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Resumo

O uso da luz para controlar células e tecidos cardíacos permite a estimulação sem contato, preservando assim o estado natural e a função das células, tornando-se uma abordagem valiosa tanto para pesquisa básica quanto para aplicações terapêuticas.

Resumo

Os modelos microfisiológicos cardíacos in vitro são altamente confiáveis para pesquisa científica, desenvolvimento de medicamentos e aplicações médicas. Embora amplamente aceitos pela comunidade científica, esses sistemas ainda são limitados em longevidade devido à ausência de técnicas de estimulação não invasivas. Os fototransdutores fornecem um método de estimulação eficiente, oferecendo uma abordagem sem fio com alta resolução temporal e espacial, minimizando a invasividade nos processos de estimulação. Neste manuscrito, apresentamos um método totalmente óptico para estimular e detectar a atividade de um modelo microfisiológico cardíaco in vitro. Especificamente, fabricamos tecidos anisotrópicos laminares projetados semeando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) gerados em uma cultura de suspensão de biorreator 3D. Empregamos um fototransdutor, um derivado anfifílico de azobenzeno, denominado Ziapin2, para estimulação e um corante Ca2+ (X-Rhod 1) para monitorar a resposta do sistema. Os resultados demonstram que o Ziapin2 pode fotomodular as respostas de Ca2+ no sistema empregado sem comprometer a integridade, viabilidade ou comportamento do tecido. Além disso, mostramos que a abordagem de estimulação baseada em luz oferece uma resolução semelhante em comparação com a estimulação elétrica, o padrão-ouro atual. No geral, este protocolo abre perspectivas promissoras para a aplicação de Ziapin2 e fotoestimulação baseada em materiais na pesquisa cardíaca.

Introdução

O uso da luz para estimular células e tecidos vivos está emergindo como um divisor de águas significativo na pesquisa biomédica, oferecendo recursos de estimulação sem toque com resolução temporal e espacial precisa 1,2,3,4,5,6. Uma das principais técnicas usadas para tornar as células sensíveis à luz é a optogenética, que envolve a modificação genética de células para expressar canais iônicos sensíveis à luzou bombas 7,8. Essa abordagem demonstrou uma eficácia impressionante na regulação de células dentro do tecido vivo; no entanto, sua dependência da transferência de genes virais impediu sua ampla adoção em pesquisas e aplicações clínicas.

Para superar essa limitação, materiais orgânicos e inorgânicos têm sido usados como transdutores sensíveis à luz para desenvolver técnicas de estimulação mediada por luz não genéticas baseadas em materiais 9,10. Fototransdutores nanoestruturados orgânicos 11,12,13,14,15 demonstraram recentemente um sucesso notável no desencadeamento de respostas celulares em diversas aplicações, incluindo neurônios, cardiomiócitos e células musculares esqueléticas.

Aqui, propomos Ziapin216,17,18, um derivado do azobenzeno, para investigar a propagação de Ca2+ em tecidos cardíacos laminares projetados. A estrutura anfifílica da molécula permite o direcionamento preciso da membrana plasmática celular, enquanto o núcleo de azobenzeno permite a isomerização induzida pela luz, levando à sua mudança conformacional16 , 17 , 18 . Nas células cardíacas, essa isomerização trans-to-cis altera a espessura da membrana plasmática, induzindo uma cascata de efeitos que gera um potencial de ação, que por sua vez desencadeia o processo de excitação-contração 19,20,21.

Além disso, descrevemos o processo de fabricação de uma plataforma projetada para o crescimento anisotrópico do tecido cardíaco22 e detalhamos a configuração experimental usada para desencadear e monitorar opticamente sua atividade, com foco particular na aquisição da dinâmica de Ca2+ dentro do tecido23,24. Por fim, comparamos os sinais adquiridos com os obtidos por meio de estimulação elétrica, que é considerada o padrão de referência. No geral, este protocolo destaca a aplicação de um novo transdutor responsivo à luz no avanço de nossa compreensão do comportamento celular cardíaco, especialmente no contexto de tecidos projetados.

