Un sistema microfisiológico cardíaco para estudiar la propagación de Ca2+ a través de la estimulación óptica no genética

Resumen

El uso de la luz para controlar las células y los tejidos cardíacos permite la estimulación sin contacto, preservando así el estado natural y la función de las células, lo que lo convierte en un enfoque valioso tanto para la investigación básica como para las aplicaciones terapéuticas.

Resumen

Los modelos microfisiológicos cardíacos in vitro son muy fiables para la investigación científica, el desarrollo de fármacos y las aplicaciones médicas. A pesar de su gran aceptación por parte de la comunidad científica, estos sistemas siguen teniendo una longevidad limitada debido a la ausencia de técnicas de estimulación no invasivas. Los fototransductores proporcionan un método de estimulación eficiente, ofreciendo un enfoque inalámbrico con alta resolución temporal y espacial, al tiempo que minimizan la invasividad en los procesos de estimulación. En este manuscrito presentamos un método totalmente óptico para estimular y detectar la actividad de un modelo microfisiológico cardíaco in vitro. Específicamente, fabricamos tejidos anisotrópicos laminares de ingeniería mediante la siembra de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC-CM) generados en un cultivo en suspensión de biorreactor 3D. Empleamos un fototransductor, un derivado anfifílico del azobenceno, llamado Ziapin2, para la estimulación y un colorante Ca²⁺ (X-Rhod 1) para monitorear la respuesta del sistema. Los resultados demuestran que Ziapin2 puede fotomodular las respuestas de Ca²⁺ en el sistema empleado sin comprometer la integridad, la viabilidad o el comportamiento del tejido. Además, demostramos que el enfoque de estimulación basada en la luz ofrece una resolución similar en comparación con la estimulación eléctrica, el estándar de oro actual. En general, este protocolo abre perspectivas prometedoras para la aplicación de Ziapin2 y la fotoestimulación basada en materiales en la investigación cardíaca.

Introducción

El uso de la luz para estimular células y tejidos vivos está emergiendo como un cambio significativo en la investigación biomédica, ya que ofrece capacidades de estimulación sin contacto con una resolución temporal y espacial precisa 1,2,3,4,5,6. Una de las principales técnicas utilizadas para hacer que las células sean sensibles a la luz es la optogenética, que consiste en modificar genéticamente las células para que expresen canales o bombas iónicas sensibles a la luz ^7,8. Este enfoque ha demostrado una eficacia impresionante en la regulación de las células dentro del tejido vivo; Sin embargo, su dependencia de la transferencia de genes virales ha obstaculizado su adopción generalizada en la investigación y las aplicaciones clínicas.

Para superar esta limitación, se han utilizado materiales orgánicos e inorgánicos como transductores sensibles a la luz para desarrollar técnicas de estimulación mediadas por luz no genéticas y basadas en materiales ^9,10. Los fototransductores nanoestructurados orgánicos 11,12,13,14,15 han demostrado recientemente un éxito notable en el desencadenamiento de respuestas celulares en diversas aplicaciones, incluidas las neuronas, los cardiomiocitos y las células del músculo esquelético.

En este trabajo, proponemos Ziapin2 16,17,18, un derivado del azobenceno, para investigar la propagación de Ca ²⁺ en tejidos cardíacos laminares diseñados. La estructura anfifílica de la molécula permite una orientación precisa de la membrana plasmática celular, mientras que el núcleo de azobenceno permite la isomerización inducida por la luz, lo que conduce a su cambio conformacional 16,17,18. En las células cardíacas, esta isomerización trans-a-cis altera el espesor de la membrana plasmática, induciendo una cascada de efectos que genera un potencial de acción, que a su vez desencadena el proceso de excitación-contracción 19,20,21.

Además, describimos el proceso de fabricación de una plataforma de ingeniería para el crecimiento anisotrópico del tejido cardíaco²² y detallamos la configuración experimental utilizada para desencadenar y monitorear ópticamente su actividad, con un enfoque particular en la adquisición de la dinámica de Ca²⁺ dentro del tejido^23,24. Finalmente, comparamos las señales adquiridas con las obtenidas a través de la estimulación eléctrica, que se considera el estándar de referencia. En general, este protocolo destaca la aplicación de un nuevo transductor sensible a la luz para avanzar en nuestra comprensión del comportamiento de las células cardíacas, especialmente en el contexto de los tejidos diseñados.

