Ein kardiales mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Ca2+ -Ausbreitung durch nicht-genetische optische Stimulation

Zusammenfassung

Die Steuerung von Herzzellen und -gewebe mit Licht ermöglicht eine berührungslose Stimulation, wodurch der natürliche Zustand und die Funktion der Zellen erhalten bleiben, was sie zu einem wertvollen Ansatz sowohl für die Grundlagenforschung als auch für therapeutische Anwendungen macht.

Zusammenfassung

In-vitro-kardiale mikrophysiologische Modelle sind äußerst zuverlässig für die wissenschaftliche Forschung, Arzneimittelentwicklung und medizinische Anwendungen. Obwohl diese Systeme von der wissenschaftlichen Gemeinschaft weitgehend akzeptiert werden, sind sie aufgrund des Fehlens nicht-invasiver Stimulationstechniken immer noch in ihrer Langlebigkeit begrenzt. Phototransducer bieten eine effiziente Stimulationsmethode, die einen drahtlosen Ansatz mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung bietet und gleichzeitig die Invasivität in Stimulationsprozessen minimiert. In diesem Manuskript stellen wir eine vollständig optische Methode zur Stimulierung und Detektion der Aktivität eines in vitro kardialen mikrophysiologischen Modells vor. Konkret haben wir technisch hergestellte laminare anisotrope Gewebe hergestellt, indem wir humaninduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) ausgesät haben, die in einer 3D-Bioreaktor-Suspensionskultur erzeugt wurden. Wir verwendeten einen Photowandler, ein amphiphiles Azobenzol-Derivat namens Ziapin2, zur Stimulation und einen Ca2⁺ -Farbstoff (X-Rhod 1) zur Überwachung der Reaktion des Systems. Die Ergebnisse zeigen, dass Ziapin2 die^Ca2+ -Reaktionen im verwendeten System photomodulieren kann, ohne die Integrität, Lebensfähigkeit oder das Verhalten des Gewebes zu beeinträchtigen. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass der lichtbasierte Stimulationsansatz eine ähnliche Auflösung im Vergleich zur elektrischen Stimulation, dem aktuellen Goldstandard, bietet. Insgesamt eröffnet dieses Protokoll vielversprechende Perspektiven für die Anwendung von Ziapin2 und der materialbasierten Photostimulation in der Herzforschung.

Einleitung

Die Verwendung von Licht zur Stimulation lebender Zellen und Gewebe entwickelt sich zu einem bedeutenden Wendepunkt in der biomedizinischen Forschung und bietet berührungslose Stimulationsmöglichkeiten mit präziser zeitlicher und räumlicher Auflösung 1,2,3,4,5,6. Eine der führenden Techniken, um Zellen lichtempfindlich zu machen, ist die Optogenetik, bei der Zellen genetisch so verändert werden, dass sie lichtempfindliche Ionenkanäle oder Pumpen exprimieren ^7,8. Dieser Ansatz hat eine beeindruckende Wirksamkeit bei der Regulierung von Zellen im lebenden Gewebe gezeigt. Die Abhängigkeit vom viralen Gentransfer hat jedoch seine breite Einführung in Forschung und klinischen Anwendungen behindert.

Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden organische und anorganische Materialien als lichtempfindliche Wandler verwendet, um nicht-genetische, materialbasierte lichtvermittelte Stimulationstechniken zu entwickeln ^9,10. Organische nanostrukturierte Photowandler 11,12,13,14,15 haben kürzlich bemerkenswerte Erfolge bei der Auslösung zellulärer Reaktionen in verschiedenen Anwendungen gezeigt, einschließlich Neuronen, Kardiomyozyten und Skelettmuskelzellen.

Hier schlagen wir Ziapin2 16,17,18, ein Azobenzolderivat, zur Untersuchung der Ca2+-Ausbreitung in manipulierten laminaren Herzgeweben vor. Die amphiphile Struktur des Moleküls ermöglicht ein präzises Targeting der Plasmamembran der Zelle, während der Azobenzolkern eine lichtinduzierte Isomerisierung ermöglicht, die zu einer Konformationsänderung führt 16,17,18. In Herzzellen verändert diese trans-to-cis-Isomerisierung die Dicke der Plasmamembran und induziert eine Kaskade von Effekten, die ein Aktionspotential erzeugt, das wiederum den Erregungs-Kontraktionsprozess auslöst 19,20,21.