Protocolo

A cultura de células-tronco pluripotentes humanas (hiPSC) usada é uma linha de iPSC masculina humana de tipo selvagem que abriga um sistema CRISPR/Cas9 induzível por doxiciclina (Dox), criado pela introdução de CAGrtTA::TetO-Cas9 no locus AAVS1 (Addgene: #73500). O estudo foi conduzido de acordo com os protocolos aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional do Hospital Infantil de Boston. O consentimento informado foi obtido dos pacientes antes de sua participação no estudo. A geração de cardiomiócitos derivados de hiPSC (hiPSC-CMs) foi induzida conforme descrito anteriormente 25,26. O protocolo será brevemente resumido na seção a seguir:

1. Geração e preparação de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

  1. Lave os hiPSCs cultivados em frascos T75 uma vez com PBS. Separe as células incubando com o agente quelante Versene por 10-15 min e semeie em vasos de biorreator pré-tratados com solução a 1% de surfactante não iônico a uma densidade de 50 milhões de IPSCs / vaso em 100 mL de meio E8 suplementado com 10 μM de inibidor de ROCK Y-27632.
  2. Defina os seguintes parâmetros do biorreator: agitação 60 rpm, temperatura 37 °C, pH 7 e gaseificação de sobreposição (O2 e CO2) a 3 L/h padrão.
  3. Após 1 dia em cultura, confirme se o diâmetro do corpo embrióide (EB) atingiu 100-300 μm e trate as células com meio RPMI básico (meio RPMI 1640 suplementado com B27 menos insulina), contendo 7 μM CHIR99021 por 24 h, seguido de mudança de meio para RPMI por mais 24 h. Adicione o meio RPMI básico contendo 5 μM de IWR-1-endo por mais 48 h para iniciar o processo de diferenciação em direção à linhagem cardíaca. Após 48 h, altere o meio de volta para RPMI básico.
  4. No dia 7 de diferenciação, cultive células em um meio RPMI básico suplementado com insulina humana 1:1.000 (v/v). Atualize a mídia a cada 2 dias ou todos os dias com uma mudança de 50% no meio se o consumo de oxigênio atingir mais de 30%.
  5. No dia 15, dissocie enzimaticamente as células do biorreator por 3 h usando uma solução de colagenase II contendo HBSS, colagenase II (200 unidades / mL), HEPES (10 mM), inibidor de ROCK Y-27632 (10 μM) e N-benzil-p-toluenossulfonamida (BTS, 30 μM). Para fazer isso, primeiro lave os EBs hiPSC-CM diferenciados 2x com HBSS pré-aquecido e incube-os em solução de colagenase II (volume de 200 μl de EBs / 12 ml de solução de colagenase II) a 37 ° C em 5% de CO2 até que células únicas apareçam da dissociação completa de EB.
  6. Pare a reação de dissociação adicionando um volume igual de tampão de bloqueio (RPMI-1640 sem B27 e DNase II, com 6 μL de DNase II por mL de RPMI-1640) à suspensão de célula única. Conte os hiPSC-CMs diferenciados, centrifugue (200 × g, 5 min) e prepare-se para aplicações a jusante, congelando as células a -80 ° C em isopropanol por 24 h e movendo-as para tanques de nitrogênio líquido até que a semeadura seja realizada.