Protocolo

El cultivo de células madre pluripotentes humanas (hiPSC) utilizado es una línea de iPSC masculina humana de tipo salvaje que alberga un sistema CRISPR/Cas9 inducible por doxiciclina (Dox), creado mediante la introducción de CAGrtTA::TetO-Cas9 en el locus AAVS1 (Addgene: #73500). El estudio se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Boston Children's Hospital. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes antes de su participación en el estudio. Se indujo la generación de cardiomiocitos derivados de hiPSC (hiPSC-CMs) como se describió anteriormente^25,26. El protocolo se resumirá brevemente en la siguiente sección:

1. Generación y preparación de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas

1. Lave las hiPSC que se cultivan en matraces T75 una vez con PBS. Separe las células incubándolas con el agente quelante Versene durante 10-15 min y siembre en recipientes de biorreactor pretratados con una solución al 1% de surfactante no iónico a una densidad de 50 millones de IPSC/recipiente en 100 mL de medio E8 suplementado con 10 μM de inhibidor de ROCK Y-27632.
2. Ajuste los siguientes parámetros del biorreactor: agitación 60 rpm, temperatura 37 °C, pH 7 y gasificación de recubrimiento (O₂ y CO₂) a 3 L/h estándar.
3. Después de 1 día en cultivo, confirme que el diámetro del cuerpo embrioide (EB) ha alcanzado 100-300 μm y trate las células con medio RPMI básico (medio RPMI 1640 suplementado con B27 menos insulina), que contiene 7 μM CHIR99021 durante 24 h, seguido de un cambio de medio a RPMI durante otras 24 h. Añadir medio RPMI básico que contenga 5 μM IWR-1-endo durante otras 48 h para iniciar el proceso de diferenciación hacia el linaje cardíaco. Después de 48 h, vuelva a cambiar el medio a RPMI básico.
4. En el día 7 de diferenciación, se cultivaron células en un medio RPMI básico suplementado con insulina humana 1:1.000 (v/v). Actualice los medios cada 2 días o todos los días con un cambio de medio del 50% si el consumo de oxígeno alcanza más del 30%.
5. En el día 15, disociar enzimáticamente las células del biorreactor durante 3 h utilizando una solución de colagenasa II que contenga HBSS, colagenasa II (200 unidades/mL), HEPES (10 mM), inhibidor de ROCK Y-27632 (10 μM) y N-bencil-p-toluenosulfonamida (BTS, 30 μM). Para ello, primero lavar los EBs diferenciados hiPSC-CM 2x con HBSS precalentado e incubarlos en solución de Colagenasa II (200 μl de volumen de EBs / 12 ml de solución de Colagenasa II) a 37 °C en CO₂ al 5% hasta que aparezcan células individuales de la disociación completa de EB.
6. Detenga la reacción de disociación agregando un volumen igual de tampón de bloqueo (RPMI-1640 sin B27 y DNasa II, con 6 μL de DNasa II por mL de RPMI-1640) a la suspensión de una sola célula. Cuente las hiPSC-CM diferenciadas, centrifugue (200 × g, 5 min) y prepárese para las aplicaciones posteriores congelando las celdas a -80 °C en isopropanol durante 24 h y trasladándolas a tanques de nitrógeno líquido hasta que se realice la siembra.

