비유전적 광학 자극을 통한 Ca2+ 전파를 연구하기 위한 심장 미세생리학적 시스템

요약

빛을 사용하여 심장 세포와 조직을 제어하면 비접촉 자극이 가능하여 세포의 자연 상태와 기능을 보존할 수 있으므로 기본 연구와 치료 응용 분야 모두에 유용한 접근 방식이 됩니다.

초록

체외 심장 미세생리학 모델은 과학 연구, 약물 개발 및 의료 응용 분야에서 매우 신뢰할 수 있습니다. 과학계에서 널리 받아들여지고 있지만 이러한 시스템은 비침습적 자극 기술이 없기 때문에 여전히 수명이 제한되어 있습니다. Phototransducer는 효율적인 자극 방법을 제공하여 높은 시간 및 공간 해상도로 무선 접근 방식을 제공하는 동시에 자극 과정의 침입을 최소화합니다. 이 원고에서는 체외 심장 미세생리학적 모델의 활동을 자극하고 감지하기 위한 완전한 광학 방법을 제시합니다. 특히, 3D 생물반응기 현탁액 배양에서 생성된 인간 유도 만능 줄기세포 유래 심근세포(hiPSC-CM)를 파종하여 엔지니어링된 층류 이방성 조직을 제작했습니다. 우리는 자극을 위해 Ziapin2라는 양친매성 아조벤젠 유도체인 광 변환기를 사용했고, 시스템의 반응을 모니터링하기 위해 Ca²⁺ 염료(X-Rhod 1)를 사용했습니다. 결과는 Ziapin2가 조직 무결성, 생존력 또는 행동을 손상시키지 않고 고용된 시스템에서 Ca²⁺ 반응을 광조절할 수 있음을 보여줍니다. 또한, 우리는 광 기반 자극 접근법이 현재의 황금 표준인 전기 자극과 유사한 해상도를 제공한다는 것을 보여주었습니다. 전반적으로 이 프로토콜은 심장 연구에서 Ziapin2 및 재료 기반 광자극의 적용에 대한 유망한 관점을 열어줍니다.

서문

살아있는 세포와 조직을 자극하기 위해 빛을 사용하는 것은 생물 의학 연구에서 중요한 게임 체인저로 부상하고 있으며, 정확한 시간 및 공간 해상도 ^1,2,3,4,5,6으로 비접촉식 자극 기능을 제공합니다. 세포를 빛에 민감하게 만드는 데 사용되는 주요 기술 중 하나는 광유전학으로, 빛에 민감한 이온 채널 또는 펌프를 발현하도록 세포를 유전적으로 변형하는 것과 관련이 있습니다 ^7,8. 이 접근법은 살아있는 조직 내의 세포를 조절하는 데 인상적인 효과를 보여주었습니다. 그러나 바이러스 유전자 전달에 대한 의존도는 연구 및 임상 응용 분야에서 광범위한 채택을 방해했습니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 유기 및 무기 물질이 비유전적 물질 기반 광 매개 자극 기술을 개발하기 위해 빛에 민감한 변환기로 사용되었습니다 ^9,10. 유기 나노 구조 광 변환기 11,12,13,14,15는 최근 뉴런, 심근 세포 및 골격근 세포를 포함한 다양한 응용 분야에서 세포 반응을 유발하는 데 놀라운 성공을 거두었습니다.

본 명세서에서는 조작된 층류 심장 조직에서 Ca²⁺ 전파를 조사하기 위해 아조벤젠 유도체인 Ziapin2 16,17,18을 제안합니다. 분자의 양친매성 구조는 세포 원형질막의 정확한 표적화를 가능하게 하는 반면, 아조벤젠 코어는 광 유도 이성질체화를 가능하게 하여 구조적 변화를 일으킵니다 16,17,18. 심장 세포에서 이러한 trans-to-cis 이성질체화는 원형질막 두께를 변경하여 활동 전위를 생성하는 연쇄 효과를 유도하며, 이는 차례로 여기-수축 과정을 유발합니다 19,20,21.

