Open-Source-Micro-Manager-Plugin für die Live-View-Bildgebung von fluoreszierenden Dipolen

Zusammenfassung

Wir haben ein Open-Source-Micro-Manager-Plugin entwickelt, das die Live-View-Beobachtung von fluoreszierenden Dipolen auf einem Mikroskop mit strukturierter Beleuchtung ermöglicht. Das Plugin unterstützt die Beobachtung sowohl der 2D- als auch der 3D-Dipolausrichtung.

Zusammenfassung

Mit der Fluoreszenzpolarisationsmikroskopie (FPM) können die Position und Dipolorientierung von Fluorophoren abgebildet werden. Trotz der Errungenschaften der superhochauflösenden Fluoreszenzpolarisationsmikroskopie behindert ihre Abhängigkeit von der Nacherfassung die Echtzeitbeobachtung. Die polarisierte strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (pSIM) bietet eine hochauflösende Abbildung von fluoreszierenden Dipolen mit hoher Bildgebungsgeschwindigkeit und eignet sich gut für Anwendungen mit lebenden Zellen. Wir haben eine Open-Source-Implementierung für die Echtzeit-Rekonstruktion von Polarisationsbildern und die Darstellung der fluoreszierenden Dipole entwickelt. Darüber hinaus haben wir die Methode erweitert, um ein 3D-Orientierungsmapping (3DOM) zu erreichen, wodurch ihr Nutzen für komplexe biologische Studien erweitert wurde. Darüber hinaus haben wir eine ausführliche Einführung in die Erweiterung eines bestehenden SIM-Mikroskops für die Polarisationsbildgebung gegeben und eine detaillierte Konfigurationsanleitung des Micro-Manager 2.0 zur Steuerung des Mikroskops bereitgestellt, die eine Echtzeitvorschau der polarisierten Bildgebung ermöglicht. Darüber hinaus haben wir den MATLAB-Code für die vollständige Rekonstruktion bereitgestellt, der sowohl pSIM als auch 3DOM umfasst. Dieser umfassende Leitfaden soll Anfängern helfen, die Operationen schnell zu beherrschen und einfach mit ihnen zu beginnen.

Einleitung

Die Fluoreszenzpolarisationsmikroskopie (FPM) hat sich zu einer leistungsfähigen Technik entwickelt, mit der sowohl die Position als auch die Dipolorientierung von Fluorophoren gleichzeitig abgebildet werden können, und bietet tiefgreifende Einblicke in die biologische Bildgebung ^1,2. Durch die Erleichterung der Richtungsbeobachtung der Orientierungen von Biomolekülen enthüllt FPM die komplizierte Anordnung von Makromolekülen wie Aktin ^3,4,5, Mikrotubuli⁵, Septin⁶, ^{DNA-Filament 7-9}, Kernporenkomplex¹⁰ und Membranproteine¹¹. Seine schnellen, nicht-invasiven und mit lebenden Zellen kompatiblen Fähigkeiten ermöglichen die Verfolgung der molekularen Rotationsdynamik mit hoher zeitlicher Auflösung^11,12. In Verbindung mit Bioforce-Sonden kartiert FPM nicht nur Kraftgrößen in subzellulärer Auflösung, sondern misst auch Kraftrichtungen, wodurch unser Verständnis biomechanischer Prozesse durch die Aufdeckung der Richtung von Kräften verbessert^{wird 13}.

In den letzten Jahrzehnten hat sich die superauflösende Fluoreszenzpolarisationsmikroskopie rasant weiterentwickelt. Ein bemerkenswerter Fortschritt auf diesem Gebiet ist die Einzelmolekül-Orientierungslokalisierungsmikroskopie, auch SMOLM genannt, die sowohl die Position als auch die Orientierung von Fluorophoren lokalisieren und so eine mehrdimensionale Lokalisierung ermöglichen kann. Die Polarisationsmessung in SMOLM kann mit Hilfe der Polarisationsanregungsmodulation⁷, der mehrkanaligen polarisierten Detektion³ oder der speziell entwickelten polarisationsempfindlichen Punktspreizfunktion (PSF)¹⁴ durchgeführt werden. Obwohl SMOLM eine räumliche Auflösung in der Größenordnung von Dutzenden von Nanometern erreicht und die Polarisation einzelner Moleküle misst, leidet es unter einer verlängerten Bildgebungszeit. Dies ist auf die sich wiederholenden Zyklen des Blinkens und der Lokalisierung von Fluorophoren zurückzuführen, die eine Herausforderung für die Videobildgebung und Lebendzellanwendungen darstellen.

