Сердечная микрофизиологическая система для изучения размножения Ca2+ с помощью негенетической оптической стимуляции

Резюме

Использование света для контроля сердечных клеток и тканей позволяет проводить бесконтактную стимуляцию, тем самым сохраняя естественное состояние и функцию клеток, что делает его ценным подходом как для фундаментальных исследований, так и для терапевтических применений.

Аннотация

Микрофизиологические модели сердца in vitro обладают высокой надежностью для научных исследований, разработки лекарств и медицинского применения. Несмотря на широкое признание в научном сообществе, эти системы все еще ограничены в долговечности из-за отсутствия методов неинвазивной стимуляции. Фотопреобразователи обеспечивают эффективный метод стимуляции, предлагая беспроводной подход с высоким временным и пространственным разрешением при минимизации инвазивности в процессах стимуляции. В данной рукописи мы представляем полностью оптический метод стимуляции и детектирования активности микрофизиологической модели сердца in vitro. В частности, мы изготовили сконструированные ламинарные анизотропные ткани путем посева индуцированных человеком плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток (hiPSC-CMs), полученных в 3D-культуре суспензии биореактора. Мы использовали фотопреобразователь, амфифильное производное азобензола, названное Ziapin2, для стимуляции и краситель Ca²⁺ (X-Rhod 1) для мониторинга реакции системы. Результаты показывают, что Ziapin2 может фотомодулировать ответы^Ca2+ в используемой системе без ущерба для целостности тканей, жизнеспособности или поведения. Кроме того, мы показали, что подход к стимуляции на основе света предлагает аналогичное разрешение по сравнению с электрической стимуляцией, текущим золотым стандартом. В целом, этот протокол открывает многообещающие перспективы для применения Ziapin2 и фотостимуляции на основе материалов в кардиологических исследованиях.

Введение

Использование света для стимуляции живых клеток и тканей становится важным фактором, меняющим правила игры в биомедицинских исследованиях, предлагая возможности бесконтактной стимуляции с точным временным и пространственным разрешением 1,2,3,4,5,6. Одним из ведущих методов, используемых для повышения чувствительности клеток к свету, является оптогенетика, которая включает в себя генетическую модификацию клеток для экспрессии светочувствительных ионных каналов или насосов ^7,8. Этот подход продемонстрировал впечатляющую эффективность в регулировании клеток в живых тканях; Тем не менее, его зависимость от переноса вирусных генов препятствует его широкому внедрению в исследованиях и клиническом применении.

Чтобы преодолеть это ограничение, органические и неорганические материалы были использованы в качестве светочувствительных преобразователей для разработки негенетических, основанных на материалах методов светоопосредованной^{стимуляции 9,10}. Органические наноструктурированные фотопреобразователи 11,12,13,14,15 в последнее время продемонстрировали замечательный успех в запуске клеточных реакций в различных областях применения, включая нейроны, кардиомиоциты и клетки скелетных мышц.

В данной работе мы предлагаем Ziapin2 ^16,17,18, производное азобензола, для исследования распространения Ca²⁺ в сконструированных ламинарных тканях сердца. Амфифильная структура молекулы позволяет точно воздействовать на плазматическую мембрану клетки, в то время как азобензольное ядро обеспечивает индуцированную светом изомеризацию, что приводит к ее конформационным^{изменениям} 16,17,18. В клетках сердца эта транс-цис-изомеризация изменяет толщину плазматической мембраны, вызывая каскад эффектов, которые генерируют потенциал действия, который, в свою очередь, запускает процесс возбуждения-сокращения 19,20,21.

Кроме того, мы описываем процесс изготовления сконструированной платформы для анизотропного роста сердечной ткани²² и подробно описываем экспериментальную установку, используемую для оптического запуска и мониторинга ее активности, уделяя особое внимание приобретению динамики^Ca2+ в ткани^23,24. Наконец, мы сравниваем полученные сигналы с сигналами, полученными с помощью электрической стимуляции, которая считается эталоном. В целом, этот протокол подчеркивает применение нового светочувствительного преобразователя для улучшения нашего понимания поведения сердечных клеток, особенно в контексте искусственных тканей.