또한, 우리는 심장 조직²²의 이방성 성장을 위한 엔지니어링 플랫폼의 제작 과정을 설명하고 조직 내에서 Ca²⁺ 역학을 획득하는 데 특히 중점을 두고 그 활동을 광학적으로 트리거하고 모니터링하는 데 사용되는 실험 설정을 자세히 설명합니다^23,24. 마지막으로, 획득한 신호를 참조 표준으로 간주되는 전기 자극을 통해 얻은 신호와 비교합니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 특히 조작된 조직의 맥락에서 심장 세포 행동에 대한 이해를 발전시키는 데 새로운 광 반응 변환기의 적용을 강조합니다.

프로토콜

사용된 인간 만능 줄기세포(hiPSC) 배양은 CAGrtTA::TetO-Cas9를 AAVS1 유전자 자리에 도입하여 생성된 독시사이클린(Dox) 유도 CRISPR/Cas9 시스템을 보유한 야생형 인간 남성 iPSC 계통입니다(Addgene: #73500). 이 연구는 Boston Children's Hospital Institutional Review Board에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 환자가 연구에 참여하기 전에 환자로부터 정보에 입각한 동의를 받았습니다. hiPSC 유래 심근세포(hiPSC-CM)의 생성은 앞서 설명한 바와 같이 유도되었다^25,26. 프로토콜은 다음 섹션에 간략하게 요약되어 있습니다.

1. 인간 유도 만능 줄기세포 유래 심근세포의 생성 및 제조

1. T75 플라스크에서 배양된 hiPSC를 PBS로 한 번 세척합니다. 킬레이트제인 Versene으로 10-15분 동안 배양하여 세포를 분리하고 10μM ROCK 억제제 Y-27632가 보충된 100mL의 E8 배지에서 5천만 IPSC/용기의 밀도로 1% 비이온 계면활성제 용액으로 전처리된 생물반응기 용기에 시드합니다.
2. 다음 생물반응기 매개변수를 설정합니다: 교반 60rpm, 온도 37°C, pH 7 및 3 표준 L/h에서 오버레이 가스(O₂ 및 CO₂).
3. 배양 1일 후 배아체(EB) 직경이 100-300μm에 도달했는지 확인하고 24시간 동안 7μM CHIR99021을 함유한 기본 RPMI 배지(B27에서 인슐린을 뺀 RPMI 1640 배지)로 세포를 처리한 다음 다시 24시간 동안 배지를 RPMI로 변경합니다. 5μM IWR-1-endo를 함유한 염기성 RPMI 배지를 48시간 동안 더 첨가하여 심장 계통을 향한 분화 과정을 시작합니다. 48시간 후 매체를 다시 기본 RPMI로 변경합니다.
4. 분화 7일차에 1:1,000(v/v) 인간 인슐린이 보충된 기본 RPMI 배지에서 세포를 배양합니다. 산소 소비량이 30% 이상에 도달하는 경우 2일마다 또는 매일 50% 매체 변경으로 미디어를 새로 고칩니다.
5. 15일째에 HBSS, Collagenase II(200 units/mL), HEPES(10 mM), ROCK 억제제 Y-27632(10 μM) 및 N-benzyl-p-toluenesulfonamide(BTS, 30 μM)를 포함하는 Collagenase II 용액을 사용하여 3시간 동안 생물반응기 세포를 효소로 해리합니다. 이를 위해 먼저 예열된 HBSS로 분화된 hiPSC-CM EBs 2x를 세척하고 완전한 EB 해리에서 단일 세포가 나타날 때까지 5% CO₂에서 37°C의 Collagenase II 용액(EB 200μl 부피 / Collagenase II 용액 12ml)에서 배양합니다.
6. 단일 세포 현탁액에 동일한 부피의 블로킹 버퍼(B27 및 DNase II가 없는 RPMI-1640, RPMI-1640 mL당 DNase II 6μL)를 추가하여 해리 반응을 중지합니다. 분화된 hiPSC-CM, 원심분리기(200 × g, 5분)를 계수하고 세포를 -80°C의 이소프로판올에서 24시간 동안 동결하고 파종(seeding)이 수행될 때까지 액체 질소 탱크로 옮겨 다운스트림 응용 분야를 준비합니다.

