Plugin open-source Micro-Manager pour l’imagerie en direct de dipôles fluorescents

Résumé

Nous avons développé un plug-in open-source Micro-Manager, qui permet d’observer en direct les dipôles fluorescents sur un microscope à éclairage structuré. Le plugin prend en charge l’observation de l’orientation des dipôles 2D et 3D.

Résumé

La microscopie à polarisation de fluorescence (FPM) permet d’imager la position et l’orientation dipolaire des fluorophores. Malgré les réalisations de la microscopie à polarisation de fluorescence à super-résolution, leur dépendance à l’égard de la post-acquisition entrave l’observation en temps réel. La microscopie à éclairage structuré polarisé (pSIM) offre une imagerie à super-résolution des dipôles fluorescents avec une vitesse d’imagerie rapide et est bien adaptée aux applications de cellules vivantes. Nous avons développé une implémentation open-source pour la reconstruction en temps réel des images de polarisation et l’affichage des dipôles fluorescents. De plus, nous avons étendu la méthode pour obtenir une cartographie d’orientation 3D (3DOM), élargissant ainsi son utilité pour les études biologiques complexes. De plus, nous avons présenté une introduction approfondie à l’extension d’un microscope SIM existant sur l’imagerie polarisée et fourni un guide de configuration détaillé de Micro-Manager 2.0 pour contrôler le microscope, permettant une prévisualisation en temps réel de l’imagerie polarisée. De plus, nous avons fourni le code MATLAB pour une reconstruction complète, englobant à la fois la pSIM et la 3DOM. Ce guide complet vise à aider les débutants à maîtriser rapidement et à démarrer facilement les opérations.

Introduction

La microscopie à polarisation de fluorescence (FPM) est apparue comme une technique puissante pour imager simultanément la position et l’orientation dipolaire des fluorophores, offrant des informations approfondies sur l’imagerie biologique ^1,2. En facilitant l’observation de la direction de l’orientation des biomolécules, le FPM dévoile l’arrangement complexe de macromolécules telles que l’actine ^3,4,5, le microtubule⁵, la septine⁶, le filament d’ADN ^7-9, le complexe de pores nucléaires¹⁰ et les protéines membranaires¹¹. Ses capacités à grande vitesse, non invasives et compatibles avec les cellules vivantes permettent de suivre la dynamique de la rotation moléculaire avec une résolution temporelle élevée^11,12. Lorsqu’il est intégré aux sondes de bioforce, le FPM cartographie non seulement les amplitudes de force à la résolution subcellulaire, mais mesure également les directions de force, faisant ainsi progresser notre compréhension des processus biomécaniques en révélant la direction des forces¹³.

Au cours des dernières décennies, la microscopie à polarisation de fluorescence à super-résolution a connu une évolution rapide. Une avancée notable dans ce domaine est la microscopie de localisation d’orientation d’une molécule unique, également appelée SMOLM, qui peut localiser à la fois la position et l’orientation des fluorophores, permettant ainsi une localisation multidimensionnelle. La mesure de polarisation dans SMOLM peut être effectuée à l’aide de la modulation d’excitation de polarisation⁷, de la détection polarisée multicanal³ ou de la fonction d’étalement du point sensible à la polarisation (PSF)¹⁴. Bien que SMOLM atteigne une résolution spatiale de l’ordre de quelques dizaines de nanomètres et mesure la polarisation de molécules uniques, il souffre d’un temps d’imagerie prolongé. Cela est dû aux cycles répétitifs de clignotement et de localisation des fluorophores, qui posent un défi pour l’imagerie à débit vidéo et les applications de cellules vivantes.

En revanche, la microscopie à éclairage structuré polarisé (pSIM) offre une résolution spatiale d’environ 100 nm, associée à l’acquisition d’informations de polarisation avec le même ensemble de données SIM. Notamment, la pSIM peut atteindre des vitesses d’imagerie à débit vidéo et est hautement compatible avec l’imagerie de cellules vivantes, sans exigences strictes sur les molécules fluorescentes. Récemment, la pSIM a réussi à révéler la structure du cycle d’actine dans le squelette périodique associé à la membrane (MPS)⁵ et a permis une cartographie à super-résolution des forces biologiques¹³.