Darüber hinaus beschreiben wir den Herstellungsprozess einer technischen Plattform für das anisotrope Wachstum von Herzgewebe²² und beschreiben detailliert den experimentellen Aufbau, der zur optischen Auslösung und Überwachung seiner Aktivität verwendet wird, mit besonderem Fokus auf die Erfassung der Ca2⁺-Dynamik innerhalb des Gewebes^23,24. Schließlich vergleichen wir die erfassten Signale mit denen, die durch elektrische Stimulation erhalten werden, die als Referenzstandard gilt. Insgesamt unterstreicht dieses Protokoll die Anwendung eines neuartigen lichtempfindlichen Schallkopfs zur Verbesserung unseres Verständnisses des zellulären Verhaltens des Herzens, insbesondere im Zusammenhang mit manipulierten Geweben.

Protokoll

Bei der verwendeten humanen pluripotenten Stammzellkultur (hiPSC) handelt es sich um eine humane humane männliche iPSC-Linie, die ein Doxycyclin (Dox)-induzierbares CRISPR/Cas9-System enthält, das durch die Einführung von CAGrtTA::TetO-Cas9 in den AAVS1-Locus (Addgen: #73500) erzeugt wurde. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den vom Boston Children's Hospital Institutional Review Board genehmigten Protokollen durchgeführt. Die Einverständniserklärung der Patienten wurde vor ihrer Teilnahme an der Studie eingeholt. Die Erzeugung von hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) wurde, wie zuvor beschrieben, induziert^25,26. Das Protokoll soll im folgenden Abschnitt kurz zusammengefasst werden:

1. Erzeugung und Aufbereitung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

1. HiPSCs, die in T75-Kolben kultiviert werden, werden einmal mit PBS gewaschen. Die Zellen werden abgelöst, indem sie 10-15 Minuten lang mit dem Chelatbildner Versen inkubiert und in Bioreaktorgefäße eingesät werden, die mit einer 1%igen Lösung eines nichtionischen Tensids bei einer Dichte von 50 Millionen IPSCs/Gefäß in 100 ml E8-Medium, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632, vorbehandelt sind.
2. Stellen Sie die folgenden Bioreaktorparameter ein: Rühren 60 U/min, Temperatur 37 °C, pH 7 und Überlagerungsbegasung (O₂ und CO₂) bei 3 Standard-L/h.
3. Bestätigen Sie nach 1 Tag in Kultur, dass der Durchmesser des Embryoidkörpers (EB) 100-300 μm erreicht hat, und behandeln Sie die Zellen mit basischem RPMI-Medium (RPMI 1640-Medium, ergänzt mit B27 minus Insulin), das 7 μM CHIR99021 für 24 h enthält, gefolgt von einem Medienwechsel auf RPMI für weitere 24 Stunden. Geben Sie für weitere 48 h basisches RPMI-Medium mit 5 μM IWR-1-endo hinzu, um den Differenzierungsprozess in Richtung der kardialen Linie zu starten. Wechseln Sie nach 48 Stunden das Medium wieder auf die Basis-RPMI.
4. Am 7. Tag der Differenzierung wurden die Kulturzellen in einem basischen RPMI-Medium mit 1:1.000 (v/v) Humaninsulin ergänzt. Aktualisieren Sie das Medium alle 2 Tage oder täglich mit einem Medienwechsel von 50 %, wenn der Sauerstoffverbrauch mehr als 30 % erreicht.
5. An Tag 15 dissoziieren Sie die Bioreaktorzellen 3 h lang enzymatisch mit einer Kollagenase II-Lösung, die HBSS, Kollagenase II (200 Einheiten/ml), HEPES (10 mM), ROCK-Inhibitor Y-27632 (10 μM) und N-Benzyl-p-toluolsulfonamid (BTS, 30 μM) enthält. Dazu werden die differenzierten hiPSC-CM EBs zunächst 2x mit vorgewärmtem HBSS gewaschen und in Kollagenase II Lösung (200 μl Volumen EB / 12 ml Collagenase II Lösung) bei 37 °C in 5% CO₂ inkubiert, bis einzelne Zellen aus der vollständigen EB-Dissoziation erscheinen.
6. Stoppen Sie die Dissoziationsreaktion, indem Sie der Einzelzellsuspension ein gleiches Volumen Blockierungspuffer (RPMI-1640 ohne B27 und DNase II, mit 6 μl DNase II pro ml RPMI-1640) zusetzen. Zählen Sie die differenzierten hiPS-CMs, zentrifugieren Sie sie (200 × g, 5 min) und bereiten Sie sie für nachgelagerte Anwendungen vor, indem Sie die Zellen 24 Stunden lang bei -80 °C in Isopropanol einfrieren und in Flüssigstickstofftanks umfüllen, bis die Aussaat durchgeführt wird.