2. 설계된 층류 조직 제작

1. 1mm 두께의 투명 긁힘 및 자외선 방지 아크릴 시트에 흰색과 파란색의 두 겹의 실험실 테이프를 부착합니다. CO₂ 레이저 조각기를 사용하여 벡터 그래픽 소프트웨어(예: CorelDraw)에서 설계한 대로 테이프의 아크릴 시트를 원형(12MW에 맞게 직경 20mm)과 칩 패턴(3 x 7.5mm 정사각형, 칩당 3개)으로 자릅니다. 아크릴 절단 매개변수: 100 출력, 20 속도 및 1,000 PPI; 테이프 절단 매개변수: 8 출력, 6 속도 및 1,000 PPI. 핀셋을 사용하여 가장 안쪽 선 안쪽의 두 겹의 테이프를 제거하고 칩을 순수 표백제에 30분에서 1시간 동안 담가 두꺼운 선과 검은 반점을 제거하여 날카로운 선을 남기고 칩을 흐르는 탈이온수(DI)가 있는 비커에 밤새 또는 최소 3시간 동안 헹굽니다.
   알림: 2시간 이상 표백제를 사용하면 측벽에 접착제가 에칭되어 젤라틴이 제대로 부착되는 것을 방지할 수 있습니다.
2. 깨끗한 70% 에탄올에서 10분 동안 칩을 초음파 처리하고 라인 홈 기능(25μm 릿지 너비, 4μm 홈 너비 및 5μm 홈 깊이)이 있는 폴리디메틸실록산(PDMS, Sylgard 184) 스탬프를 30분 동안 초음파 처리합니다. 칩과 스탬프를 후드 아래의 깨끗한 곳으로 옮기고 ~1-2시간 동안 공기 흐름에서 건조시킵니다.
3. 돼지 껍질(젤 강도 ~175g Bloom, Type A)의 젤라틴 1g을 50mL 튜브에 넣습니다. 인산염 완충 식염수(PBS) 5mL를 넣고 젤라틴이 즉시 용해되도록 완전히 혼합합니다. 튜브를 65°C 수조에 30분 동안 넣어 용해 과정을 완료합니다. 마찬가지로, 미생물 트랜스글루타미나제(MTG) 1g의 무게를 별도의 50mL 튜브에 넣습니다. PBS 12.5mL를 넣고 완전히 섞은 다음 MTG가 완전히 용해되도록 튜브를 37°C 수조에 30분 동안 놓습니다.
4. 젤라틴 튜브를 15분 동안 초음파 처리한 다음 사용하기 전에 65°C 수조에 다시 넣습니다. 캡이 약간 느슨해진 상태에서 MTG 튜브를 데시케이터에 넣고 진공 청소기를 천천히 켭니다. 진공 상태에서 MTG 용액에서 기포가 제거되는 것을 관찰합니다. 가스를 제거한 후 MTG 튜브를 37°C 수조로 되돌립니다.
   알림: 프로세스를 모니터링하고 격렬한 끓는 것을 방지하기 위해 진공 청소기를 조정하십시오.
5. 그리드 시트를 깨끗한 파라필름으로 덮고, 그리드에 칩을 놓고, 스탬프를 근처에 두어 사용할 수 있도록 준비합니다. 젤라틴 용액 5mL에 MTG 5mL를 넣고 거품이 생기지 않도록 조심스럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 칩 영역(각각 약 0.5mL)을 덮을 만큼 충분히 사용하여 젤라틴을 칩에 빠르게 피펫합니다. 그런 다음 라인 패턴의 PDMS 22(라인 너비^25μm , 높이 5μm, 간격 4μm) 스탬프를 위에 놓고 젤라틴이 조직의 세로축과 평행하게 패턴화되도록 200g의 무게를 적용합니다. 모든 칩이 성형되면 유리병으로 덮어 환경 방해를 피하고 밤새 가교되도록 합니다.
   참고: 5분 이내에 혼합 용액 젤라틴-MTG를 사용하십시오. 그렇지 않으면, 젤라틴의 더 높은 가교 상태로 인해 타겟 패턴이 변경됩니다.
6. 칩과 PDMS 스탬프 샌드위치를 PBS로 채워진 새 P150 접시에 옮기고 젤라틴을 30분에서 1시간 동안 수화시켜 칩에서 PDMS 스탬프를 쉽게 분리할 수 있도록 합니다. 칩 주변의 과도한 성형되지 않은 젤라틴을 제거하고 깨끗한 칩을 PBS로 채워진 새 P150 접시에 옮깁니다. PDMS 스탬프를 70% 에탄올에 보관하십시오.
7. 칩을 후드 아래에서 10분 동안 에탄올에 담가 칩을 살균합니다.
   알림: 에탄올에 10분을 초과하지 마십시오., 장시간 노출되면 젤라틴이 변형될 수 있습니다.
8. 칩을 PBS로 옮기고 10분 동안 담근 다음 3번 헹굽니다. 배양 배지에서 20μg/mL 피브로넥틴과 1:100 희석된 기저막 매트릭스를 혼합하여 코팅 용액을 준비합니다(웰당 약 0.5mL). 인큐베이터에서 37°C 및 5% CO₂ 또는 4°C에서 밤새 칩을 2시간 동안 코팅합니다.
9. RPMI 배지에서 Y-27632(10μM)로 세포(8 × 10⁵ hiPSC-CMs per cm²)를 해동 및 시드한 다음 24시간 후에 Y-27632가 없는 RPMI로 교체합니다.
10. 세포 파종 3일 후 핀셋을 사용하여 흰색 테이프를 제거합니다.

