Plug-in Micro-Manager de código aberto para imagens de visualização ao vivo de dipolos fluorescentes

Resumo

Desenvolvemos um plug-in Micro-Manager de código aberto, que permite a observação ao vivo de dipolos fluorescentes em um microscópio de iluminação estruturada. O plug-in suporta a observação da orientação do dipolo 2D e 3D.

Resumo

A microscopia de polarização de fluorescência (FPM) pode obter imagens da posição e orientação do dipolo dos fluoróforos. Apesar das conquistas da microscopia de polarização de fluorescência de super-resolução, sua dependência da pós-aquisição dificulta a observação em tempo real. A microscopia de iluminação estruturada polarizada (pSIM) oferece imagens de super-resolução de dipolos fluorescentes com velocidade de imagem rápida e é adequada para aplicações de células vivas. Desenvolvemos uma implementação de código aberto para reconstrução em tempo real de imagens de polarização e exibição dos dipolos fluorescentes. Além disso, estendemos o método para obter o mapeamento de orientação 3D (3DOM), ampliando sua utilidade para estudos biológicos complexos. Além disso, apresentamos uma introdução completa à extensão de um microscópio SIM existente em imagens de polarização e fornecemos um guia de configuração detalhado do Micro-Manager 2.0 para controlar o microscópio, permitindo a visualização em tempo real da imagem polarizada. Além disso, fornecemos o código MATLAB para reconstrução completa, abrangendo pSIM e 3DOM. Este guia abrangente tem como objetivo ajudar os iniciantes a dominar rapidamente e iniciar facilmente as operações.

Introdução

A microscopia de polarização de fluorescência (FPM) surgiu como uma técnica poderosa para obter imagens simultâneas da posição e da orientação do dipolo dos fluoróforos, oferecendo insights profundos sobre imagens biológicas ^1,2. Ao facilitar a observação da direção das orientações das biomoléculas, o FPM revela o intrincado arranjo de macromoléculas como actina ^3,4,5, microtúbulo⁵, septina⁶, filamento ^{de DNA 7-9}, complexo de poros nucleares¹⁰ e proteínas de membrana¹¹. Seus recursos de alta velocidade, não invasivos e compatíveis com células vivas permitem o rastreamento da dinâmica de rotação molecular com alta resolução temporal^11,12. Quando integrado com sondas de bioforça, o FPM não apenas mapeia as magnitudes de força na resolução subcelular, mas também mede as direções das forças, avançando assim nossa compreensão dos processos biomecânicos, revelando a direção das forças¹³.

Nas últimas décadas, a microscopia de polarização de fluorescência de super-resolução passou por uma rápida evolução. Um avanço notável neste campo é a microscopia de localização de orientação de molécula única, também denominada SMOLM, que pode localizar a posição e a orientação dos fluoróforos, permitindo assim a localização multidimensional. A medição de polarização no SMOLM pode ser realizada usando modulação de excitação de polarização⁷, detecção polarizada multicanal³ ou função de propagação de ponto sensível à polarização projetada (PSF) ¹⁴ . Apesar do SMOLM atingir resolução espacial da ordem de dezenas de nanômetros e medir a polarização de moléculas individuais, ele sofre com o tempo de imagem prolongado. Isso se deve aos ciclos repetitivos de piscar e localização de fluoróforos, que representam um desafio para imagens de taxa de vídeo e aplicações de células vivas.

Em contraste, a microscopia de iluminação estruturada polarizada (pSIM) oferece uma resolução espacial de aproximadamente até 100 nm, juntamente com a aquisição de informações de polarização com o mesmo conjunto de dados SIM. Notavelmente, o pSIM pode atingir velocidades de imagem de taxa de vídeo e é altamente compatível com imagens de células vivas, sem requisitos rigorosos em moléculas fluorescentes. Recentemente, o pSIM revelou com sucesso a estrutura do anel de actina no esqueleto periódico associado à membrana (MPS) ⁵ e permitiu o mapeamento de super-resolução de forças biológicas¹³ .