протокол

Используемая культура плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC) представляет собой мужскую линию iPSC дикого типа, которая содержит индуцируемую доксициклином (Dox) систему CRISPR/Cas9, созданную путем введения CAGrtTA::TetO-Cas9 в локус AAVS1 (Addgene: #73500). Исследование проводилось в соответствии с протоколами, утвержденными Наблюдательным советом по институциональным учреждениям Бостонской детской больницы. Информированное согласие пациентов было получено до их участия в исследовании. Генерация кардиомиоцитов, полученных из hiPSC (hiPSC-CMs), была индуцирована, как описано ранее^25,26. Протокол будет кратко изложен в следующем разделе:

1. Генерация и получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека кардиомиоцитов

1. Один раз промойте ИПСК при культивировании в колбах Т75 с помощью PBS. Отделить клетки путем инкубации с хелатирующим агентом Versene в течение 10-15 мин и поместить в емкости биореактора, предварительно обработанные 1% раствором неионогенного поверхностно-активного вещества с плотностью 50 млн IPSCs/сосуд в 100 мл среды E8 с добавлением 10 мкМ ингибитора ROCK Y-27632.
2. Установите следующие параметры биореактора: перемешивание 60 об/мин, температура 37 °C, pH 7 и наложение газов (O₂ и CO₂) на уровне 3 стандартных л/ч.
3. После 1 дня в культуре подтвердить, что диаметр эмбриоидного тела (БЭ) достиг 100-300 мкм, и обработать клетки основной средой RPMI (среда RPMI 1640 с добавлением B27 минус инсулин), содержащей 7 мкМ CHIR99021 в течение 24 ч, с последующей сменой среды на RPMI еще на 24 ч. Добавьте базовую среду RPMI, содержащую 5 мкМ IWR-1-эндо, еще на 48 ч, чтобы начать процесс дифференцировки в направлении сердечной линии. Через 48 часов переключите среду обратно на базовую RPMI.
4. На 7-й день дифференцировки культивировали клетки в базовой среде RPMI с добавлением человеческого инсулина в соотношении 1:1000 (v/v). Обновляйте носитель каждые 2 дня или каждый день с 50% изменением среды, если потребление кислорода достигает более 30%.
5. На 15-й день ферментативную диссоциацию клеток биореактора в течение 3 ч с помощью раствора коллагеназы II, содержащего HBSS, коллагеназу II (200 ед/мл), HEPES (10 мМ), ингибитор ROCK Y-27632 (10 мкМ) и N-бензил--толуолсульфонамид (BTS, 30 мкМ). Для этого сначала промывают дифференцированные hiPSC-CM EBs 2x подогретым HBSS и инкубируют их в растворе Коллагеназы II (объем 200 мкл БЭ / 12 мл раствора Коллагеназы II) при 37 °С в 5%_СО2 до появления единичных клеток от полной диссоциации БЭ.
6. Остановите реакцию диссоциации путем добавления равного объема блокирующего буфера (RPMI-1640 без B27 и DNase II, с 6 мкл DNase II на мл RPMI-1640) к суспензии одиночных клеток. Подсчитайте дифференцированные hiPSC-CM, центрифугируйте (200 × г, 5 мин) и подготовьте к последующему применению, заморозив элементы при -80 °C в изопропаноле на 24 ч и переместив их в резервуары с жидким азотом до посева.

