Floresan Dipollerin Canlı Görüntü Görüntülemesi için Açık Kaynaklı Mikro Yönetici Eklentisi

Özet

Yapılandırılmış bir aydınlatma mikroskobu üzerinde floresan dipollerin canlı görüntü gözlemini sağlayan açık kaynaklı bir Micro-Manager eklentisi geliştirdik. Eklenti, hem 2D hem de 3D dipol oryantasyonunun gözlemlenmesini destekler.

Özet

Floresan polarizasyon mikroskobu (FPM), floroforların konumunu ve dipol oryantasyonunu görüntüleyebilir. Süper çözünürlüklü floresan polarizasyon mikroskobunun başarılarına rağmen, edinme sonrasına güvenmeleri gerçek zamanlı gözlemi engelliyor. Polarize yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (pSIM), floresan dipollerin hızlı görüntüleme hızıyla süper çözünürlüklü görüntülemesini sunar ve canlı hücre uygulamaları için çok uygundur. Polarizasyon görüntülerinin gerçek zamanlı rekonstrüksiyonu ve floresan dipollerin görüntülenmesi için açık kaynaklı bir uygulama geliştirdik. Ek olarak, 3B oryantasyon haritalaması (3DOM) elde etmek için yöntemi genişlettik ve karmaşık biyolojik çalışmalar için faydasını genişlettik. Ayrıca, polarizasyon görüntülemede mevcut bir SIM mikroskobunun genişletilmesine kapsamlı bir giriş sunduk ve mikroskobu kontrol etmek için polarize görüntülemenin gerçek zamanlı önizlemesini sağlayan ayrıntılı bir Micro-Manager 2.0 yapılandırma kılavuzu sağladık. Ek olarak, hem pSIM hem de 3DOM'u kapsayan tam yeniden yapılandırma için MATLAB kodunu sağladık. Bu kapsamlı kılavuz, yeni başlayanlara hızlı bir şekilde ustalaşma ve işlemlere kolayca başlama konusunda yardımcı olmayı amaçlamaktadır.

Giriş

Floresan polarizasyon mikroskobu (FPM), floroforların hem konumunu hem de dipol oryantasyonunu aynı anda görüntülemek için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır ve biyolojik görüntülemeye ilişkin derin bilgiler sunar ^1,2. FPM, biyomoleküllerin yönelimlerinin yön gözlemini kolaylaştırarak, aktin ^3,4,5, mikrotübül⁵, septin⁶, DNA filamenti ^7-9, nükleer gözenek kompleksi¹⁰ ve zar proteinleri¹¹ gibi makro moleküllerin karmaşık düzenini ortaya çıkarır. Yüksek hızlı, non-invaziv ve canlı hücre uyumlu yetenekleri, yüksek zamansal çözünürlük^11,12 ile moleküler rotasyon dinamiklerinin izlenmesine olanak tanır. Biyokuvvet probları ile entegre edildiğinde, FPM sadece hücre altı çözünürlükte kuvvet büyüklüklerini haritalamakla kalmaz, aynı zamanda kuvvet yönlerini de ölçer, böylece kuvvetlerin yönünü ortaya çıkararak biyomekanik süreçler hakkındaki anlayışımızı geliştirir¹³.

Son yıllarda, süper çözünürlüklü floresan polarizasyon mikroskobu hızlı bir evrim geçirdi. Bu alanda kayda değer bir gelişme, floroforların hem konumunu hem de yönelimini lokalize edebilen ve böylece çok boyutlu lokalizasyonu mümkün kılan SMOLM olarak da adlandırılan tek molekül oryantasyon lokalizasyon mikroskobudur. SMOLM'de polarizasyon ölçümü, polarizasyon uyarma modülasyonu⁷, çok kanallı polarize algılama³ veya tasarlanmış polarizasyona duyarlı nokta yayılma fonksiyonu (PSF)¹⁴ kullanılarak gerçekleştirilebilir. SMOLM, onlarca nanometre mertebesinde uzamsal çözünürlüğe ulaşmasına ve tek moleküllerin polarizasyonunu ölçmesine rağmen, uzun görüntüleme süresinden muzdariptir. Bunun nedeni, video hızında görüntüleme ve canlı hücre uygulamaları için bir zorluk teşkil eden tekrarlayan florofor yanıp sönme ve lokalizasyon döngüleridir.