3. phototransducer의 종합 그리고 신청

참고: Ziapin2는 이전에 발표된 절차^16,18에 따라 합성되었으며 배양 배지에서 hiPSC-CM에 직접 투여되었습니다.

1. 세포 배양액에 25μM의 Ziapin2를 추가하고 37°C 및 5% CO₂ 에서 7분 동안 배양합니다.
2. 과도한 분자를 부드럽게 씻어내고 신선한 배양 배지로 헹굽니다.

4. 생존력 분석

참고: Alamar Blue는 세포를 투과하고 세포 생존력을 모니터링하기 위한 산화 환원 지표 역할을 할 수 있는 레사주린 기반 분석법입니다. 레사주린은 생리학적 완충액에 용해되어 배양 중인 세포에 직접 첨가되는 짙은 파란색 용액을 생성합니다. 신진대사가 활발한 생존 세포는 레사주린을 분홍색이고 형광성을 띤 레소푸린으로 환원시킵니다.

1. 배양 배지에서 20μg/mL 피브로넥틴과 1:100 희석된 기저막 매트릭스로 이전에 코팅된 96웰 플레이트의 플레이트 셀. 흔들어서 혼합한 다음 웰 부피의 10%에 해당하는 양으로 각 웰에 Alamar Blue를 무균 첨가합니다.
2. 4시간 동안 Alamar Blue로 배양을 배양합니다.
3. 앞서 설명한 바와 같이 DMSO(Phototransducer and Vehicle)로 세포를 처리합니다. 광섬유(청록색, 470nm)를 통해 광 자극(1Hz 펄스광)을 적용하여 Ziapin2 내재화 및 광 노출이 hiPSC-CM 생존력에 미치는 영향을 평가합니다.
4. 여기 560 nm 및 방출 590 nm에서 플레이트 리더로 형광을 판독합니다.

5. 공학적 층류 심장 조직 비등방성의 평가

참고: 이 프로토콜은 면역염색, 컨포칼 현미경 및 핵 분석을 사용하여 엔지니어링된 층류 심장 조직의 이방성을 평가하기 위한 체계적인 접근 방식을 설명합니다²⁷.