Im Gegensatz dazu bietet die polarisierte strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (pSIM) eine räumliche Auflösung von etwa 100 nm, gekoppelt mit der Erfassung von Polarisationsinformationen mit demselben SIM-Datensatz. Insbesondere kann pSIM Bildgebungsgeschwindigkeiten mit Videorate erreichen und ist hochgradig kompatibel mit der Bildgebung lebender Zellen, ohne strenge Anforderungen an fluoreszierende Moleküle. Kürzlich ist es pSIM gelungen, die Aktinringstruktur im membranassoziierten periodischen Skelett (MPS)⁵ aufzudecken und eine superauflösende Kartierung biologischer Kräfte zu ermöglichen¹³.

pSIM erfordert jedoch eine Bildrekonstruktion nach der Aufnahme, was eine Echtzeit-Visualisierung der Polarisationsergebnisse verhindert. Diese Verzögerung behindert die unmittelbare Beobachtung biologischer Phänomene und hindert die Forscher daran, biologische Phänomene von Interesse schnell zu erfassen und Echtzeitanpassungen an Proben und Bildgebungsbedingungen vorzunehmen. Um diese Einschränkung zu beheben, haben wir eine Open-Source-Implementierung entwickelt, die die Bildaufnahme und die Echtzeit-Rekonstruktion und Anzeige von Polarisationsergebnissen auf Basis der ImageJ- und Micro-Manager-Plattform (https://github.com/KarlZhanghao/live-pol-imaging) erleichtert.

Während pSIM bisher auf die Bereitstellung von 2D-Polarisationsinformationen in der Ebene beschränkt war, haben wir kürzlich seine Fähigkeiten erweitert, um eine 3D-Orientierungskartierung mit fast der gleichen Ausrüstung¹⁵ zu erreichen, die als 3D-Orientierungskartierung (3DOM) bezeichnet wird. Diese Open-Source-Software bietet auch die Steuerung, Rekonstruktion und Visualisierung von 3DOM. Die Rekonstruktions- und Visualisierungsmodule sind auch mit der Anwendung zur Verfolgung der Einzelmolekülorientierung kompatibel. All diese Funktionalitäten erhöhen den Nutzen der Polarisationsbildgebung in komplexen biologischen Studien.

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Protokoll

1. Erweiterung eines bestehenden Mikroskops mit strukturierter Beleuchtung für die Polarisationsbildgebung

1. Bereiten Sie ein SIM-Mikroskop vor.
   HINWEIS: Wir gehen davon aus, dass die Leser über eine gewisse Grundlage im Mikroskopaufbau verfügen und bereits über ein Strukturiertlichtmikroskop verfügen. Wenn Sie nicht über einschlägige Erfahrung verfügen, lesen Sie dieses Dokument, das eine detaillierte Beschreibung des Baus eines SIM-Mikroskops¹⁶ enthält. Das Polarisationssteuergerät von "HWP+WQP+LCVR" kann bei unserer pSIM work⁵ durch eine Pizzawirbel-Wellenplatte oder eine Pizza-Halbwellenplatte¹⁷ ersetzt werden.
2. Messen Sie Polarisationsextinktionsverhältnisse von drei Streifenrichtungen, indem Sie verschiedene Muster auf den räumlichen Lichtmodulator (SLM) laden. Platzieren und drehen Sie einen Polarisator direkt hinter dem Objektiv und verwenden Sie ein Leistungsmesser, um die Laserleistung zu messen. Drehen Sie für pSIM die Wellenplatte, um die s-Polarisation in drei Richtungen mit einem Extinktionsverhältnis > 10 beizubehalten.
3. Drehen Sie für 3DOM den HWP2, um die p-Polarisation in sechs Richtungen beizubehalten. Ersetzen Sie die SIM-Raummaske durch die 3DOM-Raummaske, um Strahlen 1-Ordnung mit sechs Richtungen passieren zu lassen (siehe Abbildung 1B).
   HINWEIS: In pSIM ist eine s-Polarisation erforderlich, während in 3DOM eine p-Polarisation erforderlich ist. Eine detaillierte Einrichtung ist an anderer Stelle für pSIM⁵ und 3DOM¹⁵ enthalten.