2. Инженерное изготовление ламинарной ткани

1. Приклейте два слоя лабораторной ленты, белый и синий, к прозрачному, устойчивому к царапинам и ультрафиолетовому излучению акриловому листу толщиной 1 мм. С помощью лазерного гравера CO₂ разрежьте акриловый лист на круги (диаметр 20 мм, чтобы вместить 12 МВт) и схему чипа (3 x 7,5 мм квадрата, по три на чип) на ленте, как это предусмотрено в программном обеспечении векторной графики (например, CorelDraw); параметры резки акрила: 100 мощность, 20 скорость и 1 000 PPI; Параметры резки ленты: 8 мощностей, 6 скоростей и 1 000 PPI. Снимите два слоя ленты внутри внутренней линии с помощью пинцета, замочите чипсы в чистом отбеливателе на срок от 30 минут до 1 часа, чтобы удалить толстые линии и темные пятна от разреза, оставив острую линию, и промойте чипсы в стакане с проточной деионизированной (DI) водой на ночь или не менее 3 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не отбеливайте дольше 2 часов, так как это приведет к вытравливанию клея на боковых стенках, препятствуя правильному прилипанию желатина.
2. Обработать стружку ультразвуком в течение 10 минут и штамповать полидиметилсилоксаном (PDMS, Sylgard 184) с элементами линейной канавки (ширина гребня 25 мкм, ширина канавки 4 мкм и глубина канавки 5 мкм) в течение 30 мин в чистом 70% этаноле. Перенесите стружки и штампы в чистое место под капотом и дайте им высохнуть под воздействием воздуха в течение ~1-2 часов.
3. Взвесьте 1 г желатина из свиной кожи (сила геля ~175 г Bloom, тип А) в тюбик объемом 50 мл. Добавьте 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) и тщательно перемешайте, чтобы обеспечить немедленное растворение желатина. Поместите трубку на водяную баню при температуре 65 °C на 30 минут, чтобы завершить процесс растворения. Аналогичным образом взвесьте 1 г микробной трансглютаминазы (MTG) в отдельную пробирку объемом 50 мл. Добавьте 12,5 мл PBS, тщательно перемешайте и поместите пробирку на водяную баню при температуре 37 °C на 30 минут, чтобы обеспечить полное растворение MTG.
4. Проработайте желатиновую трубку ультразвуком в течение 15 минут, затем перед использованием верните ее на водяную баню при температуре 65 °C. Поместите трубку MTG в эксикатор, слегка ослабив крышку, и медленно включите пылесос. Наблюдайте, как пузырьки удаляются из раствора MTG под вакуумом. После дегазации верните трубку MTG на водяную баню при температуре 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за процессом и регулируйте вакуум, чтобы избежать сильного кипения.
5. Накройте лист сетки чистой парапленкой, поместите стружку на сетку и держите марку рядом, готовую к использованию. Добавьте 5 мл MTG к 5 мл раствора желатина, тщательно пипетируя, чтобы избежать образования пузырьков; затем быстро нанесите желатин на чип, используя достаточно, чтобы покрыть область чипа (примерно по 0,5 мл каждая). Затем поместите сверху штамп PDMS²² с линейным рисунком (ширина линии 25 мкм, высота 5 мкм, расстояние 4 мкм) и приложите груз массой 200 г, чтобы желатин располагался параллельно продольной оси ткани. После того, как все чипсы будут слиты, накройте их стеклянной банкой, чтобы избежать воздействия окружающей среды, и дайте им сшить на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте смешанный раствор желатина-MTG в течение 5 минут; В противном случае целевой рисунок будет изменен из-за более высокого сшитого состояния желатина.
6. Переложите чипс и бутерброд с маркой PDMS в новую чашку P150, наполненную PBS, и увлажните желатин в течение от 30 минут до 1 часа, чтобы облегчить отделение штампа PDMS от чипса. Удалите излишки неформованного желатина вокруг чипса и переложите чистый чипс в новую чашку P150, наполненную PBS. Храните штампы PDMS в 70% этаноле.
7. Простерилизуйте чипсы, замочив их в этаноле на 10 минут под колпаком.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 10 минут в этаноле, так как более длительное воздействие может привести к деформации желатина.
8. Переложите чипсы в PBS, замочите на 10 минут и промойте 3 раза. Готовьте растворы покрытий путем смешивания 20 мкг/мл фибронектина с разбавленной матрицей базальной мембраны в соотношении 1:100 в питательных средах (примерно 0,5 мл на лунку). Покройте чипсы в течение 2 ч в инкубаторе при температуре 37 °C и 5%_CO2 или при 4 °C на ночь.
9. Разморозьте и затравите клетки (8 × 10⁵ hiPSC-CM на см²) в среде RPMI с Y-27632 (10 мкМ), затем замените ее на RPMI без Y-27632 через 24 часа.
10. Через три дня после посева клеток снимите белую ленту с помощью пинцета.

3. Синтез и применение фотопреобразователя

Примечание: Зиапин2 синтезировали в соответствии с ранее опубликованной методикой^16,18 и вводили в ХМ-гипсх-СМ непосредственно в питательной среде.

1. Добавьте 25 μМ Зиапина2 в культуру клеток и инкубируйте при 37 °C и 5%_CO2 в течение 7 минут.
2. Аккуратно смойте излишки молекул и смойте свежей питательной средой.