1. PBS에 0.05%(v/v) Triton X-100을 함유한 4%(v/v) 파라포름알데히드로 고정하기 전에 PBS로 기판을 10분 동안 여러 번 세척합니다.
2. PBS에서 5%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)이 포함된 샘플을 30분 동안 배양하여 비특이적 결합을 차단합니다.
3. Hoechst(1:500)로 실온에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다.
4. 페이드 방지제로 현미경 슬라이드에 장착하기 전에 PBS로 세척하십시오. 슬라이드를 밤새 건조시키고 이미징할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
5. 20배 배율의 회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용한 이미지 샘플. FiJi 플러그인인 OrientationJ Measure²⁸을 사용하여 셀의 방향을 결정합니다.

6. 광학 매핑 기록

참고: 광학 매핑은 젤라틴 성형 조직 칩에 파종된 hiPSC-CM에서 배양한 후 5일 후에 수행되었습니다.

1. 이 프로토콜을 따르려면 광학 매핑 장치가 고속 카메라와 여기 광원인 200mW 수은 램프가 장착된 수정된 탠덤 렌즈 현미경으로 구성되어 있는지 확인하십시오. 지정된 Ca²⁺ 이미징 카메라 앞에 이색성 거울을 놓아 준비물이 여기광에 노출되도록 하고 샘플에서 방출된 형광을 수집합니다.
2. 배양 배지에 2 μM X-Rhod 1을 첨가하여 37 °C에서 30 분 동안 샘플을 배양합니다.
   참고: 염료의 광표백을 방지하기 위해 이미지 획득 중에만 샘플을 빛에 노출시키십시오.
3. 섹션 3에서 이전에 설명한 대로 phototrasducer를 배양합니다.
4. 새로운 배양 배지로 세척하고 칩을 B27에서 인슐린을 뺀 페놀이 없는 RPMI 1640 배지로 옮깁니다.
5. 티슈 칩을 온도 조절이 가능한 접시에 넣고 생리적 온도(37°C)에서 기록을 시작하여 2.5프레임/초의 프레임 속도로 이미지를 획득합니다.
6. 광학적인 걸림을 위해, Ziapin2 자극을 허용하는 LED 광원 (465/25 nm)를 사용하여 조직의 한쪽 끝에 광학적인 점 자극을 적용하십시오. 조직에서 1mm 떨어진 곳에 위치한 시간적으로 조절되는 광섬유를 통해 0.5 또는 1Hz 주파수로 조직의 페이스를 조정합니다. 전기적 페이싱을 위해 직사각형 조직의 가장 말단부 중앙에 위치한 바이폴라 백금 전극을 사용하여 점 자극을 가합니다. 이 배치는 Ca²⁺ 파동 전파가 직사각형의 짧은 면에 해당하는 조직 너비의 중간 지점에서 시작되도록 합니다. 자극은 0.5Hz의 주파수, 진폭이 10V이고 펄스 지속 시간이 100ms인 상태에서 적용되어야 합니다.
7. 기록 후 3 x 3 픽셀 크기의 공간 필터를 적용하여 신호 대 잡음 비율을 개선합니다.
8. 모든 펄스에 대해 각 픽셀에서 Ca²⁺ 파동 전도 속도를 결정하고 x 방향과 y 방향을 따라 변화율을 계산합니다. 이를 위해 이러한 방향에서 Ca²⁺ 신호 강도의 공간 기울기를 측정하고 이를 신호 전파의 시간 지연과 연관시킵니다. 이러한 방향성 변화율을 결합하여, 파동이 두 차원에서 세포장을 가로질러 얼마나 빨리 이동하는지 정량화할 수 있습니다.

