Genetik Olmayan Optik Stimülasyon Yoluyla Ca2+ Yayılımını İncelemek için Kardiyak Mikrofizyolojik Bir Sistem

Özet

Kardiyak hücreleri ve dokuyu kontrol etmek için ışığın kullanılması, temassız stimülasyonu mümkün kılar, böylece hücrelerin doğal durumunu ve işlevini korur, bu da onu hem temel araştırma hem de terapötik uygulamalar için değerli bir yaklaşım haline getirir.

Özet

İn vitro kardiyak mikrofizyolojik modeller, bilimsel araştırma, ilaç geliştirme ve tıbbi uygulamalar için oldukça güvenilirdir. Bilimsel topluluk tarafından yaygın olarak kabul edilmesine rağmen, bu sistemler non-invaziv stimülasyon tekniklerinin olmaması nedeniyle uzun ömürlülük açısından hala sınırlıdır. Fototransdüserler, stimülasyon süreçlerinde invazivliği en aza indirirken yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip kablosuz bir yaklaşım sunarak verimli bir stimülasyon yöntemi sağlar. Bu yazıda, in vitro kardiyak mikrofizyolojik bir modelin aktivitesini uyarmak ve tespit etmek için tamamen optik bir yöntem sunuyoruz. Spesifik olarak, bir 3D biyoreaktör süspansiyon kültüründe üretilen insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositleri (hiPSC-CM'ler) tohumlayarak mühendislik ürünü laminer anizotropik dokular ürettik. Stimülasyon için Ziapin2 adlı bir amfifilik azobenzen türevi olan bir fototransdüser ve sistemin tepkisini izlemek için bir Ca^{2 +} boyası (X-Rhod 1) kullandık. Sonuçlar, Ziapin2'nin doku bütünlüğünden, canlılığından veya davranışından ödün vermeden kullanılan sistemdeki Ca^{2 +} yanıtlarını fotomodüle edebildiğini göstermektedir. Ayrıca, ışığa dayalı stimülasyon yaklaşımının, mevcut altın standart olan elektriksel stimülasyona kıyasla benzer bir çözünürlük sunduğunu gösterdik. Genel olarak, bu protokol kardiyak araştırmalarda Ziapin2 ve materyal bazlı fotostimülasyonun uygulanması için umut verici perspektifler açmaktadır.

Giriş

Canlı hücreleri ve dokuları uyarmak için ışığın kullanımı, biyomedikal araştırmalarda önemli bir oyun değiştirici olarak ortaya çıkıyor ve hassas zamansal ve uzamsal çözünürlük 1,2,3,4,5,6 ile dokunmadan stimülasyon yetenekleri sunuyor. Hücreleri ışığa duyarlı hale getirmek için kullanılan önde gelen tekniklerden biri, ışığa duyarlı iyon kanallarını veya pompaları^ifade etmek için hücrelerin genetik olarak değiştirilmesini içeren optogenetiktir ^7,8. Bu yaklaşım, canlı doku içindeki hücrelerin düzenlenmesinde etkileyici bir etkinlik göstermiştir; Bununla birlikte, viral gen transferine olan bağımlılığı, araştırma ve klinik uygulamalarda yaygın olarak benimsenmesini engellemiştir.

Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, organik ve inorganik malzemeler, genetik olmayan, malzeme bazlı ışık aracılı stimülasyon teknikleri geliştirmek için ışığa duyarlı dönüştürücüler olarak kullanılmıştır ^9,10. Organik nanoyapılı fototransdüserler 11,12,13,14,15 son zamanlarda nöronlar, kardiyomiyositler ve iskelet kası hücreleri dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda hücresel yanıtları tetiklemede dikkate değer bir başarı göstermiştir.

Burada, tasarlanmış laminer kardiyak dokularda Ca 2+ yayılımını araştırmak için bir azobenzen türevi olan^Ziapin2 16,17,18'i öneriyoruz. Molekülün amfifilik yapısı, hücre plazma zarının hassas bir şekilde hedeflenmesine izin verirken, azobenzen çekirdeği, ışık kaynaklı izomerizasyonu mümkün kılarak konformasyonel değişimine yol açar 16,17,18. Kardiyak hücrelerde, bu trans-cis izomerizasyonu, plazma zarı kalınlığını değiştirerek, bir aksiyon potansiyeli oluşturan bir dizi etkiye neden olur ve bu da uyarma-kasılma sürecini^tetikler 19,20,21.