No entanto, o pSIM requer reconstrução de imagem pós-aquisição, o que impede a visualização em tempo real dos resultados da polarização. Esse atraso dificulta a observação imediata do fenômeno biológico, impedindo que os pesquisadores capturem rapidamente os fenômenos biológicos de interesse e façam ajustes em tempo real nas amostras e nas condições de imagem. Para resolver essa limitação, desenvolvemos uma implementação de código aberto que facilita a aquisição de imagens e a reconstrução e exibição em tempo real dos resultados de polarização, com base na plataforma ImageJ e Micro-Manager (https://github.com/KarlZhanghao/live-pol-imaging).

Além disso, embora o pSIM tenha se limitado a fornecer informações de polarização 2D no plano, recentemente estendemos seus recursos para obter mapeamento de orientação 3D usando quase o mesmo equipamento¹⁵, denominado mapeamento de orientação 3D (3DOM). Este software de código aberto também fornece o controle, reconstrução e visualização do 3DOM. Os módulos de reconstrução e visualização também são compatíveis com o aplicativo de rastreamento de orientação de molécula única. Todas essas funcionalidades aumentam a utilidade da imagem de polarização em estudos biológicos complexos.

Protocolo

1. Extensão de um microscópio de iluminação estruturada existente para imagens de polarização

1. Prepare um microscópio SIM.
   NOTA: Assumimos que os leitores têm uma certa base na configuração do microscópio e já possuem um microscópio de luz estruturado. Se você não tiver experiência relevante, consulte este artigo, que fornece uma descrição detalhada de como construir um microscópio SIM¹⁶. A unidade de controle de polarização de "HWP+WQP+LCVR" pode ser substituída por uma placa de onda de vórtice de pizza em nosso trabalho pSIM⁵ ou uma placa de meia onda de pizza¹⁷.
2. Meça as taxas de extinção de polarização de três direções carregando diferentes padrões no modulador de luz espacial (SLM). Coloque e gire um polarizador logo após a objetiva e use um medidor de potência para medir a potência do laser. Para pSIM, gire a placa de onda para manter a polarização s de três direções com taxa de extinção > 10.
3. Para 3DOM, gire o HWP2 para manter a polarização p de seis direções. Substitua a máscara espacial do SIM pela máscara espacial 3DOM para permitir a passagem de feixes de 1 ordem de seis direções (consulte a Figura 1B).
   NOTA: a polarização s é necessária no pSIM enquanto a polarização p é necessária no 3DOM. A configuração detalhada está incluída em outro lugar para pSIM⁵ e 3DOM¹⁵.

2. Configuração do Micro-Manager

1. Baixe a versão Micro-Manager 2.0 do site oficial, instale o software seguindo as instruções.
2. Prepare os drivers de dispositivo e o software correspondentes para se conectar com êxito ao sistema Micro-Manager. Neste sistema de microscópio, use o Micro-Manager para controlar a câmera, o estágio de translação, o laser, a placa DAQ e o microscópio.
   NOTA: Os instrumentos suportados estão listados em https://micro-manager.org/Device_Support. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre os instrumentos a serem conectados. Instale drivers ou software oficial/de suporte e conecte o instrumento ao computador usando um cabo USB.
3. Adicione os instrumentos ao Micro-Manager usando o Assistente de Configuração de Hardware.
   1. Abra o software e selecione Nenhum na lista suspensa inicial.
   2. Selecionar dispositivos | Assistente de configuração de hardware... | Crie uma nova configuração e clique em Avançar para entrar na página de configuração.
   3. Localize o plug-in Câmera/Laser/Platina/DAQ/microscópio na lista suspensa de hardware e clique em Adicionar | ESTÁ BEM | A seguir.
   4. Vá para Selecionar dispositivos padrão e escolha a configuração do obturador automático. Defina a câmera padrão, o obturador padrão e o estágio de foco padrão. Clique em Avançar até que Salvar configuração e sair seja alcançado e salve o nome do arquivo de configuração. Clique em Concluir.
4. Configurações comuns de modelo
   1. Salve um modelo para o modo ao vivo e o modo de snap do SIM.
   2. Defina o tempo de exposição e o modo de disparo da seguinte forma: escolha Grupo '+' em Definições de configuração, nomeie o nome do grupo como 'Modo', selecione Modo de exposição e disparo, clique em OK.
   3. Escolha Predefinição '+' para adicionar predefinições diferentes para o grupo 'Modo'. Nomeie uma predefinição 'ao vivo' para configurações de exposição do modo ao vivo e outra 'SIM' para o modo SIM. Por exemplo, no modo 'ao vivo', defina o tempo de exposição para 15 ms, enquanto para o modo de snap do SIM, defina 10 ms para o tempo de exposição e o modo de disparo é Padrão (Sobreposição).
      NOTA: Um arquivo de configuração (MMConfig_psim_demo.cfg) está incluído em nosso repositório de código, que pode ser carregado diretamente pelo Micro-Manager 2.0.