2. Fabricación de tejido laminar de ingeniería

1. Adherir dos capas de cinta de laboratorio, una blanca y otra azul, a una lámina acrílica transparente de 1 mm de grosor, resistente a los arañazos y a los rayos UV. Con un grabador láser de CO₂ , corte la lámina acrílica en círculos (20 mm de diámetro para adaptarse a los 12 MW) y el patrón de chips (3 cuadrados de 7,5 mm, tres por chip) en la cinta según lo diseñado en el software de gráficos vectoriales (por ejemplo, CorelDraw); parámetros de corte de acrílico: 100 potencia, 20 velocidades y 1.000 PPI; Parámetros de corte de cinta: 8 potencias, 6 velocidades y 1.000 PPI. Retire las dos capas de cinta adhesiva dentro de la línea más interna con pinzas, remoje las virutas en lejía pura durante 30 minutos a 1 h para eliminar las líneas gruesas y las manchas oscuras del corte, dejando una línea afilada, y enjuague las virutas en un vaso de precipitados con agua desionizada (DI) corriente durante la noche o durante al menos 3 h.
   NOTA: No lejía durante más de 2 h, ya que esto grabará los adhesivos en las paredes laterales, evitando que la gelatina se adhiera correctamente.
2. Sonicar los chips durante 10 min y los sellos de polidimetilsiloxano (PDMS, Sylgard 184) con características de ranura lineal (25 μm de ancho de cresta, 4 μm de ancho de ranura y 5 μm de profundidad de ranura) durante 30 min en etanol limpio al 70%. Transfiera las virutas y los sellos a un área limpia debajo de una campana y déjelos secar bajo el flujo de aire durante ~ 1-2 h.
3. Pesar 1 g de gelatina de piel porcina (concentración de gel ~175 g Bloom, Tipo A) en un tubo de 50 mL. Agregue 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y mezcle bien para asegurar la disolución inmediata de la gelatina. Coloque el tubo en un baño de agua a 65 °C durante 30 minutos para completar el proceso de disolución. Del mismo modo, pese 1 g de transglutaminasa microbiana (MTG) en un tubo separado de 50 ml. Añadir 12,5 mL de PBS, mezclar bien y colocar el tubo en un baño de agua a 37 °C durante 30 minutos para asegurar la disolución completa del MTG.
4. Sonicar el tubo de gelatina durante 15 min, luego devolverlo al baño de agua a 65 °C antes de usarlo. Coloque el tubo MTG en un desecador con la tapa ligeramente aflojada y encienda la aspiradora lentamente. Observe cómo se eliminan las burbujas de la solución de MTG al vacío. Después de la desgasificación, vuelva a colocar el tubo MTG en el baño de agua a 37 °C.
   NOTA: Supervise el proceso y ajuste el vacío para evitar una ebullición vigorosa.
5. Cubra una hoja de cuadrícula con parafilm limpio, coloque las fichas en la cuadrícula y mantenga el sello cerca, listo para usar. Añadir 5 mL de MTG a los 5 mL de solución de gelatina, pipeteando cuidadosamente para evitar burbujas; luego, pipetee rápidamente la gelatina en el chip, usando lo suficiente para cubrir el área del chip (aproximadamente 0,5 ml cada uno). A continuación, coloque el sello PDMS²² con patrón de línea (ancho de línea 25 μm, altura 5 μm, espaciado 4 μm) en la parte superior y aplique un peso de 200 g para asegurarse de que la gelatina tenga un patrón paralelo al eje longitudinal del tejido. Una vez que todas las fichas estén moldeadas, cúbralas con un frasco de vidrio para evitar perturbaciones ambientales y deje que se entrecrucen durante la noche.
   NOTA: Utilice la solución mezclada gelatine-MTG dentro de los 5 minutos; De lo contrario, el patrón objetivo se alterará debido a un mayor estado de reticulación de la gelatina.
6. Transfiera el sándwich de chip y sello PDMS a un nuevo plato P150 lleno de PBS e hidrate la gelatina durante 30 min a 1 h para facilitar la separación del sello PDMS del chip. Retire el exceso de gelatina sin moldear alrededor de la ficha y transfiera la ficha limpia a un nuevo plato P150 lleno de PBS. Almacene los sellos PDMS en etanol al 70%.
7. Esterilice las patatas fritas sumergiéndolas en etanol durante 10 minutos bajo el capó.
   NOTA: No exceda los 10 minutos en etanol, ya que una exposición más prolongada puede deformar la gelatina.
8. Transfiera las papas fritas a PBS, remoje durante 10 minutos y enjuague 3 veces. Prepare las soluciones de recubrimiento mezclando 20 μg/mL de fibronectina con una matriz de membrana basal diluida 1:100 en medios de cultivo (aproximadamente 0,5 mL por pocillo). Cubra las patatas fritas durante 2 h en la incubadora a 37 °C y 5% de_CO2 o a 4 °C durante la noche.
9. Descongele y siembre las células (8 × 10⁵ hiPSC-CMs por^cm2) en medio RPMI con Y-27632 (10 μM), luego reemplácelo con RPMI sin Y-27632 después de 24 horas.
10. Tres días después de la siembra de la célula, retire la cinta blanca con unas pinzas.

3. Síntesis y aplicación del fototransductor

NOTA: Ziapin2 se sintetizó de acuerdo con un procedimiento previamente publicado^16,18 y se administró a hiPSC-MCs directamente en el medio de cultivo.

1. Añadir 25 μM de Ziapin2 al cultivo celular e incubar a 37 °C y 5% de CO₂ durante 7 min.
2. Lave suavemente el exceso de moléculas y enjuague con un medio de cultivo fresco.