Cependant, la pSIM nécessite une reconstruction d’image post-acquisition, ce qui empêche la visualisation en temps réel des résultats de polarisation. Ce retard entrave l’observation immédiate des phénomènes biologiques, empêchant les chercheurs de capturer rapidement les phénomènes biologiques d’intérêt et d’apporter des ajustements en temps réel aux échantillons et aux conditions d’imagerie. Pour remédier à cette limitation, nous avons développé une implémentation open-source qui facilite l’acquisition d’images et la reconstruction en temps réel et l’affichage des résultats de polarisation, basée sur la plate-forme ImageJ et Micro-Manager (https://github.com/KarlZhanghao/live-pol-imaging).

De plus, alors que la pSIM a été limitée à fournir des informations de polarisation 2D dans le plan, nous avons récemment étendu ses capacités pour réaliser une cartographie d’orientation 3D en utilisant presque le même équipement¹⁵, appelé cartographie d’orientation 3D (3DOM). Ce logiciel open-source permet également le contrôle, la reconstruction et la visualisation de 3DOM. Les modules de reconstruction et de visualisation sont également compatibles avec l’application de suivi de l’orientation d’une molécule unique. Toutes ces fonctionnalités renforcent l’utilité de l’imagerie de polarisation dans les études biologiques complexes.

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Protocole

1. Extension d’un microscope à éclairage structuré existant pour l’imagerie de polarisation

1. Préparez un microscope SIM.
   REMARQUE : Nous supposons que les lecteurs ont une certaine base dans la configuration du microscope et possèdent déjà un microscope à lumière structurée. Si vous manquez d’expérience pertinente, reportez-vous à ce document, qui fournit une description détaillée de la façon de construire un microscope SIM¹⁶. L’unité de contrôle de polarisation de « HWP+WQP+LCVR » peut être remplacée par une plaque d’onde vortex pizza dans notre pSIM work⁵ ou une plaque demi-onde pizza¹⁷.
2. Mesurez les rapports d’extinction de polarisation de trois directions de bande en chargeant différents motifs sur le modulateur spatial de lumière (SLM). Placez et faites pivoter un polariseur juste après l’objectif et utilisez un wattmètre pour mesurer la puissance du laser. Pour la pSIM, faites pivoter la plaque d’onde pour maintenir la polarisation s des trois directions avec un rapport d’extinction > 10.
3. Pour 3DOM, tournez le HWP2 pour maintenir la polarisation p de six directions. Remplacez le masque spatial SIM par le masque spatial 3DOM pour permettre le passage de faisceaux d’ordre 1 de six directions (voir Figure 1B).
   REMARQUE : la polarisation s est requise dans la pSIM tandis que la polarisation p est requise dans le 3DOM. La configuration détaillée est incluse ailleurs pour la pSIM⁵ et la 3DOM¹⁵.

2. Configuration du Micro-Manager

1. Téléchargez la version 2.0 de Micro-Manager depuis le site officiel, installez le logiciel en suivant les instructions.
2. Préparez les pilotes de périphériques et les logiciels correspondants pour vous connecter avec succès au système Micro-Manager. Dans ce système de microscope, utilisez Micro-Manager pour contrôler la caméra, la platine de translation, le laser, la carte DAQ et le microscope.
   REMARQUE : Les instruments pris en charge sont répertoriés dans https://micro-manager.org/Device_Support. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur les instruments à connecter. Installez des pilotes ou des logiciels officiels/d’assistance et connectez l’instrument à l’ordinateur à l’aide d’un câble USB.
3. Ajoutez les instruments à Micro-Manager à l’aide de l’assistant de configuration matérielle.
   1. Ouvrez le logiciel et sélectionnez Aucun dans la liste déroulante initiale.
   2. Sélectionnez Appareils | Assistant de configuration matérielle... | Créez une nouvelle configuration et cliquez sur Suivant pour accéder à la page de configuration.
   3. Localisez le plug-in Appareil photo/Laser/Platine/DAQ/microscope dans la liste déroulante du matériel et cliquez sur Ajouter | D’accord | Ensuite.
   4. Allez dans Sélectionner les appareils par défaut et choisissez le réglage de l’obturateur automatique. Définissez l’appareil photo par défaut, l’obturateur par défaut et l’étape de mise au point par défaut. Cliquez sur Suivant jusqu’à ce que l’option Enregistrer la configuration et quitter soit atteinte, puis enregistrez le nom du fichier de configuration. Cliquez sur Terminer.
4. Paramètres de modèle courants
   1. Enregistrez un modèle pour le mode en direct et le mode d’accrochage SIM.
   2. Réglez le temps d’exposition et le mode de déclenchement comme suit : choisissez le groupe ' + ' dans les paramètres de configuration, nommez le nom du groupe comme 'Mode', sélectionnez Exposition et mode de déclenchement, cliquez sur OK.
   3. Choisissez le préréglage « + » pour ajouter différents préréglages pour le groupe « Mode ». Nommez un préréglage « en direct » pour les paramètres d’exposition en mode en direct, et un autre « SIM » pour le mode SIM. Par exemple, en mode « live », réglez le temps d’exposition sur 15 ms, tandis que pour le mode SIM snap, réglez 10 ms pour le temps d’exposition et le mode de déclenchement est Standard (chevauchement).
      REMARQUE : Un fichier de configuration (MMConfig_psim_demo.cfg) est inclus dans notre dépôt de code, qui peut être chargé directement par Micro-Manager 2.0.