3. Calibração do sistema com esferas fluorescentes

1. Mergulhe as lamínulas em etanol a 75%, lave as lamínulas 3x com água deionizada (ddH₂O) e seque-as.
2. Vortex as esferas fluorescentes de 100 nm (diluídas a 1:1.000 com solução salina tamponada com fosfato [PBS]) e pipetar a suspensão diretamente nas lamínulas. Incube por 5-10 min em um ambiente escuro e, em seguida, lave suavemente com PBS.
3. Adicione 20 μL de meio de montagem na lâmina do microscópio e posicione a lamínula sobre ela, certificando-se de evitar bolhas. Mantenha a temperatura a 4 °C e mantenha a lâmina no escuro, para que a lâmina com esferas fluorescentes de 100 nm esteja preparada para a calibração do sistema.
4. Para pSIM, adquira três imagens das três fases diferentes de esferas fluorescentes. Um código MATLAB personalizado (Bead_calib.m) pega as imagens como entrada e gera duas imagens de calibração (calib1.tif, calib2.tif) para análise posterior.
   NOTA: Conforme demonstrado anteriormente⁵, o experimento pSIM pode ser realizado na maioria dos sistemas comerciais. Em microscópios SIM construídos em casa ou comerciais, a calibração do sistema é necessária para eliminar o erro de medição de dipolos fluorescentes, causado pela iluminação não uniforme durante três direções de padrão. O experimento de calibração assume a polarização isotrópica de esferas fluorescentes e requer apenas as imagens brutas durante a aquisição do SIM. O procedimento de calibração detalhado está incluído em nosso trabalho original⁵. A saída de duas imagens de calibração calib1.tif e calib2.tif é necessária para a reconstrução do pSIM, que indica a energia de iluminação pixel a pixel da direção 2 do padrão; 3 refere-se à direção do padrão 1.

4. Preparação da amostra: actina em células fixas

1. Mergulhe as lamínulas em etanol a 75%, lave as lamínulas 3x com ddH₂O. Coloque as lamínulas em uma placa de cultura de células de seis poços.
2. Cultura de células U2OS (linhagem celular ATCC HTB-96) em Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% (v/v) de Soro Fetal Bovino (FBS) a 37 °C e 5% de CO₂ em lamínulas até atingirem aproximadamente 75% de confluência.
3. Lave suavemente as células 3x com PBS. Para fixação celular, aplique paraformaldeído a 4% por 15 min em temperatura ambiente. Após a fixação, lave as células 3x novamente com PBS.
4. Para aumentar a permeabilidade da membrana, trate as células com 0,1% de Triton X-100 em PBS por 5 min e, em seguida, lave as células 3x com PBS.
5. Dissolva a faloidina fluorescente com 150 μL de DMSO para solução estoque (66μM). Prepare a solução de trabalho do corante de faloidina diluindo 5 μL da solução estoque em 995 μL de PBS. Incube as células no escuro com a solução de trabalho do corante Faloidina à temperatura ambiente por ~ 1 h. Lave as células por 3 x 3 min com PBS.
6. Adicione 20 μL de meio de montagem na lâmina do microscópio. Coloque cuidadosamente a lamínula na lâmina sem bolhas. Guarde a lâmina a 4 °C e guarde-a em local escuro.