2. Technische Herstellung von laminarem Gewebe

1. Kleben Sie zwei Schichten Laborklebeband, eine weiße und eine blaue, auf eine 1 mm starke, klare, kratz- und UV-beständige Acrylplatte. Schneiden Sie mit einem CO₂ -Lasergravierer die Acrylplatte in Kreise (20 mm Durchmesser für die 12 MW) und das Chipmuster (3 x 7,5 mm Quadrate, drei pro Chip) auf das Band, wie es in einer Vektorgrafiksoftware (z. B. CorelDraw) entworfen wurde. Acryl-Schneidparameter: 100 Leistung, 20 Geschwindigkeit und 1.000 PPI; Parameter für das Schneiden des Bandes: 8 Leistung, 6 Geschwindigkeiten und 1.000 PPI. Entfernen Sie die beiden Schichten Klebeband in der innersten Linie mit einer Pinzette, weichen Sie die Chips 30 Minuten bis 1 Stunde lang in reinem Bleichmittel ein, um dicke Linien und dunkle Flecken vom Schneiden zu entfernen, und hinterlassen Sie eine scharfe Linie, und spülen Sie die Chips in einem Becherglas über Nacht oder mindestens 3 Stunden lang mit fließendem deionisiertem (DI) Wasser ab.
   HINWEIS: Nicht länger als 2 Stunden bleichen, da dies die Klebstoffe auf den Seitenwänden ätzt und verhindert, dass Gelatine richtig haftet.
2. Beschallen Sie die Chips 10 Minuten lang und die Polydimethylsiloxan-Stempel (PDMS, Sylgard 184) mit Linienrillenmerkmalen (25 μm Rillenbreite, 4 μm Rillenbreite und 5 μm Rillentiefe) für 30 Minuten in sauberem 70%igem Ethanol. Bringen Sie die Chips und Stempel in einen sauberen Bereich unter einer Haube und lassen Sie sie ~1-2 h unter Luftstrom trocknen.
3. Wiegen Sie 1 g Gelatine aus Schweinehaut (Gelstärke ~175 g Bloom, Typ A) in ein 50-ml-Röhrchen. Fügen Sie 5 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu und mischen Sie gründlich, um eine sofortige Auflösung der Gelatine zu gewährleisten. Legen Sie das Röhrchen 30 Minuten lang in ein 65 °C heißes Wasserbad, um den Auflösungsprozess abzuschließen. Wiegen Sie auf ähnliche Weise 1 g mikrobielle Transglutaminase (MTG) in ein separates 50-ml-Röhrchen. Fügen Sie 12,5 ml PBS hinzu, mischen Sie gründlich und legen Sie das Röhrchen 30 Minuten lang in ein 37 °C heißes Wasserbad, um eine vollständige Auflösung des MTG zu gewährleisten.
4. Beschallen Sie das Gelatineröhrchen 15 Minuten lang und stellen Sie es dann vor Gebrauch wieder in das 65 °C warme Wasserbad. Legen Sie das MTG-Röhrchen mit leicht gelockerter Kappe in einen Exsikkator und schalten Sie das Vakuum langsam ein. Beobachten Sie, wie die Blasen unter Vakuum aus der MTG-Lösung entfernt werden. Nach der Entgasung stellen Sie das MTG-Rohr wieder in das 37 °C warme Wasserbad.
   HINWEIS: Überwachen Sie den Prozess und stellen Sie das Vakuum ein, um starkes Kochen zu vermeiden.
5. Decken Sie ein Gitterblatt mit sauberem Parafilm ab, legen Sie die Chips auf das Gitter und halten Sie den Stempel griffbereit. Fügen Sie 5 ml MTG zu den 5 ml Gelatinelösung hinzu und pipetieren Sie vorsichtig, um Blasen zu vermeiden. Pipettieren Sie dann die Gelatine schnell auf den Chip und verwenden Sie so viel, dass die Chipfläche bedeckt ist (jeweils ca. 0,5 ml). Platzieren Sie dann den linienförmigen Stempel PDMS²² (Linienbreite 25 μm, Höhe 5 μm, Abstand 4 μm) darauf und tragen Sie ein Gewicht von 200 g auf, um sicherzustellen, dass die Gelatine parallel zur Längsachse des Gewebes strukturiert ist. Sobald alle Chips geformt sind, decken Sie sie mit einem Glas ab, um Umweltstörungen zu vermeiden, und lassen Sie sie über Nacht vernetzen.
   HINWEIS: Verwenden Sie die gemischte Lösung gelatine-MTG innerhalb von 5 min; Andernfalls wird das Zielmuster aufgrund eines höher vernetzten Zustands der Gelatine verändert.
6. Übertragen Sie den Chip und das PDMS-Stempelsandwich in eine neue, mit PBS gefüllte P150-Schale und hydratisieren Sie die Gelatine 30 Minuten bis 1 Stunde lang, um die Trennung des PDMS-Stempels vom Chip zu erleichtern. Entfernen Sie überschüssige, ungeformte Gelatine um den Chip herum und geben Sie den sauberen Chip in eine neue P150-Schale, die mit PBS gefüllt ist. Lagern Sie die PDMS-Stempel in 70% Ethanol.
7. Sterilisieren Sie die Chips, indem Sie sie 10 Minuten lang unter der Haube in Ethanol einweichen.
   HINWEIS: Nicht länger als 10 min in Ethanol einwirken, da sich die Gelatine bei längerer Einwirkung verformen kann.
8. Übertragen Sie die Chips auf PBS, lassen Sie sie 10 Minuten einweichen und spülen Sie sie 3x aus. Bereiten Sie Beschichtungslösungen vor, indem Sie 20 μg/mL Fibronektin mit 1:100 verdünnter Basalmembranmatrix in Kulturmedien mischen (ca. 0,5 mL pro Well). Die Chips 2 h im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ oder über Nacht bei 4 °C beschichten.
9. Auftauen und Keimzellen (8 × 10⁵ hiPSC-CMs pro cm²) in RPMI-Medium mit Y-27632 (10 μM) und nach 24 Stunden durch RPMI ohne Y-27632 ersetzen.
10. Entfernen Sie drei Tage nach der Zellaussaat das weiße Klebeband mit einer Pinzette.