Buna karşılık, polarize yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (pSIM), aynı SIM veri seti ile polarizasyon bilgilerinin elde edilmesiyle birlikte yaklaşık 100 nm'ye kadar uzamsal çözünürlük sunar. Özellikle, pSIM, video hızında görüntüleme hızlarına ulaşabilir ve floresan moleküller üzerinde katı gereksinimler olmaksızın canlı hücre görüntüleme ile son derece uyumludur. Son zamanlarda, pSIM, zarla ilişkili periyodik iskeletteki (MPS)⁵ aktin halkası yapısını başarıyla ortaya çıkardı ve biyolojik kuvvetlerin süper çözünürlüklü haritalanmasını^{sağladı 13}.

Bununla birlikte, pSIM, polarizasyon sonuçlarının gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini önleyen çekim sonrası görüntü rekonstrüksiyonu gerektirir. Bu gecikme, biyolojik fenomenin anında gözlemlenmesini engelleyerek, araştırmacıların ilgilenilen biyolojik olayları hızlı bir şekilde yakalamasını ve numunelerde ve görüntüleme koşullarında gerçek zamanlı ayarlamalar yapmasını engeller. Bu sınırlamayı ele almak için, ImageJ ve Micro-Manager platformuna (https://github.com/KarlZhanghao/live-pol-imaging) dayalı olarak görüntü alımını ve polarizasyon sonuçlarının gerçek zamanlı yeniden yapılandırılmasını ve görüntülenmesini kolaylaştıran açık kaynaklı bir uygulama geliştirdik.

Ayrıca, pSIM 2D düzlem içi polarizasyon bilgisi sağlamakla sınırlı olsa da, yakın zamanda 3D oryantasyon haritalaması (3DOM) olarak adlandırılan hemen hemen aynı ekipmanı¹⁵ kullanarak 3D oryantasyon haritalaması elde etmek için yeteneklerini genişlettik. Bu açık kaynaklı yazılım aynı zamanda 3DOM'un kontrolünü, yeniden yapılandırılmasını ve görselleştirilmesini sağlar. Rekonstrüksiyon ve görselleştirme modülleri, tek molekül oryantasyon izleme uygulaması ile de uyumludur. Tüm bu işlevler, karmaşık biyolojik çalışmalarda polarizasyon görüntülemenin faydasını artırır.

Protokol

1. Polarizasyon görüntüleme için mevcut bir yapılandırılmış aydınlatma mikroskobunun genişletilmesi

1. Bir SIM mikroskobu hazırlayın.
   NOT: Okuyucuların mikroskop kurulumunda belirli bir temele sahip olduklarını ve halihazırda yapılandırılmış bir ışık mikroskobuna sahip olduklarını varsayıyoruz. İlgili deneyiminiz yoksa, bir SIM mikroskobunun¹⁶ nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sağlayan bu makaleye bakın. "HWP + WQP + LCVR" polarizasyon kontrol ünitesi, pSIM çalışma^5'imizde bir pizza girdap dalga plakası veya bir pizza yarım dalga plakası¹⁷ ile değiştirilebilir.
2. Uzamsal ışık modülatörüne (SLM) farklı desenler yükleyerek üç şerit yönünün polarizasyon sönme oranlarını ölçün. Objektifin hemen arkasına bir polarizer yerleştirin ve döndürün ve lazer gücünü ölçmek için bir güç ölçer kullanın. pSIM için, sönme oranı 10 olan üç yönün s-polarizasyonunu korumak > dalga plakasını döndürün.
3. 3DOM için, altı yönün p-polarizasyonunu korumak için HWP2'yi döndürün. Altı yöndeki 3 dereceli ışınların geçmesine izin vermek için SIM uzamsal maskesini 1DOM uzamsal maskesiyle değiştirin (bkz. Şekil 1B).
   NOT: pSIM'de s-polarizasyon, 3DOM'da p-polarizasyon gereklidir. Ayrıntılı kurulum, pSIM⁵ ve 3DOM¹⁵ için başka bir yerde bulunur.