4. Анализ жизнеспособности

ПРИМЕЧАНИЕ: Аламар Блю - это анализ на основе резазурина, который может проникать в клетки и действовать как окислительно-восстановительный индикатор для мониторинга жизнеспособности клеток. Резазурин растворяется в физиологических буферах, в результате чего получается темно-синий раствор, который добавляется непосредственно к клеткам в культуре. Жизнеспособные клетки с активным метаболизмом восстанавливают резазурин до резофурина, который имеет розовый цвет и флуоресцентность.

1. Пластинчатые клетки в 96-луночном планшете, предварительно покрытом фибронектином 20 мкг/мл и разбавленной матрицей базальной мембраны 1:100 в питательных средах. Перемешайте, встряхивая, а затем асептически добавьте Alamar Blue в каждую лунку в количестве, равном 10% от объема лунки.
2. Инкубируйте культуры с Аламар Блю в течение 4 ч.
3. Обрабатывайте клетки с помощью фотопреобразователя и носителя (ДМСО), как описано ранее. Применяйте световую стимуляцию (импульсный свет 1 Гц в течение 1 минуты) через оптическое волокно (голубой, 470 нм) для оценки влияния интернализации Ziapin2 и воздействия света на жизнеспособность hiPSC-CM.
4. Считывание флуоресценции с помощью планшетного ридера при возбуждении 560 нм и излучении 590 нм.

5. Оценка анизотропии ламинарной ткани сердца

ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе изложен систематический подход к оценке анизотропии сконструированной ламинарной ткани сердца с использованием иммуноокрашивания, конфокальной микроскопии и анализа ядер²⁷.

1. Перед фиксацией подложку несколько раз промыть PBS 4% (v/v) параформальдегидом, содержащим 0,05% (v/v) Triton X-100 в PBS в течение 10 минут.
2. Блокируйте неспецифическое связывание путем инкубации образцов с 5% (w/v) бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS в течение 30 минут.
3. Инкубируйте образцы с помощью метода Хёхст (1:500) при комнатной температуре в течение 1 ч.
4. Перед установкой на предметные стекла микроскопа промойте PBS средством против выцветания. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи и храните при температуре 4 °C до получения изображения.
5. Изображение образцов с помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском при 20-кратном увеличении. Определите ориентацию ячеек с помощью плагина FiJi OrientationJ Measure²⁸.

6. Записи оптического картографирования

Примечание: Оптическое картирование проводили через 5 дней в культуре на hiPSC-CM, засеянных на тканевых чипах, формованных желатином.

1. Чтобы следовать этому протоколу, убедитесь, что аппарат для оптического картирования состоит из модифицированного тандемного микроскопа, оснащенного высокоскоростной камерой, и источника возбуждающего света — ртутной лампы мощностью 200 мВт. Поместите дихроичное зеркало перед специальной камерой изображения Ca²⁺ , чтобы убедиться, что препарат подвергается воздействию возбуждающего света, и собрать излучаемую флуоресценцию, исходящую от образца.
2. Инкубируйте образец с добавлением 2 μM X-Rhod 1 в питательную среду в течение 30 минут при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подвергайте образец воздействию света только во время получения изображения, чтобы избежать фотообесцвечивания красителя.
3. Инкубируйте фотопреобразователь, как описано ранее в разделе 3.
4. Промыть свежей питательной средой и переложить стружку в феноловую среду без красных RPMI 1640 с добавлением B27 минус инсулин.
5. Поместите тканевые чипы в чашку с регулируемой температурой и начните запись при физиологической температуре (37 °C), получая изображения с частотой кадров 2,5 кадра/с.
6. Для оптической стимуляции применяйте оптическую точечную стимуляцию на одном конце ткани с помощью светодиодного источника света (465/25 нм), что позволяет стимулировать Ziapin2. Перемещайте ткани с частотой 0,5 или 1 Гц с помощью временно регулируемого оптического волокна, расположенного на расстоянии 1 мм от ткани. Для электрической стимуляции применяйте точечную стимуляцию с помощью биполярного платинового электрода, расположенного в центре самого дистального конца прямоугольной ткани. Такое расположение гарантирует, что распространение волны Ca²⁺ начинается из средней точки ширины ткани, которая соответствует более короткой стороне прямоугольника. Стимуляция должна применяться с частотой 0,5 Гц, с амплитудой 10 В и длительностью импульса 100 мс.
7. После записи примените пространственный фильтр размером 3 x 3 пикселя, чтобы улучшить соотношение сигнал/шум.
8. Определите скорость проводимости волны Ca²⁺ в каждом пикселе для каждого импульса, вычислив скорость изменения в обоих направлениях x и y. Для этого измерим пространственный градиент интенсивности сигнала Ca²⁺ в этих направлениях и свяжем его с временной задержкой распространения сигнала. Комбинируя эти скорости изменения направления, количественно оцените, как быстро волна распространяется по клеточному полю в обоих измерениях.