3. Synthese und Anwendung des Phototransducers

HINWEIS: Ziapin2 wurde gemäß einem zuvor veröffentlichten Verfahren^{synthetisiert 16,18} und hiPSC-CMs direkt im Kulturmedium verabreicht.

1. 25 μM Ziapin2 in die Zellkultur geben und bei 37 °C und 5 % CO₂ 7 min inkubieren.
2. Überschüssige Moleküle vorsichtig auswaschen und mit frischem Kulturmedium abspülen.

4. Viabilitätsprüfung

HINWEIS: Alamar Blue ist ein Resazurin-basierter Assay, der Zellen durchdringen und als Redoxindikator zur Überwachung der Zellviabilität fungieren kann. Resazurin löst sich in physiologischen Puffern auf, was zu einer tiefblauen Lösung führt, die den Zellen in Kultur direkt zugesetzt wird. Lebensfähige Zellen mit aktivem Stoffwechsel reduzieren Resazurin zu Resofurin, das rosa und fluoreszierend ist.

1. Plattenzellen in einer 96-Well-Platte, die zuvor mit 20 μg/mL Fibronektin und 1:100 verdünnter Basalmembranmatrix in Kulturmedien beschichtet war. Mischen Sie durch Schütteln und fügen Sie dann aseptisch Alamar Blue in einer Menge von 10 % des Well-Volumens in jede Vertiefung hinzu.
2. Inkubieren Sie Kulturen mit Alamar Blue für 4 Stunden.
3. Behandeln Sie die Zellen mit dem Phototransducer and Vehicle (DMSO) wie zuvor beschrieben. Wenden Sie eine Lichtstimulation (1 Hz gepulstes Licht für 1 min) über eine optische Faser (Cyan, 470 nm) an, um den Effekt der Ziapin2-Internalisierung und der Lichtexposition auf die Lebensfähigkeit von hiPSC-CM zu bewerten.
4. Lesen Sie die Fluoreszenz mit einem Platten-Reader bei Anregung 560 nm und Emission 590 nm.

5. Bewertung der künstlichen Anisotropie laminarer Herzgewebe

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt einen systematischen Ansatz zur Beurteilung der Anisotropie von künstlich hergestelltem laminarem Herzgewebe unter Verwendung von Immunfärbung, konfokaler Mikroskopie und Zellkernanalyse²⁷.