4. Ensayo de viabilidad

NOTA: Alamar Blue es un ensayo basado en resazurina que puede permear las células y actuar como un indicador redox para monitorear la viabilidad celular. La resazurina se disuelve en tampones fisiológicos, lo que da como resultado una solución azul profunda que se agrega directamente a las células en cultivo. Las células viables con metabolismo activo reducen la resazurina a resofurina, que es de color rosa y fluorescente.

1. Células en placa en una placa de 96 pocillos previamente recubierta con 20 μg/mL de fibronectina y matriz de membrana basal diluida 1:100 en medios de cultivo. Mezcle agitando y luego agregue asépticamente Alamar Blue a cada pocillo en una cantidad igual al 10% del volumen del pocillo.
2. Incubar cultivos con Alamar Blue durante 4 h.
3. Trate las células con el fototransductor y el vehículo (DMSO) como se describió anteriormente. Aplique estimulación lumínica (luz pulsada de 1 Hz durante 1 min) a través de una fibra óptica (cian, 470 nm) para evaluar el efecto de la internalización de Ziapin2 y la exposición a la luz en la viabilidad de hiPSC-CM.
4. Lea la fluorescencia con un lector de placas a 560 nm de excitación y emisión a 590 nm.

5. Evaluación de la anisotropía del tejido cardíaco laminar diseñado

NOTA: Este protocolo describe un enfoque sistemático para evaluar la anisotropía del tejido cardíaco laminar diseñado mediante inmunotinción, microscopía confocal y análisis de núcleos²⁷.

1. Lave el sustrato con PBS varias veces antes de la fijación con paraformaldehído al 4% (v/v) que contenga Triton X-100 al 0,05% (v/v) en PBS durante 10 min.
2. Bloquee la unión inespecífica incubando muestras con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% (p/v) en PBS durante 30 min.
3. Incubar muestras con Hoechst (1:500) a temperatura ambiente durante 1 h.
4. Lave con PBS antes de montarlo en portaobjetos de microscopio con un agente antidecoloración. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche y guárdelos a 4 °C hasta obtener la imagen.
5. Imágenes de muestras utilizando un microscopio confocal de disco giratorio con un aumento de 20x. Determine la orientación de las celdas usando OrientationJ Measure²⁸, un complemento de FiJi.

6. Grabaciones de mapeo óptico

NOTA: El mapeo óptico se realizó después de 5 días en cultivo en hiPSC-CMs sembrados en chips de tejido moldeados en gelatina.

1. Para seguir este protocolo, asegúrese de que el aparato de mapeo óptico consista en un microscopio de lente en tándem modificado equipado con una cámara de alta velocidad y la fuente de luz de excitación, una lámpara de mercurio de 200 mW. Coloque un espejo dicroico frente a la cámara de imágenes Ca²⁺ designada para asegurarse de que la preparación esté expuesta a la luz de excitación y para recoger la fluorescencia emitida procedente de la muestra.
2. Incubar la muestra con 2 μM de X-Rhod 1 añadidos al medio de cultivo durante 30 min a 37 °C.
   NOTA: Exponga la muestra a la luz solo durante la adquisición de la imagen para evitar el fotoblanqueo del tinte.
3. Incubar el fototransportador como se ha descrito anteriormente en la sección 3.
4. Lavar con medio de cultivo fresco y transferir las patatas fritas a un medio RPMI 1640 sin rojo fenol suplementado con B27 menos insulina.
5. Coloque los chips de tejido en un plato con temperatura controlada y comience a grabar a temperatura fisiológica (37 °C), adquiriendo imágenes a una velocidad de fotogramas de 2,5 fotogramas/s.
6. Para la estimulación óptica, aplique la estimulación puntual óptica en un extremo del tejido utilizando una fuente de luz LED (465/25 nm) que permita la estimulación Ziapin2. Marca el ritmo de los tejidos a una frecuencia de 0,5 o 1 Hz a través de una fibra óptica regulada temporalmente y colocada a 1 mm de distancia del tejido. Para la estimulación eléctrica, aplique una estimulación puntual utilizando un electrodo de platino bipolar colocado en el centro del extremo más distal del tejido rectangular. Esta colocación asegura que la propagación de la onda Ca²⁺ se origine desde el punto medio de la anchura del tejido, que corresponde al lado más corto del rectángulo. La estimulación debe aplicarse a una frecuencia de 0,5 Hz, con una amplitud de 10 V y una duración de pulso de 100 ms.
7. Después de las grabaciones, aplique un filtro espacial con un tamaño de píxel de 3 x 3 para mejorar la relación señal-ruido.
8. Determine la velocidad de conducción de la onda Ca²⁺ en cada píxel para cada pulso, calculando la tasa de cambio a lo largo de las direcciones x e y. Para ello, mida el gradiente espacial de la intensidad de la señal Ca²⁺ en estas direcciones y relaciónelo con el retardo temporal de la propagación de la señal. Al combinar estas tasas de cambio de dirección, cuantifique la rapidez con la que la onda viaja a través del campo celular en ambas dimensiones.