2. Fabricação laminar projetada do tecido

  1. Cole duas camadas de fita de laboratório, uma branca e outra azul, em uma folha de acrílico transparente de 1 mm de espessura, resistente a arranhões e UV. Usando um gravador a laser CO2 , corte a folha de acrílico em círculos (20 mm de diâmetro para caber nos 12 MW) e o padrão de chip (quadrados de 3 x 7,5 mm, três por chip) na fita conforme projetado em software de gráficos vetoriais (por exemplo, CorelDraw); parâmetros de corte de acrílico: 100 potências, 20 velocidades e 1.000 PPI; parâmetros de corte de fita: 8 potências, 6 velocidades e 1.000 PPI. Remova as duas camadas de fita dentro da linha mais interna usando uma pinça, mergulhe os cavacos em alvejante puro por 30 min a 1 h para remover linhas grossas e manchas escuras do corte, deixando uma linha afiada, e enxágue os cavacos em um copo com água deionizada corrente (DI) durante a noite ou por pelo menos 3 h.
    NOTA: Não use alvejante por mais de 2 h, pois isso gravará os adesivos nas paredes laterais, impedindo que a gelatina adira adequadamente.
  2. Sonicate os cavacos por 10 min e os selos de polidimetilsiloxano (PDMS, Sylgard 184) com características de ranhura de linha (largura de sulco de 25 μm, largura de sulco de 4 μm e profundidade de sulco de 5 μm) por 30 min em etanol limpo a 70%. Transfira as fichas e carimbos para uma área limpa sob um capuz e deixe-os secar sob o fluxo de ar por ~ 1-2 h.
  3. Pese 1 g de gelatina de pele suína (força do gel ~ 175 g Bloom, Tipo A) em um tubo de 50 mL. Adicione 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e misture bem para garantir a dissolução imediata da gelatina. Coloque o tubo em banho-maria a 65 °C por 30 minutos para completar o processo de dissolução. Da mesma forma, pesar 1 g de transglutaminase microbiana (MTG) em um tubo separado de 50 mL. Adicione 12,5 ml de PBS, misture bem e coloque o tubo num banho-maria a 37 °C durante 30 minutos para garantir a dissolução total do MTG.
  4. Sonicar o tubo de gelatina durante 15 min e, em seguida, voltar a colocá-lo em banho-maria a 65 °C antes de utilizar. Coloque o tubo MTG em um dessecador com a tampa ligeiramente solta e ligue o aspirador lentamente. Observe as bolhas sendo removidas da solução MTG sob vácuo. Após a desgaseificação, retorne o tubo MTG ao banho-maria a 37 °C.
    NOTA: Monitore o processo e ajuste o vácuo para evitar fervura vigorosa.
  5. Cubra uma folha de grade com parafilme limpo, coloque as fichas na grade e mantenha o carimbo por perto, pronto para uso. Adicione 5 mL de MTG aos 5 mL de solução de gelatina, pipetando cuidadosamente para evitar bolhas; em seguida, pipete rapidamente a gelatina no chip, usando o suficiente para cobrir a área do chip (aproximadamente 0,5 mL cada). Em seguida, coloque o carimbo PDMS22 com padrão de linha (largura da linha 25 μm, altura 5 μm, espaçamento 4 μm) no topo e aplique um peso de 200 g para garantir que a gelatina seja padronizada paralelamente ao eixo longitudinal do tecido. Depois que todos os chips estiverem moldados, cubra-os com uma jarra de vidro para evitar distúrbios ambientais e deixe-os reticular durante a noite.
    NOTA: Use a solução misturada de gelatina-MTG dentro de 5 min; caso contrário, o padrão alvo será alterado devido a um estado reticulado mais alto da gelatina.
  6. Transfira o chip e o sanduíche de carimbo PDMS para um novo prato P150 cheio de PBS e hidrate a gelatina por 30 min a 1 h para facilitar a separação do carimbo PDMS do chip. Remova qualquer excesso de gelatina não moldada ao redor do chip e transfira o chip limpo para um novo prato P150 cheio de PBS. Armazene os selos PDMS em etanol 70%.
  7. Esterilize os chips mergulhando-os em etanol por 10 min sob o capô.
    NOTA: Não exceda 10 min em etanol, pois uma exposição mais longa pode deformar a gelatina.
  8. Transfira as batatas fritas para PBS, deixe de molho por 10 min e enxágue 3x. Prepare as soluções de revestimento misturando 20 μg / mL de fibronectina com matriz de membrana basal diluída 1:100 em meio de cultura (aproximadamente 0,5 mL por poço). Cubra os cavacos por 2 h na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 ou a 4 °C durante a noite.
  9. Descongele e semeie células (8 ×10 5 hiPSC-CMs por cm2) em meio RPMI com Y-27632 (10 μM) e, em seguida, substitua-o por RPMI sem Y-27632 após 24 horas.
  10. Três dias após a semeadura celular, remova a fita branca usando uma pinça.

3. Síntese e aplicação do fototransdutor

NOTA: Ziapin2 foi sintetizado de acordo com um procedimento publicado anteriormente 16,18 e foi administrado a hiPSC-CMs diretamente no meio de cultura.

  1. Adicione 25 μM de Ziapin2 à cultura celular e incube a 37 °C e 5% de CO2 por 7 min.
  2. Lave suavemente o excesso de moléculas e enxágue com meio de cultura fresco.

4. Ensaio de viabilidade

NOTA: Alamar Blue é um ensaio à base de resazurina que pode permear as células e atuar como um indicador redox para monitorar a viabilidade celular. A resazurina se dissolve em tampões fisiológicos, resultando em uma solução azul profunda que é adicionada diretamente às células em cultura. Células viáveis com metabolismo ativo reduzem a resazurina a resofurina, que é rosa e fluorescente.

  1. Células da placa em uma placa de 96 poços previamente revestidas com 20 μg/mL de fibronectina e matriz de membrana basal diluída 1:100 em meio de cultura. Misture agitando e, em seguida, adicione Alamar Blue assepticamente a cada poço em uma quantidade igual a 10% do volume do poço.
  2. Incube culturas com Alamar Blue por 4 h.
  3. Trate as células com o fototransdutor e veículo (DMSO) conforme descrito anteriormente. Aplique estimulação de luz (luz pulsada de 1 Hz por 1 min) através de uma fibra óptica (ciano, 470 nm) para avaliar o efeito da internalização de Ziapin2 e exposição à luz na viabilidade de hiPSC-CM.
  4. Leia a fluorescência com um leitor de placas com excitação de 560 nm e emissão de 590 nm.