1. Waschen Sie das Substrat mehrmals mit PBS, bevor Sie es mit 4 % (v/v) Paraformaldehyd mit 0,05 % (v/v) Triton X-100 in PBS für 10 min fixieren.
2. Blockieren Sie die unspezifische Bindung, indem Sie Proben 30 Minuten lang mit 5 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS inkubieren.
3. Inkubieren Sie die Proben mit Hoechst (1:500) bei Raumtemperatur für 1 h.
4. Vor der Montage auf Objektträgern mit einem Anti-Fade-Mittel mit PBS waschen. Lassen Sie die Objektträger über Nacht trocknen und lagern Sie sie bis zur Bildgebung bei 4 °C.
5. Nehmen Sie Proben mit einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung auf. Bestimmen Sie die Ausrichtung der Zellen mit OrientationJ Measure²⁸, einem FiJi-Plugin.

6. Optische Mapping-Aufnahmen

HINWEIS: Das optische Mapping wurde nach 5 Tagen in Kultur an hiPSC-CMs durchgeführt, die auf gelatinegeformte Gewebechips gesät wurden.

1. Um dieses Protokoll zu befolgen, stellen Sie sicher, dass die optische Kartierungsvorrichtung aus einem modifizierten Tandemlinsenmikroskop besteht, das mit einer Hochgeschwindigkeitskamera und der Anregungslichtquelle, einer 200-mW-Quecksilberlampe, ausgestattet ist. Stellen Sie einen dichroitischen Spiegel vor die dafür vorgesehene Ca²⁺ -Bildkamera, um sicherzustellen, dass das Präparat Anregungslicht ausgesetzt ist, und um die von der Probe emittierte Fluoreszenz zu sammeln.
2. Die Probe wird mit 2 μM X-Rhod 1, die dem Kulturmedium zugesetzt wurde, 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert.
   HINWEIS: Setzen Sie die Probe nur während der Bildaufnahme Licht aus, um ein Photobleichen des Farbstoffs zu vermeiden.
3. Inkubieren Sie den Phototrasducer wie zuvor in Abschnitt 3 beschrieben.
4. Mit frischem Kulturmedium waschen und die Chips auf phenolrotfreies Medium RPMI 1640 übertragen, das mit B27 minus Insulin versetzt ist.
5. Legen Sie die Gewebechips in eine temperaturgesteuerte Schüssel und starten Sie die Aufnahme bei physiologischer Temperatur (37 °C), wobei die Bilder mit einer Bildrate von 2,5 Bildern/s aufgenommen werden.
6. Für die optische Stimulation wenden Sie die optische Punktstimulation an einem Ende des Gewebes mit einer LED-Lichtquelle (465/25 nm) an, die eine Ziapin2-Stimulation ermöglicht. Beschleunigen Sie das Gewebe mit einer Frequenz von 0,5 oder 1 Hz über eine zeitlich regulierte optische Faser, die 1 mm vom Gewebe entfernt positioniert ist. Für die elektrische Stimulation wenden Sie eine Punktstimulation mit einer bipolaren Platinelektrode an, die in der Mitte des distalsten Endes des rechteckigen Gewebes positioniert ist. Diese Platzierung stellt sicher, dass die Ausbreitung der Ca2⁺ -Welle von der Mitte der Gewebebreite ausgeht, die der kürzeren Seite des Rechtecks entspricht. Die Stimulation sollte bei einer Frequenz von 0,5 Hz, mit einer Amplitude von 10 V und einer Impulsdauer von 100 ms erfolgen.
7. Wenden Sie nach den Aufnahmen einen räumlichen Filter mit einer Größe von 3 x 3 Pixeln an, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.
8. Bestimmen Sie die Ca²⁺ -Wellenleitungsgeschwindigkeit an jedem Pixel für jeden Impuls und berechnen Sie die Änderungsrate sowohl in x- als auch in y-Richtung. Messen Sie dazu den räumlichen Gradienten der Intensität des Ca²⁺ -Signals in diese Richtungen und setzen Sie ihn in Beziehung zur Zeitverzögerung der Ausbreitung des Signals. Durch die Kombination dieser Richtungsänderungsraten können Sie quantifizieren, wie schnell sich die Welle in beiden Dimensionen über das zelluläre Feld ausbreitet.