Ek olarak, kardiyak dokunun²² anizotropik büyümesi için tasarlanmış bir platformun üretim sürecini açıklıyoruz ve özellikle doku^23,24 içinde Ca²⁺ dinamiklerini elde etmeye odaklanarak, aktivitesini optik olarak tetiklemek ve izlemek için kullanılan deney düzeneğini detaylandırıyoruz. Son olarak, elde edilen sinyalleri, referans standart olarak kabul edilen elektriksel stimülasyon yoluyla elde edilen sinyallerle karşılaştırırız. Genel olarak, bu protokol, özellikle mühendislik dokuları bağlamında, kardiyak hücresel davranış anlayışımızı ilerletmede yeni bir ışığa duyarlı dönüştürücünün uygulanmasını vurgulamaktadır.

Protokol

Kullanılan insan pluripotent kök hücre (hiPSC) kültürü, CAGrtTA::TetO-Cas9'un AAVS1 lokusuna sokulmasıyla oluşturulan, doksisiklin (Dox) ile indüklenebilir bir CRISPR/Cas9 sistemini barındıran vahşi tip bir insan erkek iPSC hattıdır (Addgene: #73500). Çalışma, Boston Çocuk Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan protokollere uygun olarak yürütülmüştür. Çalışmaya katılmadan önce hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. HiPSC'den türetilmiş kardiyomiyositlerin (hiPSC-CM'ler) oluşumu daha önce tarif edildiği gibi indüklenmiştir^25,26. Protokol aşağıdaki bölümde kısaca özetlenecektir:

1. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositlerin üretilmesi ve hazırlanması

1. T75 şişelerinde kültürlenen hiPSC'leri PBS ile bir kez yıkayın. Şelatlama maddesi Versene ile 10-15 dakika inkübe ederek hücreleri ayırın ve 10 μM ROCK inhibitörü Y-27632 ile desteklenmiş 100 mL E8 ortamında 50 milyon IPSC / kap yoğunluğunda% 1 iyonik olmayan yüzey aktif madde çözeltisi ile ön işleme tabi tutulmuş biyoreaktör kaplarına tohumlayın.
2. Aşağıdaki biyoreaktör parametrelerini ayarlayın: çalkalama 60 rpm, sıcaklık 37 °C, pH 7 ve 3 standart L/s'de kaplama gazlama (O₂ ve CO₂).
3. Kültürde 1 gün sonra, embriyoid cisim (EB) çapının 100-300 μm'ye ulaştığını onaylayın ve hücreleri 24 saat boyunca 7 μM CHIR99021 içeren bazik RPMI ortamı (B27 eksi İnsülin ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamı) ile tedavi edin, ardından 24 saat daha RPMI'ye medya değişikliği yapın. Kardiyak soy çizgisine doğru farklılaşma sürecini başlatmak için 5 μM IWR-1-endo içeren temel RPMI ortamını 48 saat daha ekleyin. 48 saat sonra, ortamı tekrar temel RPMI'ye değiştirin.
4. Farklılaşmanın 7. gününde, 1: 1.000 (h / h) insan insülini ile desteklenmiş temel bir RPMI ortamındaki kültür hücreleri. Oksijen tüketimi %30'un üzerine çıkarsa, medyayı her 2 günde bir veya %50 orta değişiklikle her gün yenileyin.
5. 15. günde, HBSS, Kollajenaz II (200 birim / mL), HEPES (10 mM), ROCK inhibitörü Y-27632 (10 μM) ve N-benzil-p-toluensülfonamid (BTS, 30 μM) içeren bir Kollajenaz II çözeltisi kullanarak biyoreaktör hücrelerini 3 saat boyunca enzimatik olarak ayırın. Bunu yapmak için, önce farklılaşmış hiPSC-CM EB'leri 2x'i önceden ısıtılmış HBSS ile yıkayın ve bunları Kollajenaz II çözeltisinde (200 μl hacim EB / 12 ml Kollajenaz II çözeltisi) 37 °C'de% 5 CO_2'de tek hücreler tam EB ayrışmasından görünene kadar inkübe edin.
6. Tek hücreli süspansiyona eşit hacimde bir bloke edici tampon (B27 ve DNaz II içermeyen RPMI-1640, RPMI-1640 mL başına 6 μL DNaz II ile) ekleyerek ayrışma reaksiyonunu durdurun. Farklılaşmış hiPSC-CM'leri sayın, santrifüjleyin (200 × g, 5 dakika) ve hücreleri -80 °C'de izopropanol içinde 24 saat dondurarak ve tohumlama yapılana kadar sıvı nitrojen tanklarına taşıyarak sonraki uygulamalara hazırlanın.