2. Einrichtung des Mikro-Managers

1. Laden Sie die Version Micro-Manager 2.0 von der offiziellen Website herunter, installieren Sie die Software, indem Sie den Anweisungen folgen.
2. Bereiten Sie die entsprechenden Gerätetreiber und Software vor, um eine erfolgreiche Verbindung mit dem Micro-Manager-System herzustellen. Verwenden Sie in diesem Mikroskopsystem den Micro-Manager, um die Kamera, den Translationstisch, den Laser, die Datenerfassungskarte und das Mikroskop zu steuern.
   HINWEIS: Die unterstützten Instrumente sind in https://micro-manager.org/Device_Support aufgeführt. In der Materialtabelle finden Sie Details zu den anzuschließenden Instrumenten. Installieren Sie Treiber oder offizielle/Support-Software und verbinden Sie das Gerät über ein USB-Kabel mit dem Computer.
3. Fügen Sie die Instrumente mithilfe des Hardwarekonfigurationsassistenten zu Micro-Manager hinzu.
   1. Öffnen Sie die Software und wählen Sie Keine aus der anfänglichen Dropdown-Liste aus.
   2. Wählen Sie Geräte | Hardware-Konfigurations-Assistent... | Erstellen Sie eine neue Konfiguration und klicken Sie auf Weiter, um die Konfigurationsseite aufzurufen.
   3. Suchen Sie das Plug-In Kamera / Laser / Tisch / Datenerfassung / Mikroskop in der Dropdown-Hardwareliste und klicken Sie auf Hinzufügen | OK | Weiter.
   4. Gehen Sie zu Standardgeräte auswählen und wählen Sie die Einstellung für den automatischen Verschluss. Legen Sie die Standardkamera, den Standardauslöser und die Standardfokusstufe fest. Klicken Sie auf Weiter , bis Konfiguration und Beenden speichern erreicht ist, und speichern Sie den Namen der Konfigurationsdatei. Klicken Sie auf Fertig stellen.
4. Allgemeine Vorlageneinstellungen
   1. Speichern Sie eine Vorlage für den Live-Modus und den SIM-Snap-Modus.
   2. Stellen Sie die Belichtungszeit und den Auslösemodus wie folgt ein: Wählen Sie in den Konfigurationseinstellungen Gruppe ' +', benennen Sie den Gruppennamen als 'Modus', wählen Sie Belichtungs - und Auslösemodus und klicken Sie auf OK.
   3. Wählen Sie Voreinstellung '+' , um verschiedene Voreinstellungen für die Gruppe 'Modus' hinzuzufügen. Nennen Sie eine Voreinstellung "live" für die Belichtungseinstellungen im Live-Modus und eine andere "SIM" für den SIM-Modus. Stellen Sie beispielsweise im Live-Modus die Belichtungszeit auf 15 ms ein, während Sie im SIM-Snap-Modus 10 ms auf die Belichtungszeit einstellen und der Auslösemodus Standard (Überlappung) ist.
      HINWEIS: In unserem Code-Repository ist eine Konfigurationsdatei (MMConfig_psim_demo.cfg) enthalten, die direkt von Micro-Manager 2.0 geladen werden kann.