7. Datenexport und -verarbeitung

1. Extrahieren und analysieren Sie die Daten mit der referenzierten Software.
2. Wenden Sie einen räumlichen Filter von 3 x 3 Pixeln an, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.
3. Extrahieren Sie die Ca2⁺ -Transientenkurven (CaT) als Mittelwert eines bestimmten manuell ausgewählten Region of Interest (ROI).
4. Messen Sie die CaT-Parameter in einem zentralen Bereich of Interest (ROI) von 50 x 50 Pixeln (≈ 25 mm²).
5. Analysieren Sie für jeden CaT die CaT-Amplitude, die Anstiegszeit (t_Peak), die Zeit der maximalen Abklingneigung (Max Decay Slope) und die Zeit bis zum transienten Abklingen von 90 % (Abklingzeit₉₀).

8. Statistische Auswertung

1. Beurteilen Sie die Normalverteilung mit einem geeigneten statistischen Test, z. B. einem Normalitätstest, um zu bestimmen, ob parametrische oder nicht-parametrische Methoden angewendet werden sollten.
2. Bewerten Sie die statistische Signifikanz zwischen zwei Bedingungen mit dem Student's t-Test oder dem Mann-Whitney U-Test für kontinuierliche bzw. kategoriale Daten. Wenn Sie mehr als zwei Gruppen vergleichen, verwenden Sie je nach Datenannahmen eine unidirektionale ANOVA oder den Kruskal-Wallis-Test, gefolgt von geeigneten Post-hoc-Tests, um signifikante paarweise Unterschiede zu identifizieren.

Ergebnisse

Es wurde ein mehrstufiges Verfahren für die Herstellung von künstlich hergestelltem laminarem Herzgewebe unter Verwendung einer Kombination aus Laserstrukturierung, Gelatineformung und Zellaussaattechniken entwickelt und implementiert. Ursprünglich von McCain et ^al.22 und Lee et ^al.24 etabliert, wurde diese Technik nach deren Protokollen zur Konstruktion des manipulierten laminaren Mikrogewebes erneut implementiert. Das Verfahren integri...

Diskussion

Dieser Ansatz bietet eine robuste Plattform für die Weiterentwicklung der kardiologischen Forschung und bietet Einblicke in die komplexe Dynamik des Herzgewebes und eröffnet neue Möglichkeiten für kardiomechanistische Langzeitstudien in vitro , die möglicherweise zu neuen therapeutischen Strategien führen könnten. Um den Erfolg dieser Methode zu gewährleisten, ist es entscheidend, eine mikrophysiologische Umgebung zu reproduzieren, die die In-vivo-Bedingungen de...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
alamarBlue Cell Viability Reagent	Thermo Fisher Scientific	DAL1025	Cell Viability Assay
B-27 Supplement, minus insulin	Thermo Fisher Scientific	A1895601	For cell culture
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9056-50G	For cell staining
BrainVision Analyzer software	Brain Products	https://www.brainproducts.com/downloads/analyzer/	Data export and handling
BTS	Sigma	203895-5MG
CHIR99021	Stem Cell Technologies	72054
Clear Scratch- and UV-Resistant Acrylic Sheet, 12" x 12" x 0.01 inch	McMaster Carr	4076N11	Tissue chip fabrication
Collagenase Type II	Worthington	CLS-2 / LS004176
DNase II	VWR	89346-540
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	For cell culture
Fibronectin	VWR	47743-654	Coating
Gelatin from porcine skin gel strength 175 Type A	Sigma-Aldrich	G2625-100G	Tissue chip fabrication
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Coating
HBSS	Thermo Fisher	14175-095
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080
Hoechst 33342	Life technologies	H1399	For cell staining
Insulin solution human	Sigma Aldrich	I9278-5ML
IWR-1-endo	Stem Cell Technologies	72564
Paraformadehyde 16% Aqueous Solution (PFA)	VWR	100503-917	For cell staining
PBS, sterile, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	10010049	Tissue chip fabrication
phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	10010049
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)	Thermo Fisher Scientific	P3000MP	Non-ionic surfactant
ROCK inhibitor Y-27632	Stem Cell Technologies	72304
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870127	For cell culture
RPMI 1640 Medium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	11835030	Optical mapping
Versene Solution	Thermo Fisher Scientific	15040066	chelating agent
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape	VWR	89098-058	Tissue chip fabrication
X-Rhod-1 AM	Thermo Fisher Scientific	X14210	Optical mapping