3. Calibrage du système avec des billes fluorescentes

1. Plongez les lamelles dans de l’éthanol à 75 %, rincez-les 3 fois avec de l’eau désionisée (ddH₂O) et séchez-les.
2. Vortex les billes fluorescentes de 100 nm (diluées à 1:1 000 avec une solution saline tamponnée au phosphate [PBS]) et pipetez la suspension directement sur les lamelles. Incuber pendant 5 à 10 minutes dans un environnement sombre, puis laver doucement avec du PBS.
3. Ajoutez 20 μL de support de montage sur la lame de microscope et placez la lamelle par-dessus, en veillant à éviter toute bulle. Maintenez la température à 4 °C et gardez la lame dans l’obscurité, de sorte que la lame avec des billes fluorescentes de 100 nm soit préparée pour l’étalonnage du système.
4. Pour la pSIM, acquérez trois images des trois phases différentes des billes fluorescentes. Un code MATLAB personnalisé (Bead_calib.m) prend les images en entrée et en émet deux images d’étalonnage (calib1.tif, calib2.tif) pour une analyse plus approfondie.
   REMARQUE : Comme démontré précédemment⁵, l’expérience pSIM peut être effectuée sur la plupart des systèmes commerciaux. Sur les microscopes SIM fabriqués à la maison ou commerciaux, l’étalonnage du système est nécessaire pour éliminer l’erreur de mesure des dipôles fluorescents, causée par l’éclairage non uniforme pendant trois directions de motif. L’expérience d’étalonnage suppose la polarisation isotrope des billes fluorescentes et ne nécessite que les images brutes lors de l’acquisition de la carte SIM. La procédure d’étalonnage détaillée est incluse dans notre travail original⁵. La sortie de deux images d’étalonnage calib1.tif et calib2.tif est nécessaire pour la reconstruction pSIM, qui indique l’énergie d’éclairage au pixel près de la direction du motif 2 ; 3 fait référence à la direction du motif 1.

4. Préparation de l’échantillon : actine dans les cellules fixées

1. Immergez les lamelles dans de l’éthanol à 75 %, rincez les lamelles 3 fois avec du ddH₂O. Placez les lamelles dans une plaque de culture cellulaire à six puits.
2. Cultiver des cellules U2OS (lignée cellulaire ATCC HTB-96) dans le milieu modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS) à 37 °C et 5 % de CO₂ sur des lamelles de recouvrement jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence d’environ 75 %.
3. Lavez doucement les cellules 3x avec du PBS. Pour la fixation cellulaire, appliquer 4 % de paraformaldéhyde pendant 15 min à température ambiante. Après la fixation, lavez à nouveau les cellules 3 fois avec du PBS.
4. Pour améliorer la perméabilité de la membrane, traitez les cellules avec 0,1 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min, puis lavez les cellules 3x avec du PBS.
5. Dissoudre la phalloïdine fluorescente avec 150 μL de DMSO pour solution mère (66 μM). Préparez la solution de travail du colorant phalloïdine en diluant 5 μL de la solution mère dans 995 μL de PBS. Incuber les cellules dans l’obscurité avec une solution de travail de colorant Phalloïdine à température ambiante pendant ~1 h. Lavez les cellules pendant 3 x 3 min avec du PBS.
6. Ajoutez 20 μL de support de montage sur la lame de microscope. Placez soigneusement la lamelle sur la glissière sans aucune bulle. Rangez la lame à 4 °C et conservez-la dans un endroit sombre.