5. Avaliação da anisotropia do tecido cardíaco laminar projetada

NOTA: Este protocolo descreve uma abordagem sistemática para avaliar a anisotropia do tecido cardíaco laminar projetado usando imunocoloração, microscopia confocal e análise de núcleos27.

  1. Lave o substrato com PBS várias vezes antes da fixação com paraformaldeído a 4% (v/v) contendo 0,05% (v/v) de Triton X-100 em PBS por 10 min.
  2. Bloqueie a ligação não específica incubando amostras com albumina de soro bovino (BSA) a 5% (p / v) em PBS por 30 min.
  3. Incubar amostras com Hoechst (1:500) à temperatura ambiente durante 1 h.
  4. Lave com PBS antes de montar em lâminas de microscópio com um agente anti-desbotamento. Deixar secar as lâminas durante a noite e conservá-las a 4 °C até à obtenção de imagens.
  5. Amostras de imagens usando um microscópio confocal de disco giratório com ampliação de 20x. Determine a orientação das células usando o OrientationJ Measure28, um plug-in FiJi.

6. Gravações de mapeamento óptico

NOTA: O mapeamento óptico foi realizado após 5 dias em cultura em hiPSC-CMs semeados em chips de tecido moldados em gelatina.

  1. Para seguir este protocolo, certifique-se de que o aparelho de mapeamento óptico consiste em um microscópio de lente tandem modificado equipado com uma câmera de alta velocidade e a fonte de luz de excitação, uma lâmpada de mercúrio de 200 mW. Colocar um espelho dicróico à frente da câmara de imagem de Ca2+ designada para garantir que a preparação é exposta à luz de excitação e para recolher a fluorescência emitida proveniente da amostra.
  2. Incubar a amostra com 2 μM de X-Rhod 1 adicionados ao meio de cultura durante 30 min a 37 °C.
    NOTA: Exponha a amostra à luz apenas durante a aquisição da imagem para evitar o fotobranqueamento do corante.
  3. Incubar o fototradutor conforme descrito anteriormente na secção 3.
  4. Lave com meio de cultura fresco e transfira os chips para o meio RPMI 1640 sem vermelho de fenol suplementado com B27 menos insulina.
  5. Coloque as fichas de tecido em um prato com temperatura controlada e inicie as gravações em temperatura fisiológica (37 ° C), adquirindo imagens a uma taxa de quadros de 2,5 quadros / s.
  6. Para estimulação óptica, aplique a estimulação do ponto óptico em uma extremidade do tecido usando uma fonte de luz LED (465/25 nm) permitindo a estimulação do Ziapin2. Estimule os tecidos na frequência de 0.5 ou 1 Hz por meio de uma fibra óptica regulada temporalmente posicionada a 1 mm de distância do tecido. Para estimulação elétrica, aplique uma estimulação pontual usando um eletrodo de platina bipolar posicionado no centro da extremidade mais distal do tecido retangular. Esse posicionamento garante que a propagação da onda Ca2+ se origine do ponto médio da largura do tecido, que corresponde ao lado mais curto do retângulo. A estimulação deve ser aplicada na frequência de 0,5 Hz, com amplitude de 10 V e duração do pulso de 100 ms.
  7. Após as gravações, aplique um filtro espacial com um tamanho de pixel de 3 x 3 para melhorar a relação sinal-ruído.
  8. Determine a velocidade de condução da onda Ca2+ em cada pixel para cada pulso, calculando a taxa de mudança ao longo das direções x e y. Para fazer isso, meça o gradiente espacial da intensidade do sinal de Ca2+ nessas direções e relacione-o com o atraso de tempo de propagação do sinal. Ao combinar essas taxas de mudança direcional, quantifique a rapidez com que a onda viaja pelo campo celular em ambas as dimensões.

7. Exportação e tratamento de dados

  1. Extraia e analise os dados com o software referenciado.
  2. Aplique um filtro espacial de 3 x 3 pixels para melhorar a relação sinal-ruído.
  3. Extraia os traços de transientes de Ca2+ (CaT) como a média de uma região de interesse (ROI) específica selecionada manualmente.
  4. Meça os parâmetros CaT em uma região central de interesse (ROI) de 50 x 50 pixels (≈ 25 mm2).
  5. Para cada CaT, analise a amplitude do CaT, o tempo de subida(pico t), o tempo de inclinação máxima de decaimento (Max Decay Slope) e o tempo para 90% de decaimento transitório (Decay Time90).