2. Tasarlanmış laminer doku imalatı

1. Biri beyaz diğeri mavi olmak üzere iki kat laboratuvar bandını 1 mm kalınlığında şeffaf, çizilmeye ve UV ışınlarına dayanıklı akrilik bir levhaya yapıştırın. Bir CO₂ lazer kazıma makinesi kullanarak, akrilik levhayı vektör grafik yazılımında (örneğin, CorelDraw) tasarlandığı gibi bant üzerinde daireler halinde (12 MW'a uyacak şekilde 20 mm çapta) ve çip desenini (3 x 7,5 mm kare, çip başına üç) kesin; akrilik kesme parametreleri: 100 güç, 20 hız ve 1.000 PPI; bant kesme parametreleri: 8 güç, 6 hız ve 1.000 PPI. Cımbız kullanarak en içteki çizginin içindeki iki bant katmanını çıkarın, kalın çizgileri ve koyu lekeleri kesmek için cipsleri 30 dakika ila 1 saat saf ağartıcıda bekletin, keskin bir çizgi bırakın ve cipsleri gece boyunca veya en az 3 saat boyunca akan deiyonize (DI) su ile bir beherde durulayın.
   NOT: 2 saatten daha uzun süre ağartmayın, çünkü bu, yan duvarlardaki yapıştırıcıları aşındırarak jelatinin düzgün yapışmasını engeller.
2. Cipsleri 10 dakika boyunca sonikasyon yapın ve polidimetilsiloksan (PDMS, Sylgard 184) damgalarını hat oluğu özelliklerine (25 μm sırt genişliği, 4 μm oluk genişliği ve 5 μm oluk derinliği) 30 dakika boyunca temiz% 70 etanolde sonikleştirin. Talaşları ve pulları bir kaputun altındaki temiz bir alana aktarın ve ~1-2 saat hava akımı altında kurumaya bırakın.
3. Domuz derisinden 1 g jelatini (jel mukavemeti ~ 175 g Bloom, Tip A) 50 mL'lik bir tüpe tartın. 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin ve jelatinin hemen çözünmesini sağlamak için iyice karıştırın. Çözünme işlemini tamamlamak için tüpü 30 dakika boyunca 65 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Benzer şekilde, 1 g mikrobiyal transglutaminaz (MTG) 50 mL'lik ayrı bir tüpe tartın. 12.5 mL PBS ekleyin, iyice karıştırın ve MTG'nin tamamen çözünmesini sağlamak için tüpü 37 ° C'lik bir su banyosuna 30 dakika boyunca yerleştirin.
4. Jelatin tüpünü 15 dakika boyunca sonikleştirin, ardından kullanmadan önce 65 °C su banyosuna geri koyun. MTG tüpünü, kapağı hafifçe gevşetilmiş olarak bir kurutucuya yerleştirin ve vakumu yavaşça açın. Vakum altında MTG çözeltisinden kabarcıkların çıkarıldığını gözlemleyin. Gazdan arındırma işleminden sonra MTG tüpünü 37 °C su banyosuna geri koyun.
   NOT: İşlemi izleyin ve kuvvetli kaynamayı önlemek için vakumu ayarlayın.
5. Bir ızgara sayfasını temiz parafilm ile kaplayın, çipleri ızgaraya yerleştirin ve damgayı yakın, kullanıma hazır tutun. 5 mL jelatin çözeltisine 5 mL MTG ekleyin, kabarcıkları önlemek için dikkatlice pipetleyin; daha sonra, talaş alanını kaplayacak kadar (her biri yaklaşık 0,5 mL) kullanarak jelatini hızlı bir şekilde çipin üzerine pipetleyin. Ardından, çizgi desenli PDMS²² (çizgi genişliği 25 μm, yükseklik 5 μm, aralık 4 μm) damgasını üstüne yerleştirin ve jelatinin dokunun uzunlamasına eksenine paralel desenli olduğundan emin olmak için 200 g ağırlık uygulayın. Tüm talaşlar kalıplandıktan sonra, çevresel rahatsızlığı önlemek için üzerlerini bir cam kavanozla örtün ve gece boyunca çapraz bağlanmalarına izin verin.
   NOT: Karışık çözelti jelatin-MTG'yi 5 dakika içinde kullanın; aksi takdirde, jelatinin daha yüksek bir çapraz bağlı durumu nedeniyle hedef model değişecektir.
6. Çipi ve PDMS damga sandviçini PBS ile doldurulmuş yeni bir P150 kabına aktarın ve PDMS damgasının çipten ayrılmasını kolaylaştırmak için jelatini 30 dakika ila 1 saat boyunca nemlendirin. Çipin etrafındaki fazla kalıplanmamış jelatini çıkarın ve temiz çipi PBS ile doldurulmuş yeni bir P150 kabına aktarın. PDMS damgalarını %70 etanolde saklayın.
7. Cipsleri kaputun altında 10 dakika etanolde bekleterek sterilize edin.
   NOT: Etanolde 10 dakikayı aşmayın, çünkü daha uzun süre maruz kalma jelatini deforme edebilir.
8. Cipsleri PBS'ye aktarın, 10 dakika bekletin ve 3 kez durulayın. 20 μg / mL fibronektini 1:100 seyreltilmiş bazal membran matrisi ile kültür ortamında (kuyu başına yaklaşık 0.5 mL) karıştırarak kaplama çözeltileri hazırlayın. Cipsleri inkübatörde 2 saat boyunca 37 °C ve %5 CO_2'de veya gece boyunca 4 °C'de kaplayın.
9. Hücreleri (cm² başına 8 × 10⁵ hiPSC-CM) Y-27632 (10 μM) ile RPMI ortamında çözün ve tohumlayın, ardından 24 saat sonra Y-27632 olmadan RPMI ile değiştirin.
10. Hücre tohumlamasından üç gün sonra, cımbız kullanarak beyaz bandı çıkarın.