5. Préparation de l’échantillon : λ-ADN in vitro

1. Dissoudre 0,5 g de polyméthacrylate de méthyle dans 10 mL de matériaux de base de prothèse. Après une dissolution complète, appliquez uniformément la solution sur la surface de la lame, puis attendez qu’elle s’évapore pour former un film.
2. Diluez 0,3 μL d’ADN-λ et 32 μL de colorant d’acide nucléique orange 1 000 fois SYTOX dans 968 μL de PBS. Ajoutez 1 μL de la solution préparée à la lame et laissez-la sécher.
3. Scellez la lamelle sur la lame avec le collant pour protéger et préserver l’échantillon. Stockez la lame à 4 °C dans un environnement sombre.

6. Imagerie

1. Placez la lamelle sur le porte-échantillon et ajustez-la sur le plan focal en mode direct. Sélectionnez un retour d’intérêt de 512 x 512 pixels et ajustez le temps d’exposition et l’intensité du laser.
2. Ouvrez le logiciel de contrôle indépendant du modulateur de lumière spatial et choisissez le chemin de séquence de motif d’éclairage approprié pour pSIM / 3DOM ou le mode en direct.
   REMARQUE : Pour pSIM, le motif d’éclairage comprend trois angles de polarisation différents et trois phases différentes. Pour 3DOM, le motif d’éclairage comprend six angles de polarisation différents.
3. Sélectionnez le mode de capture SIM , sélectionnez Multi-D Acq., choisissez Points temporels et réglez le nombre (9 ou 6 images pour pSIM ou 3DOM) et l’intervalle (0 ms) dans la fenêtre ouverte. Cliquez sur Acquérir !
4. Cliquez sur TriggerSLM.bsh (un fichier de configuration est inclus dans notre référentiel de code), la carte d’acquisition MyDaq active le modulateur de lumière spatial pour prendre les photos.

7. Plugin de visualisation en direct de pSIM et 3DOM

1. Configurer le chemin d’accès à la FakeCamera et à l’image : chargez le certificat (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) en cliquant sur Périphériques | Charger la configuration matérielle.... Configurer le répertoire local des images dans Périphériques | Périphériques Navigateur de propriétés... | Masque de trajectoire de caméra (Figure 2A-C).
   REMARQUE : La partie acquisition du script dépend de la configuration matérielle, nous avons donc fourni une version (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) utilisant le périphérique FakeCamera pour lire les images locales sur le disque dur à des fins de démonstration. Les utilisateurs peuvent apporter des modifications dans notre version. N’oubliez pas de modifier le chemin de lecture de l’image (masque Camera-Path).
2. Configurez le panneau d’accès rapide en cliquant sur Outils | Panneau d’accès rapide | Créez un nouveau panneau. Cliquez sur l’icône Paramètres dans le coin inférieur gauche, puis sur « Run Script » dans la partie supérieure, ce qui permet de charger les fichiers « psim.bsh » et « 3DOM.bsh » (Figure 2D).
   REMARQUE : Le système de panneau d’accès rapide permet aux utilisateurs de créer des fenêtres personnalisées et d’accéder facilement aux commandes de Micro-Manager, ce qui est le plus fréquemment nécessaire. Il est également possible d’ajouter des canaux « Live », « Snap » ou d’autres canaux, comme le montre la figure 2D.
3. En prenant l’exemple de la pSIM, effectuez une reconstruction d’image de polarisation en temps réel en cliquant sur 'psim.bsh' ; observer les images reconstruites en temps réel avec les résultats de polarisation (Figure 2E). N’oubliez pas de modifier le chemin d’accès aux images d’étalonnage dans le fichier 'psim.bsh' (calibPath = 'chemin d’accès au fichier d’images d’étalonnage'").
   REMARQUE : Le plugin de vue en direct est un script beanshell (psim.bsh et 3DOM.bsh), qui peut être exécuté dans le panneau de script. Le plugin acquiert neuf images pour la pSIM ou six images pour le 3DOM et calcule les résultats de la cartographie d’orientation sur la base des images à grand champ. Les images de cartographie d’orientation sont affichées pour fournir des informations de polarisation en temps réel, ce qui facilite l’inspection immédiate, malgré sa faible résolution.