2. Mikro Yönetici kurulumu

1. Micro-Manager 2.0 sürümünü resmi web sitesinden indirin, talimatları izleyerek yazılımı yükleyin.
2. Micro-Manager sistemine başarılı bir şekilde bağlanmak için ilgili aygıt sürücülerini ve yazılımı hazırlayın. Bu mikroskop sisteminde, kamerayı, çeviri aşamasını, lazeri, DAQ kartını ve mikroskobu kontrol etmek için Micro-Manager'ı kullanın.
   NOT: Desteklenen enstrümanlar https://micro-manager.org/Device_Support'da listelenmiştir. Bağlanacak cihazlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Sürücüleri veya resmi/destek yazılımını yükleyin ve cihazı bir USB kablosu kullanarak bilgisayara bağlayın.
3. Donanım Yapılandırma Sihirbazı'nı kullanarak enstrümanları Micro-Manager'a ekleyin.
   1. Yazılımı açın ve ilk açılır listeden Yok'u seçin.
   2. Cihazları Seçin | Donanım Yapılandırma Sihirbazı... | Yeni konfigürasyon oluşturun ve konfigürasyon sayfasına girmek için İleri'ye tıklayın.
   3. Açılır donanım listesinde Kamera / Lazer / Stage / DAQ / mikroskop eklentisini bulun ve Ekle | Tamam | Sonraki.
   4. Varsayılan cihazları seç'e gidin ve otomatik deklanşör ayarını seçin. Varsayılan kamera, Varsayılan deklanşör ve Varsayılan odak aşamasını ayarlayın. Yapılandırmayı kaydet ve çık elde edilene kadar İleri'ye tıklayın ve yapılandırma dosyası adını kaydedin. Son'a tıklayın.
4. Ortak şablon ayarları
   1. Canlı mod ve SIM yakalama modu için bir şablon kaydedin.
   2. Pozlama süresini ve tetikleme modunu aşağıdaki gibi ayarlayın: Yapılandırma ayarlarında Grup ' +' öğesini seçin, Grup adını 'Mod' olarak adlandırın, Pozlama ve Tetikleme Modu'nu seçin, Tamam'a tıklayın.
   3. 'Mod' grubuna farklı ön ayarlar eklemek için Ön Ayar '+' yı seçin. Canlı mod pozlama ayarları için bir ön ayara 'canlı' ve SIM modu için başka bir 'SIM' adını verin. Örneğin, 'canlı' modda, pozlama süresini 15 ms olarak ayarlarken, SIM yakalama modu için pozlama süresini 10 ms olarak ayarlayın ve tetikleme modu Standart (Örtüşme) olarak ayarlayın.
      NOT: Kod depomuzda bir yapılandırma dosyası (MMConfig_psim_demo.cfg) bulunmaktadır ve bu dosya doğrudan Micro-Manager 2.0 tarafından yüklenebilir.