3. Fototransdüserin sentezi ve uygulaması

NOT: Ziapin2, daha önce yayınlanmış bir prosedüre^16,18 göre sentezlendi ve doğrudan kültür ortamında hiPSC-CM'lere uygulandı.

1. Hücre kültürüne 25 μM Ziapin2 ekleyin ve 37 ° C ve% 5 CO_2'de 7 dakika inkübe edin.
2. Fazla molekülleri nazikçe yıkayın ve taze kültür ortamı ile durulayın.

4. Canlılık testi

NOT: Alamar Blue, hücrelere nüfuz edebilen ve hücre canlılığını izlemek için bir redoks göstergesi görevi görebilen resazurin bazlı bir testtir. Resazurin, fizyolojik tamponlarda çözünür ve doğrudan kültürdeki hücrelere eklenen koyu mavi bir çözelti ile sonuçlanır. Aktif metabolizmaya sahip canlı hücreler, resazurini pembe ve floresan olan resofurine indirger.

1. Daha önce kültür ortamında 20 μg/mL fibronektin ve 1:100 seyreltilmiş bazal membran matrisi ile kaplanmış 96 oyuklu bir plakadaki plaka hücreleri. Çalkalayarak karıştırın ve ardından aseptik olarak her bir kuyucuğa kuyu hacminin %10'una eşit miktarda Alamar Mavisi ekleyin.
2. Kültürleri Alamar Blue ile 4 saat inkübe edin.
3. Hücreleri daha önce açıklandığı gibi fototransdüser ve araç (DMSO) ile tedavi edin. Ziapin2 içselleştirmesinin ve ışığa maruz kalmanın hiPSC-CM canlılığı üzerindeki etkisini değerlendirmek için bir optik fiber (camgöbeği, 470 nm) aracılığıyla ışık stimülasyonu (1 dakika boyunca 1 Hz darbeli ışık) uygulayın.
4. 560 nm uyarma ve 590 nm emisyonda bir plaka okuyucu ile floresan okuyun.

5. Tasarlanmış laminer kardiyak doku anizotropisinin değerlendirilmesi

NOT: Bu protokol, immün boyama, konfokal mikroskopi ve çekirdek analizi²⁷ kullanılarak tasarlanmış laminer kardiyak dokunun anizotropisini değerlendirmek için sistematik bir yaklaşımı özetlemektedir.