8. Analyse des données avec reconstruction en super-résolution

1. Installez MATLAB R2019b à partir du site Web (voir la table des matériaux).
2. Ouvrez le logiciel ; pour la reconstruction pSIM, obtenir neuf images, composées de trois phases différentes pour chacun des trois angles d’orientation. Assurez-vous que les noms des neuf images sont compris entre 1.tif et 9.tif, placez-les dans le fichier nommé « Input » et exécutez le programme nommé « PSIM.m ». Observez l’image grand champ reconstruite, l’image SIM et l’image pSIM avec la roue chromatique.
   REMARQUE : La reconstruction de la pSIM nécessite deux étapes : une étape SIM et une étape PM. Les données sont analysées par un programme MATLAB personnalisé pour faciliter le débogage. Obtenez le code de reconstruction à partir du dossier 'reconsr' dans GitHub.
3. Pour 3DOM, capturez six figures de directions de polarisation différentes. Fusionnez les six images, nommez le fichier résultant 'Raw_data.tif' et exécutez le programme nommé 'Recon_3DOM.m'. Observez l’image grand champ reconstruite et l’image 3DOM avec les résultats azimutaux et les résultats de l’angle polaire.
   REMARQUE : Pendant le processus de reconstruction, une erreur peut se produire'--'la fonction ou la variable 'bfopen' n’est pas reconnue'. 'bfopen' est une fonction de la bibliothèque Bio-formats et est couramment utilisée pour l’ouverture et la lecture de fichiers image. Entrez addpath ('path_to_bioformats_toolbox') dans la fenêtre de commande MATLAB. Remplacez 'path_to_bioformats_toolbox' par le chemin d’accès réel du dossier de la bibliothèque. Nous avons également ajouté la dépendance Bio-Formats au référentiel GitHub.

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Résultats

La méthode pSIM peut être réalisée sur des microscopes SIM en fonction de l’interférence à l’aide de faisceaux laser polarisés s. Les interférences de polarisation S sont le type de carte SIM le plus largement utilisé et génèrent des bandes d’éclairage à contraste élevé. Le prototype académique d’une configuration de microscope est inclus dans le travail original de pSIM⁵. Brièvement présenté dans la

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Discussion

Dans notre étude, nous avons développé un plugin qui permet de prévisualiser en temps réel deux techniques d’imagerie de polarisation, pSIM et 3DOM. Les deux technologies peuvent être réalisées dans un système SIM existant avec de légères modifications. Nous avons fourni les étapes détaillées pour installer le microscope pSIM et 3DOM et configurer Micro-Manager pour contrôler le microscope et montrer comment obtenir les résultats de polarisation en direct. Les résultat...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nm Fluorescent beads	Invitrogen	F8801
4% Formaldehyde solution	Invitrogen	R37814
Camera	Tucsen	Dhyana 400BSI V3	https://www.tucsen.com/download-software/
Denture base materials (Type I Thermally setting type, liquid)	New Century Dental	N/A
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Gibco	C11995500BT
Eclipse TE2000 Inverted Microscope	Nikon	TE2000 E
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141C
MATLAB R2019b	MathWorks	Version R2019b	https://ww2.mathworks.cn/downloads/
MetroCon V4.0	Kopin	Version 4.0	Software of Spatial light modulator
Micro-Manager 2.0	μΜanager	Version 2.0	Download Micro-Manager Latest Release
MS-2000 XYZ Automated Stage	Applied Scientific Instrumentation	MIM3	https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/
myDAQ	National Instruments	781325-01	Software and Driver Downloads - NI
OBIS 561 nm LS 20 mW Laser	Coherent	1325777
Phalloidin-AF568	Invitrogen	A12380
Phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
Poly Methyl Methacrylate	Solarbio	M9810
ProLong Diamond	Invitrogen	P36980
Spatial light modulator	Kopin	SXGA-12
SYTOX orange nucleic acid stain	Invitrogen	S11368
Triton X-100	Invitrogen	HFH10
Trypsin	Gibco	25200056
λ-DNA	Invitrogen	S11368