3. Floresan boncuklarla sistem kalibrasyonu

1. Lamelleri %75 etanole batırın, lamelleri 3x deiyonize su (ddH₂O) ile durulayın ve kurutun.
2. 100 nm floresan boncukları (fosfat tamponlu salin [PBS] ile 1: 1.000'e seyreltilmiş) girdaplayın ve süspansiyonu doğrudan lamellerin üzerine pipetleyin. Karanlık bir ortamda 5-10 dakika inkübe edin, ardından PBS ile nazikçe yıkayın.
3. Mikroskop lamına 20 μL montaj ortamı ekleyin ve herhangi bir kabarcık oluşmamasına dikkat ederek lameli üzerine yerleştirin. Sıcaklığı 4 °C'de tutun ve slaytı karanlıkta tutun, böylece 100 nm floresan boncuklu slayt Sistem kalibrasyonu için hazırlanır.
4. pSIM için, floresan boncukların üç farklı fazının üç görüntüsünü elde edin. Özel bir MATLAB kodu (Bead_calib.m), görüntüleri girdi olarak alır ve daha fazla analiz için iki kalibrasyon görüntüsü (calib1.tif, calib2.tif) verir.
   NOT: Daha önce^5'te gösterildiği gibi, pSIM deneyi çoğu ticari sistemde gerçekleştirilebilir. Ev yapımı veya ticari SIM mikroskoplarda, üç desen yönü sırasında düzgün olmayan aydınlatmanın neden olduğu floresan dipollerin ölçüm hatasını ortadan kaldırmak için sistem kalibrasyonu gereklidir. Kalibrasyon deneyi, floresan boncukların izotropik polarizasyonunu varsayar ve yalnızca SIM alımı sırasında ham görüntüleri gerektirir. Ayrıntılı kalibrasyon prosedürü orijinal çalışmamızda yer almaktadır⁵. Desen yönü 2'nin piksel bazında aydınlatma enerjisini gösteren pSIM rekonstrüksiyonu için calib1.tif ve calib2.tif olmak üzere iki kalibrasyon görüntüsünün çıktısı gereklidir; 3, desen yönü 1'i ifade eder.

4. Numune hazırlama: sabit hücrelerde aktin

1. Lamelleri %75 etanole batırın, lamelleri 3x ddH₂O ile durulayın. Lamelleri altı oyuklu bir hücre kültürü plakasına yerleştirin.
2. Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'unda (DMEM) kültür U2OS hücreleri (ATCC HTB-96 hücre hattı), 37 ° C'de% 10 (h / h) Fetal Sığır Serumu (FBS) ve% 5 CO₂ ile desteklenmiştir.
3. Hücreleri 3x PBS ile nazikçe yıkayın. Hücre fiksasyonu için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 paraformaldehit uygulayın. Fiksasyondan sonra, hücreleri tekrar 3 kez PBS ile yıkayın.
4. Membran geçirgenliğini arttırmak için, hücreleri PBS'de% 0.1 Triton X-100 ile 5 dakika boyunca tedavi edin, ardından hücreleri 3x PBS ile yıkayın.
5. Stok çözeltisi (66μM) için floresan falloidini 150 μL DMSO ile çözün. Phalloidin boya çalışma çözeltisini, 5 μL stok çözeltisini 995 μL PBS'de seyrelterek hazırlayın. Hücreleri karanlıkta Phalloidin boya işleme çözeltisi ile oda sıcaklığında ~ 1 saat inkübe edin. Hücreleri PBS ile 3 x 3 dakika yıkayın.
6. Mikroskop lamına 20 μL montaj ortamı ekleyin. Lameli herhangi bir kabarcık olmadan slaytın üzerine dikkatlice yerleştirin. Slaytı 4 °C'de saklayın ve karanlık bir yerde saklayın.

5. Numune hazırlama: in vitro λ-DNA

1. 0.5 g Poli Metil Metakrilatı 10 mL protez taban materyalinde çözün. İyice çözündükten sonra, çözeltiyi slaydın yüzeyine eşit şekilde uygulayın ve ardından bir film oluşturmak için buharlaşmasını bekleyin.
2. 968 μL PBS'de 0.3 μL λ-DNA ve 32 μL 1.000x SYTOX Turuncu Nükleik Asit Boyasını seyreltin. Slayta hazırlanan çözeltiden 1 μL ekleyin ve kurumasını bekleyin.
3. Numuneyi korumak ve muhafaza etmek için lamel montaj aparatı ile lamel üzerine kapatın. Slaytı 4 °C'de karanlık bir ortamda saklayın.