1. PBS'de %0.05 (h/h) Triton X-100 içeren %4 (h/h) paraformaldehit ile sabitlemeden önce alt tabakayı 10 dakika boyunca PBS ile birkaç kez yıkayın.
2. Numuneleri PBS'de% 5 (a / h) sığır serum albümini (BSA) ile 30 dakika inkübe ederek spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin.
3. Numuneleri Hoechst (1:500) ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
4. Solmayı önleyici bir madde ile mikroskop slaytlarına monte etmeden önce PBS ile yıkayın. Slaytların gece boyunca kurumasını bekleyin ve görüntü oluşana kadar 4 °C'de saklayın.
5. 20x büyütmede dönen disk konfokal mikroskop kullanarak görüntü örnekleri. Bir FiJi eklentisi olan OrientationJ Measure^28'i kullanarak hücrelerin yönünü belirleyin.

6. Optik haritalama kayıtları

NOT: Optik haritalama, jelatin kalıplı doku çipleri üzerine ekilen hiPSC-CM'ler üzerinde kültürde 5 gün sonra gerçekleştirildi.

1. Bu protokolü takip etmek için, optik haritalama aparatının, yüksek hızlı bir kamera ve uyarma ışık kaynağı, 200 mW Cıva lambası ile donatılmış modifiye edilmiş bir tandem lens mikroskobundan oluştuğundan emin olun. Preparatın uyarma ışığına maruz kaldığından emin olmak ve numuneden gelen yayılan floresansı toplamak için belirtilen Ca²⁺ görüntüleme kamerasının önüne dikroik bir ayna yerleştirin.
2. Numuneyi, kültür ortamına 37 ° C'de 30 dakika boyunca eklenen 2 μM X-Rhod 1 ile inkübe edin.
   NOT: Boyanın foto-ağartılmasını önlemek için numuneyi yalnızca görüntü alımı sırasında ışığa maruz bırakın.
3. Fototörü daha önce bölüm 3'te açıklandığı gibi inkübe edin.
4. Taze kültür ortamı ile yıkayın ve cipsleri B27 eksi İnsülin ile desteklenmiş fenol kırmızısı içermeyen RPMI 1640 ortamına aktarın.
5. Doku çiplerini sıcaklık kontrollü bir kaba yerleştirin ve fizyolojik sıcaklıkta (37 °C) kayıtlara başlayın ve 2,5 kare/sn kare hızında görüntüler elde edin.
6. Optik pacing için, Ziapin2 stimülasyonuna izin veren bir LED ışık kaynağı (465/25 nm) kullanarak dokunun bir ucuna optik nokta stimülasyonunu uygulayın. Dokudan 0.5 mm uzağa yerleştirilmiş geçici olarak düzenlenmiş bir optik fiber aracılığıyla dokuları 1 veya 1 Hz frekansında hızlandırın. Elektrik pacing için, dikdörtgen dokunun en distal ucunun merkezine yerleştirilmiş bir bipolar platin elektrot kullanarak bir nokta stimülasyonu uygulayın. Bu yerleşim, Ca²⁺ dalga yayılımının, dikdörtgenin daha kısa kenarına karşılık gelen doku genişliğinin orta noktasından kaynaklanmasını sağlar. Stimülasyon, 0.5 Hz frekansında, 10 V genlik ve 100 ms darbe süresi ile uygulanmalıdır.
7. Kayıtlardan sonra, sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için 3 x 3 piksel boyutunda bir uzamsal filtre uygulayın.
8. Hem x hem de y yönleri boyunca değişim oranını hesaplayarak her darbe için her pikselde Ca²⁺ dalga iletim hızını belirleyin. Bunu yapmak için, bu yönlerdeki Ca²⁺ sinyal yoğunluğunun uzamsal gradyanını ölçün ve bunu sinyalin yayılmasının zaman gecikmesiyle ilişkilendirin. Bu yönlü değişim oranlarını birleştirerek, dalganın her iki boyutta da hücresel alan boyunca ne kadar hızlı hareket ettiğini ölçün.