3. Systemkalibrierung mit fluoreszierenden Kügelchen

1. Tauchen Sie die Deckgläser in 75%iges Ethanol, spülen Sie die Deckgläser 3x mit entionisiertem Wasser (ddH₂O) ab und trocknen Sie sie.
2. Die 100 nm fluoreszierenden Kügelchen (verdünnt auf 1:1.000 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS]) vortexen und die Suspension direkt auf die Deckgläser pipettieren. 5-10 Minuten in dunkler Umgebung inkubieren und dann vorsichtig mit PBS waschen.
3. Geben Sie 20 μl Eindeckmedium auf den Objektträger und positionieren Sie das Deckglas darüber, wobei Sie darauf achten, dass keine Blasen entstehen. Halten Sie die Temperatur bei 4 °C und halten Sie den Objektträger im Dunkeln, damit der Objektträger mit 100 nm fluoreszierenden Kügelchen für die Systemkalibrierung vorbereitet ist.
4. Nehmen Sie für pSIM drei Bilder der drei verschiedenen Phasen von fluoreszierenden Kügelchen auf. Ein benutzerdefinierter MATLAB-Code (Bead_calib.m) nimmt die Bilder als Eingabe und gibt zwei Kalibrierungsbilder (calib1.tif, calib2.tif) zur weiteren Analyse aus.
   HINWEIS: Wie bereits in⁵ gezeigt, kann das pSIM-Experiment auf den meisten kommerziellen Systemen durchgeführt werden. Bei selbstgebauten oder kommerziellen SIM-Mikroskopen ist eine Systemkalibrierung erforderlich, um den Messfehler von Fluoreszenzdipolen zu eliminieren, der durch die ungleichmäßige Beleuchtung in drei Musterrichtungen verursacht wird. Das Kalibrierungsexperiment geht von der isotropen Polarisation fluoreszierender Kügelchen aus und benötigt nur die Rohbilder während der SIM-Aufnahme. Ein detailliertes Kalibrierungsverfahren ist in unserer Originalarbeit^{enthalten 5}. Die Ausgabe von zwei Kalibrierungsbildern calib1.tif und calib2.tif ist für die pSIM-Rekonstruktion erforderlich, die die pixelweise Beleuchtungsenergie der Musterrichtung 2 angibt; 3 bezieht sich auf Musterrichtung 1.

4. Probenvorbereitung: Aktin in fixierten Zellen

1. Tauchen Sie die Deckgläser in 75%iges Ethanol, spülen Sie die Deckgläser 3x mit ddH₂O aus. Legen Sie die Deckgläser in eine Sechs-Well-Zellkulturplatte.
2. Kultur von U2OS-Zellen (ATCC HTB-96-Zelllinie) in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 °C und 5 % CO₂ auf Deckgläsern, bis sie eine Konfluenz von etwa 75 % erreichen.
3. Waschen Sie die Zellen vorsichtig 3x mit PBS. Zur Zellfixierung 4% Paraformaldehyd 15 min lang bei Raumtemperatur auftragen. Nach der Fixierung die Zellen noch einmal 3x mit PBS waschen.
4. Um die Membranpermeabilität zu verbessern, behandeln Sie die Zellen 5 Minuten lang mit 0,1 % Triton X-100 in PBS und waschen Sie die Zellen dann 3x mit PBS.
5. Fluoreszierendes Phalloidin mit 150 μl DMSO für Stammlösung (66 μM) auflösen. Bereiten Sie die Phalloidin-Farbstoff-Arbeitslösung vor, indem Sie 5 μl der Stammlösung in 995 μl PBS verdünnen. Inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln mit Phalloidin-Farbstoff-Arbeitslösung bei Raumtemperatur für ~1 h. Waschen Sie die Zellen 3 x 3 min mit PBS.
6. Geben Sie 20 μl Eindeckmedium auf den Objektträger. Legen Sie das Deckglas vorsichtig und blasenfrei auf den Objektträger. Lagern Sie den Objektträger bei 4 °C und bewahren Sie ihn an einem dunklen Ort auf.

5. Probenvorbereitung: in-vitro λ-DNA

1. Lösen Sie 0,5 g Polymethylmethacrylat in 10 ml Prothesenbasismaterialien. Tragen Sie nach der gründlichen Auflösung die Lösung gleichmäßig auf die Oberfläche des Objektträgers auf und warten Sie dann, bis sie verdunstet ist, um einen Film zu bilden.
2. 0,3 μl λ-DNA und 32 μl 1.000x SYTOX Orange Nukleinsäure-Färbung in 968 μl PBS verdünnen. Geben Sie 1 μl der vorbereiteten Lösung auf den Objektträger und lassen Sie ihn trocknen.
3. Versiegeln Sie das Deckglas mit dem Eindeckmittel auf dem Objektträger, um die Probe zu schützen und zu konservieren. Lagern Sie den Objektträger bei 4 °C in einer dunklen Umgebung.