8. Análise estatística

  1. Avaliar a normalidade da distribuição utilizando um teste estatístico adequado, como um teste de normalidade, para determinar se devem ser aplicados métodos paramétricos ou não paramétricos.
  2. Avalie a significância estatística entre duas condições usando o teste t de Student ou o teste U de Mann-Whitney para dados contínuos ou categóricos, respectivamente. Ao comparar mais de dois grupos, use ANOVA de uma via ou o teste de Kruskal-Wallis, dependendo das suposições dos dados, seguido por testes post-hoc apropriados para identificar diferenças significativas entre pares.

Resultados

Um processo de várias etapas foi desenvolvido e implementado para a fabricação de tecido cardíaco laminar projetado usando uma combinação de padronização a laser, moldagem de gelatina e técnicas de semeadura celular. Originalmente estabelecida por McCain et al.22 e Lee et al.24, essa técnica foi reimplementada, seguindo seus protocolos para construir os microtecidos laminares projetados. O processo integra padrões precisos basead...

Discussão

Essa abordagem fornece uma plataforma robusta para o avanço da pesquisa cardíaca, fornecendo insights sobre a complexa dinâmica do tecido cardíaco, abrindo novas possibilidades para estudos mecanísticos cardíacos in vitro de longo prazo que podem levar a novas estratégias terapêuticas. Para garantir o sucesso dessa metodologia, é crucial reproduzir um ambiente microfisiológico que mimetize de perto as condições in vivo do coração humano. Portanto, deve-se ...

Divulgações

CB, GL e FL são inventores da patente "COMPOSTOS FOTOCRÔMICOS" nº. 3802491 do Parlamento Europeu (02/07/2020).

Agradecimentos

Os autores agradecem a Michael Rosnach pelas ilustrações na Figura 1 e Figura 3, e ao Prof. William T. Pu pelo fornecimento de hiPSC. Este trabalho foi apoiado pelo NCATS Tissue Chips Consortium (UH3 TR003279) para KKP, o Ministério Italiano de Universidades e Pesquisa por meio do projeto PRIN 2022 (ID 2022-NAZ-0595) para FL, o projeto PRIN 2020 (ID 2020XBFEMS) para CB e GL, e o projeto Fondo Italiano per la Scienza (ID FIS00001244) para GL.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
alamarBlue Cell Viability ReagentThermo Fisher ScientificDAL1025Cell Viability Assay
B-27 Supplement, minus insulinThermo Fisher ScientificA1895601For cell culture
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9056-50GFor cell staining
BrainVision Analyzer software Brain Productshttps://www.brainproducts.com/downloads/analyzer/Data export and handling
BTSSigma203895-5MG
CHIR99021Stem Cell Technologies72054
Clear Scratch- and UV-Resistant Acrylic Sheet, 12" x 12" x 0.01 inchMcMaster Carr4076N11Tissue chip fabrication
Collagenase Type II WorthingtonCLS-2 / LS004176
DNase IIVWR89346-540
Essential 8 Medium Thermo Fisher ScientificA1517001For cell culture
FibronectinVWR47743-654Coating
Gelatin from porcine skin gel strength 175 Type ASigma-AldrichG2625-100GTissue chip fabrication
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixThermo Fisher ScientificA1413302Coating
HBSS Thermo Fisher14175-095
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630080
Hoechst 33342 Life technologiesH1399For cell staining
Insulin solution humanSigma AldrichI9278-5ML
IWR-1-endoStem Cell Technologies72564
Paraformadehyde 16% Aqueous Solution (PFA)VWR100503-917For cell staining
PBS, sterile, 500 mLThermo Fisher Scientific10010049Tissue chip fabrication
phosphate buffered salineThermo Fisher Scientific10010049
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)Thermo Fisher ScientificP3000MPNon-ionic surfactant
ROCK inhibitor Y-27632Stem Cell Technologies72304
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific61870127For cell culture
RPMI 1640 Medium, no phenol redThermo Fisher Scientific11835030Optical mapping
Versene SolutionThermo Fisher Scientific15040066chelating agent
VWR General-Purpose Laboratory Labeling TapeVWR89098-058Tissue chip fabrication
X-Rhod-1 AMThermo Fisher ScientificX14210Optical mapping

Referências

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