7. Экспорт и обработка данных

1. Извлекайте и анализируйте данные с помощью программного обеспечения, на которое вы ссылаетесь.
2. Примените пространственный фильтр 3 x 3 пикселя для улучшения отношения сигнал/шум.
3. Извлечение трассировок переходных процессов Ca²⁺ (CaT) в качестве среднего значения для определенной выбранной вручную области интереса (ROI).
4. Измерьте параметры CaT в центральной области интереса (ROI) 50 x 50 пикселей (≈ 25^мм2).
5. Для каждого CaT проанализируйте амплитуду CaT, время нарастания (_{t пика}), время максимального наклона затухания (Max Decay Slope) и время до 90% переходного затухания (Decay Time₉₀).

8. Статистический анализ

1. Оцените нормальность распределения с помощью соответствующего статистического теста, такого как тест на нормальность, чтобы определить, следует ли применять параметрические или непараметрические методы.
2. Оцените статистическую значимость между двумя условиями с помощью t-критерия Стьюдента или U-критерия Манна-Уитни для непрерывных или категориальных данных соответственно. При сравнении более чем двух групп используйте однофакторный ANOVA или критерий Краскела-Уоллиса в зависимости от предположений о данных, а затем соответствующие апостериорные тесты для выявления значимых парных различий.

Результаты

Был разработан и внедрен многоступенчатый процесс изготовления инженерной ламинарной сердечной ткани с использованием комбинации методов лазерного моделирования, литья желатина и посева клеток. Первоначально разработанный McCain et ^al.22 и Lee et ^al.24<...

Обсуждение

Этот подход обеспечивает надежную платформу для продвижения кардиологических исследований, обеспечивая понимание сложной динамики сердечной ткани, открывая новые возможности для долгосрочных исследований сердечной механистики in vitro , которые потенциально мо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
alamarBlue Cell Viability Reagent	Thermo Fisher Scientific	DAL1025	Cell Viability Assay
B-27 Supplement, minus insulin	Thermo Fisher Scientific	A1895601	For cell culture
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9056-50G	For cell staining
BrainVision Analyzer software	Brain Products	https://www.brainproducts.com/downloads/analyzer/	Data export and handling
BTS	Sigma	203895-5MG
CHIR99021	Stem Cell Technologies	72054
Clear Scratch- and UV-Resistant Acrylic Sheet, 12" x 12" x 0.01 inch	McMaster Carr	4076N11	Tissue chip fabrication
Collagenase Type II	Worthington	CLS-2 / LS004176
DNase II	VWR	89346-540
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	For cell culture
Fibronectin	VWR	47743-654	Coating
Gelatin from porcine skin gel strength 175 Type A	Sigma-Aldrich	G2625-100G	Tissue chip fabrication
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Coating
HBSS	Thermo Fisher	14175-095
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080
Hoechst 33342	Life technologies	H1399	For cell staining
Insulin solution human	Sigma Aldrich	I9278-5ML
IWR-1-endo	Stem Cell Technologies	72564
Paraformadehyde 16% Aqueous Solution (PFA)	VWR	100503-917	For cell staining
PBS, sterile, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	10010049	Tissue chip fabrication
phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	10010049
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)	Thermo Fisher Scientific	P3000MP	Non-ionic surfactant
ROCK inhibitor Y-27632	Stem Cell Technologies	72304
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870127	For cell culture
RPMI 1640 Medium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	11835030	Optical mapping
Versene Solution	Thermo Fisher Scientific	15040066	chelating agent
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape	VWR	89098-058	Tissue chip fabrication
X-Rhod-1 AM	Thermo Fisher Scientific	X14210	Optical mapping