7. Exportación y tratamiento de datos

1. Extraiga y analice los datos con el software referenciado.
2. Aplique un filtro espacial de 3 x 3 píxeles para mejorar la relación señal-ruido.
3. Extraiga las trazas de transitorios (CaT) de Ca²⁺ como la media de una región de interés (ROI) específica seleccionada manualmente.
4. Mida los parámetros CaT en una región central de interés (ROI) de 50 x 50 píxeles (≈ 25 mm²).
5. Para cada CaT, analice la amplitud de CaT, el tiempo de subida (_{t pico}), el tiempo de la pendiente máxima de decaimiento (Pendiente de decaimiento máximo) y el tiempo hasta el 90% de decaimiento transitorio (Tiempo de decaimiento₉₀).

8. Análisis estadístico

1. Evaluar la normalidad de la distribución utilizando una prueba estadística adecuada, como una prueba de normalidad, para determinar si se deben aplicar métodos paramétricos o no paramétricos.
2. Evalúe la significación estadística entre dos condiciones utilizando la prueba t de Student o la prueba U de Mann-Whitney para datos continuos o categóricos, respectivamente. Al comparar más de dos grupos, se utiliza el ANOVA de un factor o la prueba de Kruskal-Wallis, en función de las suposiciones de los datos, seguida de pruebas post-hoc adecuadas para identificar diferencias significativas entre pares.

Resultados

Se desarrolló e implementó un proceso de varios pasos para la fabricación de tejido cardíaco laminar diseñado utilizando una combinación de técnicas de modelado láser, moldeo de gelatina y siembra de células. Originalmente establecida por McCain et ^al.22 y Lee et ^al.24, esta técnica fue reimplementada, siguiendo sus protocolos para construir los microtejidos laminares diseñados. El proceso integra patrones precisos basados en lá...

Discusión

Este enfoque proporciona una plataforma sólida para avanzar en la investigación cardíaca, proporcionando información sobre la compleja dinámica del tejido cardíaco, lo que abre nuevas posibilidades para estudios mecanicistas cardíacos in vitro a largo plazo que podrían conducir a nuevas estrategias terapéuticas. Para garantizar el éxito de esta metodología, es crucial reproducir un entorno microfisiológico que imite de cerca las condiciones in vivo del coraz...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
alamarBlue Cell Viability Reagent	Thermo Fisher Scientific	DAL1025	Cell Viability Assay
B-27 Supplement, minus insulin	Thermo Fisher Scientific	A1895601	For cell culture
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9056-50G	For cell staining
BrainVision Analyzer software	Brain Products	https://www.brainproducts.com/downloads/analyzer/	Data export and handling
BTS	Sigma	203895-5MG
CHIR99021	Stem Cell Technologies	72054
Clear Scratch- and UV-Resistant Acrylic Sheet, 12" x 12" x 0.01 inch	McMaster Carr	4076N11	Tissue chip fabrication
Collagenase Type II	Worthington	CLS-2 / LS004176
DNase II	VWR	89346-540
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	For cell culture
Fibronectin	VWR	47743-654	Coating
Gelatin from porcine skin gel strength 175 Type A	Sigma-Aldrich	G2625-100G	Tissue chip fabrication
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Coating
HBSS	Thermo Fisher	14175-095
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080
Hoechst 33342	Life technologies	H1399	For cell staining
Insulin solution human	Sigma Aldrich	I9278-5ML
IWR-1-endo	Stem Cell Technologies	72564
Paraformadehyde 16% Aqueous Solution (PFA)	VWR	100503-917	For cell staining
PBS, sterile, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	10010049	Tissue chip fabrication
phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	10010049
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)	Thermo Fisher Scientific	P3000MP	Non-ionic surfactant
ROCK inhibitor Y-27632	Stem Cell Technologies	72304
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870127	For cell culture
RPMI 1640 Medium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	11835030	Optical mapping
Versene Solution	Thermo Fisher Scientific	15040066	chelating agent
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape	VWR	89098-058	Tissue chip fabrication
X-Rhod-1 AM	Thermo Fisher Scientific	X14210	Optical mapping