6. Bildgebung

1. Setzen Sie das Deckglas auf den Probenhalter und stellen Sie es im Live-Modus auf die Fokusebene ein. Wählen Sie einen ROI von 512 x 512 Pixeln und passen Sie die Belichtungszeit und die Laserintensität an.
2. Öffnen Sie die unabhängige Steuerungssoftware des Raumlichtmodulators und wählen Sie den geeigneten Sequenzpfad für das Beleuchtungsmuster für pSIM / 3DOM oder den Live-Modus.
   HINWEIS: Bei pSIM umfasst das Beleuchtungsmuster drei verschiedene Polarisationswinkel und drei verschiedene Phasen. Bei 3DOM umfasst das Beleuchtungsmuster sechs verschiedene Polarisationswinkel.
3. Wählen Sie den SIM-Aufnahmemodus , wählen Sie Multi-D Acq., wählen Sie Time Points und stellen Sie die Anzahl (9 oder 6 Bilder für pSIM oder 3DOM) und das Intervall (0 ms) im geöffneten Fenster ein. Klicken Sie auf Erwerben!
4. Klicken Sie auf TriggerSLM.bsh (eine Konfigurationsdatei ist in unserem Code-Repository enthalten)), die MyDaq-Erfassungskarte aktiviert den räumlichen Lichtmodulator, um die Bilder aufzunehmen.

7. Live-View-Plugin von pSIM und 3DOM

1. Konfigurieren Sie die FakeCamera und den Bildzugriffspfad: Laden Sie das Skript (MMConfig_FakeCam_demo.cfg), indem Sie auf Geräte | Hardwarekonfiguration laden.... Konfigurieren Sie das lokale Verzeichnis der Bilder unter Geräte | Eigenschaftenbrowser "Geräte"... | Kamerapfadmaske (Abbildung 2A-C).
   HINWEIS: Der Erfassungsteil des Skripts hängt von der Hardware-Konfiguration ab, daher haben wir eine Version (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) bereitgestellt, die das FakeCamera-Gerät verwendet, um lokale Bilder auf der Festplatte zu Demonstrationszwecken zu lesen. Benutzer können Änderungen in unserer Version vornehmen. Denken Sie daran, den Bildlesepfad (Kamera-Pfad-Maske) zu ändern.
2. Stellen Sie das Schnellzugriffsfeld ein, indem Sie auf Extras | Schnellzugriff Paneel | Neues Panel erstellen. Klicken Sie auf das Symbol "Einstellungen " in der unteren linken Ecke und aktivieren Sie "Run Script" im oberen Teil, wodurch die Dateien "psim.bsh" und "3DOM.bsh" geladen werden können (Abbildung 2D).
   HINWEIS: Das Schnellzugriffspanel-System ermöglicht es Benutzern, benutzerdefinierte Fenster zu erstellen und einfach auf die Steuerelemente im Micro-Manager zuzugreifen, was am häufigsten benötigt wird. "Live", "Snap" oder andere Kanäle können ebenfalls hinzugefügt werden, wie in Abbildung 2D dargestellt.
3. Führen Sie am Beispiel von pSIM eine Echtzeit-Polarisationsbildrekonstruktion durch, indem Sie auf "psim.bsh" klicken. Beobachten Sie die in Echtzeit rekonstruierten Bilder mit Polarisationsergebnissen (Abbildung 2E). Denken Sie daran, den Pfad der Kalibrierungsbilder in der Datei 'psim.bsh' zu ändern (calibPath = " Pfad zur Datei mit den Kalibrierungsbildern").
   HINWEIS: Das Live-View-Plugin ist ein Beanshell-Skript (psim.bsh und 3DOM.bsh), das im Skript-Panel ausgeführt werden kann. Das Plugin erfasst neun Bilder für pSIM oder sechs Bilder für 3DOM und berechnet die Ergebnisse des Orientation-Mappings basierend auf den Weitfeldbildern. Die Orientation-Mapping-Bilder werden so angezeigt, dass sie Echtzeit-Polarisationsinformationen liefern, die trotz der geringen Auflösung eine sofortige Inspektion ermöglichen.

