrogen	S11368