7. Veri dışa aktarma ve işleme

1. Referans verilen yazılımla verileri ayıklayın ve analiz edin.
2. Sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için 3 x 3 piksellik bir uzamsal filtre uygulayın.
3. Ca²⁺ geçici olaylar (CaT) izlerini, manuel olarak seçilen belirli bir ilgi alanının (ROI) ortalaması olarak çıkarın.
4. CaT parametrelerini 50 x 50 piksellik (≈ 25^mm2) merkezi bir ilgi alanında (ROI) ölçün.
5. Her CaT için, CaT genliğini, yükselme süresini (t_{tepe noktası}), maksimum bozunma eğimi süresini (Maksimum Bozunma Eğimi) ve %90 geçici bozunmaya kadar geçen süreyi (Bozunma Süresi₉₀) analiz edin.

8. İstatistiksel analiz

1. Parametrik veya parametrik olmayan yöntemlerin uygulanması gerekip gerekmediğini belirlemek için normallik testi gibi uygun bir istatistiksel test kullanarak dağılımın normalliğini değerlendirin.
2. Sürekli veya kategorik veriler için sırasıyla Öğrenci t-testi veya Mann-Whitney U-testini kullanarak iki koşul arasındaki istatistiksel anlamlılığı değerlendirin. İkiden fazla grubu karşılaştırırken, veri varsayımlarına bağlı olarak tek yönlü ANOVA veya Kruskal-Wallis testini kullanın, ardından önemli ikili farklılıkları belirlemek için uygun post-hoc testleri kullanın.

Sonuçlar

Lazer modelleme, jelatin kalıplama ve hücre tohumlama tekniklerinin bir kombinasyonu kullanılarak tasarlanmış laminer kalp dokusunun üretimi için çok aşamalı bir süreç geliştirildi ve uygulandı. Başlangıçta McCain ve ^ark.22 ve Lee ve ^ark.24 tarafından kurulan bu teknik, tasarlanmış laminer mikrodokuları oluşturmak için protokollerini takip ederek yeniden uygulandı. İşlem, yapısal rehberlik için hassas lazer taban...

Tartışmalar

Bu yaklaşım, kardiyak araştırmaları ilerletmek için sağlam bir platform sağlar ve kardiyak dokunun karmaşık dinamikleri hakkında içgörüler sağlayarak, potansiyel olarak yeni terapötik stratejilere yol açabilecek uzun vadeli in vitro kardiyak mekanik çalışmalar için yeni olanaklar sunar. Bu metodolojinin başarısını sağlamak için, insan kalbinin in vivo koşullarını yakından taklit eden bir mikrofizyolojik ortamın yeniden üretilmesi çok ö...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
alamarBlue Cell Viability Reagent	Thermo Fisher Scientific	DAL1025	Cell Viability Assay
B-27 Supplement, minus insulin	Thermo Fisher Scientific	A1895601	For cell culture
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9056-50G	For cell staining
BrainVision Analyzer software	Brain Products	https://www.brainproducts.com/downloads/analyzer/	Data export and handling
BTS	Sigma	203895-5MG
CHIR99021	Stem Cell Technologies	72054
Clear Scratch- and UV-Resistant Acrylic Sheet, 12" x 12" x 0.01 inch	McMaster Carr	4076N11	Tissue chip fabrication
Collagenase Type II	Worthington	CLS-2 / LS004176
DNase II	VWR	89346-540
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	For cell culture
Fibronectin	VWR	47743-654	Coating
Gelatin from porcine skin gel strength 175 Type A	Sigma-Aldrich	G2625-100G	Tissue chip fabrication
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Coating
HBSS	Thermo Fisher	14175-095
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080
Hoechst 33342	Life technologies	H1399	For cell staining
Insulin solution human	Sigma Aldrich	I9278-5ML
IWR-1-endo	Stem Cell Technologies	72564
Paraformadehyde 16% Aqueous Solution (PFA)	VWR	100503-917	For cell staining
PBS, sterile, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	10010049	Tissue chip fabrication
phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	10010049
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)	Thermo Fisher Scientific	P3000MP	Non-ionic surfactant
ROCK inhibitor Y-27632	Stem Cell Technologies	72304
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870127	For cell culture
RPMI 1640 Medium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	11835030	Optical mapping
Versene Solution	Thermo Fisher Scientific	15040066	chelating agent
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape	VWR	89098-058	Tissue chip fabrication
X-Rhod-1 AM	Thermo Fisher Scientific	X14210	Optical mapping