8. Datenanalyse mit superauflösender Rekonstruktion

1. Installieren Sie MATLAB R2019b von der Website (siehe Materialtabelle).
2. Öffnen Sie die Software. Für die pSIM-Rekonstruktion erhalten Sie neun Bilder, die aus drei verschiedenen Phasen für jeden der drei Orientierungswinkel bestehen. Stellen Sie sicher, dass die Namen der neun Bilder zwischen '1.tif' und '9.tif' liegen, fügen Sie sie in die Datei mit dem Namen 'Input' ein und führen Sie das Programm mit dem Namen 'PSIM.m' aus. Beobachten Sie das rekonstruierte Weitfeldbild, das SIM-Bild und das pSIM-Bild mit dem Farbrad.
   HINWEIS: Die Rekonstruktion für pSIM erfordert zwei Schritte: einen SIM-Schritt und einen PM-Schritt. Die Daten werden von einem speziell geschriebenen MATLAB-Programm analysiert, um das Debuggen zu erleichtern. Rufen Sie den Rekonstruktionscode aus dem Ordner "reconsr" in GitHub ab.
3. Erfassen Sie für 3DOM sechs verschiedene Polarisationsrichtungen. Führen Sie die sechs Bilder zusammen, nennen Sie die resultierende Datei "Raw_data.tif" und führen Sie das Programm mit dem Namen "Recon_3DOM.m" aus. Betrachten Sie das rekonstruierte Weitfeldbild und das 3DOM-Bild mit azimutalen Ergebnissen und den Ergebnissen des Polarwinkels.
   HINWEIS: Während des Rekonstruktionsprozesses kann ein Fehler auftreten'--'Funktion oder Variable 'bfopen' wird nicht erkannt'. 'bfopen' ist eine Funktion in der Bioformate-Bibliothek und wird häufig zum Öffnen und Lesen von Bilddateien verwendet. Geben Sie addpath ('path_to_bioformats_toolbox') in das MATLAB-Befehlsfenster ein. Ersetzen Sie "path_to_bioformats_toolbox" durch den tatsächlichen Pfad des Bibliotheksordners. Außerdem haben wir dem GitHub-Repository die Abhängigkeit Bio-Formats hinzugefügt.

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Ergebnisse

Die pSIM-Methode kann an SIM-Mikroskopen durchgeführt werden, basierend auf der Interferenz mit s-polarisierten Laserstrahlen. s-Polarisationsinterferenz ist der am weitesten verbreitete SIM-Typ und erzeugt kontrastreiche Beleuchtungsstreifen. Der akademische Prototyp eines Mikroskopaufbaus ist in der Originalarbeit von pSIM⁵ enthalten. Ein räumlicher Lichtmodulator (SLM), der in Abbildung 1 kurz vor...

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Diskussion

In unserer Studie haben wir ein Plugin entwickelt, das eine Echtzeitvorschau von zwei Polarisationsbildgebungsverfahren, pSIM und 3DOM, ermöglicht. Beide Technologien können mit leichten Modifikationen in einem bestehenden SIM-System durchgeführt werden. Wir haben die detaillierten Schritte zur Installation des pSIM- und 3DOM-Mikroskops bereitgestellt und den Micro-Manager eingerichtet, um das Mikroskop zu steuern und zu demonstrieren, wie die Polarisationsergebnisse in der Live-Ansic...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nm Fluorescent beads	Invitrogen	F8801
4% Formaldehyde solution	Invitrogen	R37814
Camera	Tucsen	Dhyana 400BSI V3	https://www.tucsen.com/download-software/
Denture base materials (Type I Thermally setting type, liquid)	New Century Dental	N/A
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Gibco	C11995500BT
Eclipse TE2000 Inverted Microscope	Nikon	TE2000 E
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141C
MATLAB R2019b	MathWorks	Version R2019b	https://ww2.mathworks.cn/downloads/
MetroCon V4.0	Kopin	Version 4.0	Software of Spatial light modulator
Micro-Manager 2.0	μΜanager	Version 2.0	Download Micro-Manager Latest Release
MS-2000 XYZ Automated Stage	Applied Scientific Instrumentation	MIM3	https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/
myDAQ	National Instruments	781325-01	Software and Driver Downloads - NI
OBIS 561 nm LS 20 mW Laser	Coherent	1325777
Phalloidin-AF568	Invitrogen	A12380
Phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
Poly Methyl Methacrylate	Solarbio	M9810
ProLong Diamond	Invitrogen	P36980
Spatial light modulator	Kopin	SXGA-12
SYTOX orange nucleic acid stain	Invitrogen	S11368
Triton X-100	Invitrogen	HFH10
Trypsin	Gibco	25200056
λ-DNA	Invitrogen	S11368