7. 데이터 내보내기 및 처리

1. 참조된 소프트웨어로 데이터를 추출하고 분석합니다.
2. 3 x 3 픽셀의 공간 필터를 적용하여 신호 대 잡음 비율을 개선합니다.
3. Ca²⁺ 과도 현상(CaT) 트레이스를 수동으로 선택한 특정 관심 영역(ROI)의 평균으로 추출합니다.
4. 50 x 50 픽셀(≈ 25 mm²)의 중앙 관심 영역(ROI)에서 CaT 매개변수를 측정합니다.
5. 각 CaT에 대해 CaT 진폭, 상승 시간(t_피크), 최대 감쇠 기울기 시간(Max Decay Slope) 및 90% 과도 감쇠까지의 시간(Decay Time₉₀)을 분석합니다.

8. 통계 분석

1. 정규성 검정과 같은 적절한 통계 검정을 사용하여 분포의 정규성을 평가하여 모수 또는 비모수 방법을 적용해야 하는지 여부를 결정합니다.
2. 연속형 또는 범주형 데이터에 대해 각각 스튜던트 t-검정 또는 Mann-Whitney U-검정을 사용하여 두 조건 간의 통계적 유의성을 평가합니다. 세 개 이상의 그룹을 비교할 때는 데이터 가정에 따라 일원 분산 분석(One-way ANOVA) 또는 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정을 사용한 다음 적절한 사후 검정을 사용하여 유의한 쌍별 차이를 식별합니다.

결과

레이저 패터닝, 젤라틴 성형 및 세포 파종 기술의 조합을 사용하여 엔지니어링된 층류 심장 조직을 제작하기 위해 다단계 공정이 개발되고 구현되었습니다. 원래 McCain et ^al.22 및 Lee et ^al.24에 의해 확립된 이 기술은 엔지니어링된 층류 미세조직을 구성하기 위한 프로토콜에 따라 다시 구현되었습니다. 이 공정은 구조 안내를 위한 정밀한...

토론

이 접근 방식은 심장 연구를 발전시키기 위한 강력한 플랫폼을 제공하며, 심장 조직의 복잡한 역학에 대한 통찰력을 제공하여 잠재적으로 새로운 치료 전략으로 이어질 수 있는 장기적인 체외 심장 기계론적 연구에 대한 새로운 가능성을 열어줍니다. 이 방법론의 성공을 보장하기 위해서는 인간 심장의 생체 내 조건을 밀접하게 모방하는 미시생리학적 환경...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
alamarBlue Cell Viability Reagent	Thermo Fisher Scientific	DAL1025	Cell Viability Assay
B-27 Supplement, minus insulin	Thermo Fisher Scientific	A1895601	For cell culture
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9056-50G	For cell staining
BrainVision Analyzer software	Brain Products	https://www.brainproducts.com/downloads/analyzer/	Data export and handling
BTS	Sigma	203895-5MG
CHIR99021	Stem Cell Technologies	72054
Clear Scratch- and UV-Resistant Acrylic Sheet, 12" x 12" x 0.01 inch	McMaster Carr	4076N11	Tissue chip fabrication
Collagenase Type II	Worthington	CLS-2 / LS004176
DNase II	VWR	89346-540
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	For cell culture
Fibronectin	VWR	47743-654	Coating
Gelatin from porcine skin gel strength 175 Type A	Sigma-Aldrich	G2625-100G	Tissue chip fabrication
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Coating
HBSS	Thermo Fisher	14175-095
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080
Hoechst 33342	Life technologies	H1399	For cell staining
Insulin solution human	Sigma Aldrich	I9278-5ML
IWR-1-endo	Stem Cell Technologies	72564
Paraformadehyde 16% Aqueous Solution (PFA)	VWR	100503-917	For cell staining
PBS, sterile, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	10010049	Tissue chip fabrication
phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	10010049
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)	Thermo Fisher Scientific	P3000MP	Non-ionic surfactant
ROCK inhibitor Y-27632	Stem Cell Technologies	72304
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870127	For cell culture
RPMI 1640 Medium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	11835030	Optical mapping
Versene Solution	Thermo Fisher Scientific	15040066	chelating agent
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape	VWR	89098-058	Tissue chip fabrication
X-Rhod-1 AM	Thermo Fisher Scientific	X14210	Optical mapping