5. Preparação da amostra: λ-DNA in vitro

1. Dissolva 0,5 g de Polimetilmetacrilato em 10 mL de materiais de base de prótese. Após a dissolução completa, aplique uniformemente a solução na superfície da lâmina e espere que ela evapore para formar um filme.
2. Diluir 0,3 μL de λ-DNA e 32 μL de 1.000x SYTOX Orange Nucleic Acid Stain em 968 μL de PBS. Adicione 1 μL da solução preparada à lâmina e deixe secar.
3. Sele a lamínula na lâmina com o suporte para proteger e preservar a amostra. Armazene a lâmina a 4 °C em um ambiente escuro.

6. Exames de imagem

1. Coloque a lamínula no suporte de amostra e ajuste ao plano focal no modo ao vivo. Selecione um ROI de 512 x 512 pixels e ajuste o tempo de exposição e a intensidade do laser.
2. Abra o software de controle independente do modulador de luz espacial e escolha o caminho de sequência de padrão de iluminação apropriado para pSIM / 3DOM ou modo ao vivo.
   NOTA: Para pSIM, o padrão de iluminação inclui três ângulos de polarização diferentes e três fases diferentes. Para 3DOM, o padrão de iluminação inclui seis ângulos de polarização diferentes.
3. Selecione o modo de captura do SIM , selecione Multi-D Acq., escolha Pontos de tempo e defina a contagem (9 ou 6 imagens para pSIM ou 3DOM) e o intervalo (0 ms) na janela aberta. Clique em Adquirir!
4. Clique em TriggerSLM.bsh (um arquivo de configuração está incluído em nosso repositório de código), o cartão de aquisição MyDaq ativa o modulador de luz espacial para tirar as fotos.

7. Plug-in de visualização ao vivo de pSIM e 3DOM

1. Configure a FakeCamera e o caminho de acesso à imagem: carregue o script (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) clicando em Dispositivos | Carregar configuração de hardware.... Configurar o diretório local de imagens em Dispositivos | Navegador de propriedades de dispositivos... | Máscara de caminho da câmera (Figura 2A-C).
   NOTA: A parte de aquisição do script depende da configuração do hardware, por isso fornecemos uma versão (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) usando o dispositivo FakeCamera para ler imagens locais no disco rígido para demonstração. Os usuários podem fazer alterações em nossa versão. Lembre-se de alterar o caminho de leitura da imagem (máscara Camera-Path).
2. Defina o Painel de Acesso Rápido clicando em Ferramentas | Painel de Acesso Rápido | Crie um novo painel. Clique no ícone Configurações no canto inferior esquerdo, droga 'Run Script' para a parte superior, que pode carregar o 'psim.bsh' e '3DOM.bsh' (Figura 2D) .
   NOTA: O sistema Quick Access Panel permite que os usuários criem janelas personalizadas e acessem facilmente os controles no Micro-Manager, que são necessários com mais frequência. 'Ao vivo', 'Snap' ou outros canais também podem ser adicionados, conforme mostrado na Figura 2D.
3. Tomando o pSIM como exemplo, execute a reconstrução da imagem de polarização em tempo real clicando em 'psim.bsh'; observe as imagens reconstruídas em tempo real com resultados de polarização (Figura 2E). Lembre-se de alterar o caminho das imagens de calibração no arquivo 'psim.bsh' (calibPath = " caminho para o arquivo de imagens de calibração").
   NOTA: O plug-in live-view é um script beanshell (psim.bsh e 3DOM.bsh), que pode ser executado no Painel de Scripts. O plug-in adquire nove imagens para pSIM ou seis imagens para 3DOM e calcula os resultados do mapeamento de orientação com base nas imagens de campo amplo. As imagens de mapeamento de orientação são exibidas para fornecer informações de polarização em tempo real, o que facilita a inspeção imediata, apesar de sua baixa resolução.