6. Görüntüleme

1. Lameli numune tutucuya yerleştirin ve canlı modda odak düzlemine ayarlayın. 512 x 512 piksel yatırım getirisi seçin ve pozlama süresini ve lazer yoğunluğunu ayarlayın.
2. Uzamsal ışık modülatörünün bağımsız kontrol yazılımını açın ve pSIM / 3DOM veya canlı mod için uygun aydınlatma modeli dizisi yolunu seçin.
   NOT: pSIM için aydınlatma modeli üç farklı polarizasyon açısı ve üç farklı faz içerir. 3DOM için aydınlatma modeli altı farklı polarizasyon açısı içerir.
3. SIM çekim modunu seçin, Multi-D Acq.'yi seçin, Zaman Noktaları'nı seçin ve açık pencerede Sayıyı (pSIM veya 3DOM için 9 veya 6 görüntü) ve Aralığı (0 ms) ayarlayın. Elde Et'i tıklayın!
4. TriggerSLM.bsh'ye tıklayın (kod depomuzda bir yapılandırma dosyası bulunmaktadır), MyDaq edinme kartı, resimleri çekmek için uzamsal ışık modülatörünü etkinleştirir.

7. pSIM ve 3DOM'un canlı görüntü eklentisi

1. FakeCamera ve görüntü erişim yolunu yapılandırın: Aygıtlar MMConfig_FakeCam_demo| Donanım Yapılandırmasını Yükle.... Aygıtlarda yerel görüntü dizinini yapılandırın | Cihazlar Özellik Tarayıcı... | Kamera Yolu maskesi (Şekil 2A-C).
   NOT: Komut dosyasının edinme kısmı donanım kurulumuna bağlıdır, bu nedenle tanıtım için sabit diskteki yerel görüntüleri okumak için FakeCamera cihazını kullanan bir sürüm (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) sağladık. Kullanıcılar sürümümüzde değişiklik yapabilir. Görüntü okuma yolunu değiştirmeyi unutmayın (Kamera Yolu maskesi).
2. Araçlar | Hızlı Erişim Paneli | Yeni panel oluştur'u tıklayın. Sol alt köşedeki Ayarlar simgesini tıklayın, 'psim.bsh' ve '3DOM.bsh' yükleyebilen üst kısma 'Komut Dosyasını Çalıştır' ilacını tıklayın (Şekil 2D) .
   NOT: Hızlı Erişim Paneli sistemi, kullanıcıların özelleştirilmiş pencereler oluşturmasına ve en sık ihtiyaç duyulan Micro-Manager'daki kontrollere kolayca erişmesine olanak tanır. Şekil 2D'de gösterildiği gibi 'Canlı', 'Snap' veya diğer kanallar da eklenebilir.
3. Örnek olarak pSIM'i ele alırsak, 'psim.bsh' üzerine tıklayarak gerçek zamanlı polarizasyon görüntü rekonstrüksiyonu gerçekleştirin; polarizasyon sonuçlarıyla gerçek zamanlı olarak yeniden yapılandırılmış görüntüleri gözlemleyin (Şekil 2E). 'psim.bsh' dosyasındaki kalibrasyon görüntüleri yolunu değiştirmeyi unutmayın (calibPath = " kalibrasyon görüntüleri dosyasının yolu").
   NOT: Canlı görüntü eklentisi, Komut Dosyası Panelinde çalıştırılabilen bir beanshell komut dosyasıdır (psim.bsh ve 3DOM.bsh). Eklenti, pSIM için dokuz görüntü veya 3DOM için altı görüntü alır ve geniş alan görüntülerine dayalı olarak yönlendirme eşleme sonuçlarını hesaplar. Oryantasyon haritalama görüntüleri, düşük çözünürlüğüne rağmen anında incelemeyi kolaylaştıran gerçek zamanlı polarizasyon bilgisi sağlamak için görüntülenir.