8. Análise de dados com reconstrução de super-resolução

1. Instale o MATLAB R2019b a partir do website (consulte a Tabela de Materiais).
2. Abra o software; para a reconstrução do pSIM, obtenha-se nove imagens, consistindo em três fases diferentes para cada um dos três ângulos de orientação. Certifique-se de que os nomes das nove imagens sejam de '1.tif' a '9.tif', coloque-os no arquivo chamado 'Input' e execute o programa chamado 'PSIM.m'. Observe a imagem de campo amplo reconstruída, a imagem SIM e a imagem pSIM com a roda de cores.
   NOTA: A reconstrução do pSIM precisa de duas etapas: uma etapa do SIM e uma etapa de PM. Os dados são analisados por um programa MATLAB personalizado para facilitar a depuração. Obtenha o código de reconstrução da pasta 'reconsr' no GitHub.
3. Para 3DOM, capture seis figuras diferentes de direções de polarização. Mescle as seis imagens, nomeie o arquivo resultante como 'Raw_data.tif' e execute o programa chamado 'Recon_3DOM.m'. Observe a imagem de campo amplo reconstruída e a imagem 3DOM com resultados azimutais e os resultados do ângulo polar.
   NOTA: Durante o processo de reconstrução, pode ocorrer um erro'--'função ou variável 'bfopen' não é reconhecida'. 'bfopen' é uma função na biblioteca de bio-formatos e é comumente usada para abrir e ler arquivos de imagem. Insira addpath ('path_to_bioformats_toolbox') na janela de comando do MATLAB. Substitua 'path_to_bioformats_toolbox' pelo caminho real da pasta da biblioteca. Também adicionamos a dependência Bio-Formats ao repositório GitHub.

Resultados

O método pSIM pode ser realizado em microscópios SIM com base na interferência usando feixes de laser polarizados s. A interferência de polarização s é o tipo de SIM mais amplamente utilizado e gera faixas de iluminação de alto contraste. O protótipo acadêmico de uma configuração de microscópio está incluído no trabalho original do pSIM⁵. Brevemente introduzido na Figura 1, um modulador...

Discussão

Em nosso estudo, desenvolvemos um plugin que permite a visualização em tempo real de duas técnicas de imagem de polarização, pSIM e 3DOM. Ambas as tecnologias podem ser executadas em um sistema SIM existente com pequenas modificações. Fornecemos as etapas detalhadas para instalar o microscópio pSIM e 3DOM e configurar o Micro-Manager para controlar o microscópio e demonstrar como obter os resultados de polarização de visualização ao vivo. Os resultados experimentais incluem ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nm Fluorescent beads	Invitrogen	F8801
4% Formaldehyde solution	Invitrogen	R37814
Camera	Tucsen	Dhyana 400BSI V3	https://www.tucsen.com/download-software/
Denture base materials (Type I Thermally setting type, liquid)	New Century Dental	N/A
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Gibco	C11995500BT
Eclipse TE2000 Inverted Microscope	Nikon	TE2000 E
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141C
MATLAB R2019b	MathWorks	Version R2019b	https://ww2.mathworks.cn/downloads/
MetroCon V4.0	Kopin	Version 4.0	Software of Spatial light modulator
Micro-Manager 2.0	μΜanager	Version 2.0	Download Micro-Manager Latest Release
MS-2000 XYZ Automated Stage	Applied Scientific Instrumentation	MIM3	https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/
myDAQ	National Instruments	781325-01	Software and Driver Downloads - NI
OBIS 561 nm LS 20 mW Laser	Coherent	1325777
Phalloidin-AF568	Invitrogen	A12380
Phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
Poly Methyl Methacrylate	Solarbio	M9810
ProLong Diamond	Invitrogen	P36980
Spatial light modulator	Kopin	SXGA-12
SYTOX orange nucleic acid stain	Invitrogen	S11368
Triton X-100	Invitrogen	HFH10
Trypsin	Gibco	25200056
λ-DNA	Invitrogen	S11368