8. Süper çözünürlüklü rekonstrüksiyon ile veri analizi

1. MATLAB R2019b'yi web sitesinden yükleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
2. Yazılımı açın; pSIM rekonstrüksiyonu için, üç oryantasyon açısının her biri için üç farklı fazdan oluşan dokuz görüntü elde edin. Dokuz görüntünün adlarının '1.tif' ile '9.tif' arasında olduğundan emin olun, bunları 'Giriş' adlı dosyaya koyun ve 'PSIM.m' adlı programı çalıştırın. Renk tekerleği ile yeniden yapılandırılmış Geniş Alan görüntüsünü, SIM görüntüsünü ve pSIM görüntüsünü gözlemleyin.
   NOT: pSIM için yeniden yapılandırma iki adıma ihtiyaç duyar: bir SIM adımı ve bir PM adımı. Veriler, daha kolay hata ayıklama için özel olarak yazılmış bir MATLAB programı tarafından analiz edilir. GitHub'daki 'reconsr' klasöründen yeniden yapılandırma kodunu alın.
3. 3DOM için altı farklı polarizasyon yönü figürü yakalayın. Altı görüntüyü bir araya getirin, ortaya çıkan dosyayı 'Raw_data.tif' olarak adlandırın ve 'Recon_3DOM.m' adlı programı çalıştırın. Azimut sonuçları ve kutup açısı sonuçları ile yeniden yapılandırılmış Geniş Alan görüntüsünü ve 3DOM görüntüsünü gözlemleyin.
   NOT: Yeniden yapılandırma işlemi sırasında bir hata oluşabilir'--'fonksiyon veya 'bfopen' değişkeni tanınmadı'. 'BFopen', Biyo-Format kitaplığındaki bir işlevdir ve genellikle görüntü dosyalarını açmak ve okumak için kullanılır. MATLAB komut penceresine addpath ('path_to_bioformats_toolbox') girin. 'path_to_bioformats_toolbox' kısmını gerçek kitaplık klasörü yolu ile değiştirin. Ayrıca GitHub deposuna Bio-Formats bağımlılığını da ekledik.

Sonuçlar

pSIM yöntemi, s-polarize lazer ışınları kullanılarak girişime dayalı olarak SIM mikroskoplarında gerçekleştirilebilir. s-polarizasyon girişimi, en yaygın kullanılan SIM türüdür ve yüksek kontrastlı aydınlatma şeritleri oluşturur. Bir mikroskop kurulumunun akademik prototipi, pSIM^5'in orijinal çalışmasına dahil edilmiştir. Şekil 1'de kısaca tanıtılan, bir uzamsal ışık m...

Tartışmalar

Çalışmamızda, pSIM ve 3DOM olmak üzere iki polarizasyon görüntüleme tekniğinin gerçek zamanlı önizlemesine izin veren bir eklenti geliştirdik. Her iki teknoloji de mevcut bir SIM sisteminde küçük bir değişiklikle gerçekleştirilebilir. pSIM ve 3DOM mikroskobunu kurmak ve mikroskobu kontrol etmek ve canlı görüntü polarizasyon sonuçlarının nasıl elde edileceğini göstermek için Micro-Manager'ı kurmak için ayrıntılı adımları sağladık. Deneysel sonuçlar...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nm Fluorescent beads	Invitrogen	F8801
4% Formaldehyde solution	Invitrogen	R37814
Camera	Tucsen	Dhyana 400BSI V3	https://www.tucsen.com/download-software/
Denture base materials (Type I Thermally setting type, liquid)	New Century Dental	N/A
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Gibco	C11995500BT
Eclipse TE2000 Inverted Microscope	Nikon	TE2000 E
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141C
MATLAB R2019b	MathWorks	Version R2019b	https://ww2.mathworks.cn/downloads/
MetroCon V4.0	Kopin	Version 4.0	Software of Spatial light modulator
Micro-Manager 2.0	μΜanager	Version 2.0	Download Micro-Manager Latest Release
MS-2000 XYZ Automated Stage	Applied Scientific Instrumentation	MIM3	https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/
myDAQ	National Instruments	781325-01	Software and Driver Downloads - NI
OBIS 561 nm LS 20 mW Laser	Coherent	1325777
Phalloidin-AF568	Invitrogen	A12380
Phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
Poly Methyl Methacrylate	Solarbio	M9810
ProLong Diamond	Invitrogen	P36980
Spatial light modulator	Kopin	SXGA-12
SYTOX orange nucleic acid stain	Invitrogen	S11368
Triton X-100	Invitrogen	HFH10
Trypsin	Gibco	25200056
λ-DNA	Invitrogen	S11368