Los productos finales de glicación avanzada sensibilizan las células neuronales humanas sensoriales a la afluencia de calcio inducida por la capsaicina

Resumen

El aumento de los productos finales de glicación avanzada (AGE) derivados del colágeno se relaciona constantemente con enfermedades dolorosas. Aquí, investigamos si la glicación sensibiliza las neuronas sensoriales a la excitación de la capsaicina.

Resumen

El aumento de los productos finales de glicación avanzada (AGE) derivados del colágeno se relaciona constantemente con enfermedades dolorosas, como la osteoartritis, la neuropatía diabética y los trastornos neurodegenerativos. Las neuronas humanas de tipo sensorial diferenciadas de la línea celular SH-SY5Y obtienen funciones pronociceptivas cuando se exponen a AGEs mediante la liberación de la sustancia P y la regulación positiva de la expresión del receptor de potencial transitorio vaniloide 1 (TRPV1). Aquí, investigamos si este receptor era funcionalmente activo y si el proceso de glicación sensibiliza las neuronas sensoriales a la excitación de la capsaicina. Las células neuronales sensoriales se obtuvieron a partir de la diferenciación de las células SH-SY5Y con ácido trans-retinoico y factor neurotrófico derivado del cerebro. La incubación con matriz extracelular de colágeno glicosilado (ECM-GC) simuló un estímulo pronociceptivo. Las células control se incubaron con una matriz de colágeno extracelular no glicosilado (ECM-NC). Se utilizó el kit de ensayo de flujo de calcio Fluo-8 para evaluar la afluencia de calcio, que fue estimulada por la capsaicina. Los resultados muestran que la glicación aumenta la entrada de calcio en comparación con las células tratadas con colágeno normal, lo que sugiere que las neuronas sensoriales expresan canales TRPV1 funcionales y que la glicación aumenta la excitación de la capsaicina. Estos datos indican que las células neuronales sensoriales hipersensibles de AGE, desencadenan la señalización pronociceptiva. En conjunto, nuestros resultados sugieren que establecimos un modelo funcional que responde a la capsaicina que puede ser útil para la detección de candidatos para el manejo de afecciones dolorosas.

Introducción

La glicación es un proceso no enzimático, irreversible y espontáneo en el que las proteínas, como el colágeno, se unen a las moléculas de azúcar reductoras, lo que da lugar a productos finales de glicación avanzada (AGE). Los AGEs pueden activar los receptores de la membrana celular, desencadenando la activación de vías intracelulares, como la proteína quinasa 1/2 regulada por señales extracelulares (ERK), la proteína quinasa activada por mitógenos p38 (MAPK) y las quinasas n-terminal c-jun (JNKs), rho-GTPasas, fosfoinositol-3-quinasa (PI3K), Janus quinasa/transductor de señales y activador de la transcripción (JAK/STAT) y proteína quinasa C (PKC), aumentando la liberación de moléculas proinflamatorias y el estrés oxidativo¹. El colágeno glicosilado también perjudica la estructura y las propiedades de la matriz extracelular, y el aumento de los AGE derivados del colágeno se relaciona constantemente con enfermedades dolorosas, como la osteoartritis, la neuropatía diabética y los trastornos neurodegenerativos ^2,3.

Nuestro grupo demostró previamente que la línea celular SH-SY5Y se puede diferenciar en células neuronales sensoriales, ya que estas células expresan canales involucrados en la nocicepción, como los canales de sodio (Nav 1.7, Nav 1.8 y Nav 1.9) y el receptor de potencial transitorio vaniloide tipo 1 (TRPV1), marcadores que se encuentran típicamente en las neuronas sensoriales periféricas⁴. TRPV1 es un canal catiónico no selectivo permeable a los iones de calcio y sensible al estímulo de la capsaicina. Es importante destacar que cuando las células neuronales sensoriales se exponen a la matriz de colágeno glicosilado (ECM-GC), obtienen funciones pronociceptivas al aumentar la expresión de c-Fos, un factor de transcripción involucrado en la activación neuronal, y la liberación de la sustancia P, un neuropéptido ampliamente involucrado en la neuroinflamación y el dolor. Estas células responden a los analgésicos, como la morfina, el opiáceo prototipo, disminuyendo la liberación de la sustancia P inducida por ECM-GC. En conjunto, estos datos indican que este modelo responde a una molécula pro-nociceptiva y anti-nociceptiva ^4,5.

El seguimiento de los cambios en la concentración intracelular de^Ca2+ es esencial para estudiar numerosos procesos celulares. En las neuronas, puede ser una herramienta útil para predecir el daño neuronal y las propiedades neuroprotectoras de los fármacos. La capsaicina, el ingrediente activo picante de los chiles picantes, es el agonista más estudiado del receptor TRPV1 5 y una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos del dolor y detectar posibles nuevos analgésicos. Estudios previos demostraron que las neuronas sensoriales primarias de los ganglios de la raíz dorsal de roedores incubados con glucosa alta exhiben un aumento significativo en la afluencia de calcio inducida por la capsaicina⁶. Sin embargo, aún se desconoce si el canal TRPV1 fue funcionalmente activo en nuestro modelo celular y si el colágeno glicosilado sensibiliza a las células neuronales sensoriales a la excitación de la capsaicina, lo que puede activar las vías de señalización nociceptivas. Por lo tanto, nuestro objetivo era desarrollar un protocolo rentable que utilizara herramientas sencillas para la monitorización del calcio en tiempo real en células sensoriales y, al mismo tiempo, garantizara un análisis fiable. Aquí, proporcionamos un protocolo integral para ayudar a los investigadores a seguir los pasos para diferenciar las células SH-SY5Y en células neuronales sensoriales y cómo sensibilizarlas a los estímulos pronociceptivos. Este método puede contribuir al descubrimiento de nuevos compuestos analgésicos o neuroprotectores.

Protocolo

Cultivo y diferenciación de 1. SH-SY5Y en células neuronales sensoriales

NOTA 1: Todos los pasos presentes en esta sección deben realizarse bajo una campana de flujo laminar, y todas las soluciones y suministros deben ser estériles.

1. En primer lugar, prepare un matraz de cultivo (25^cm2) añadiendo 5 mL de medio de cultivo.
   NOTA: Para la descongelación, expansión y mantenimiento de este tipo de célula, utilice una mezcla de medio de cultivo: Medio de Águila y Ham F12 modificado con Dulbecco F12 (DMEM/F12) suplementado con un 10% de suero fetal bovino inactivado por calor y un 1% de penicilina-estreptomicina.
2. A continuación, retire el tubo criogénico que contiene las células SH-SY5Y del nitrógeno líquido y manténgalo en hielo. Descongele las células en un baño de agua a 37 °C durante 2 min.
3. Añadir 1 mL de medio de cultivo completo al criovial, transferir las células a un tubo de 15 mL, añadir 3 mL de medio de cultivo completo (DMEM/F12 suplementado con un 10% de suero fetal bovino inactivado por calor) y mezclar extrayéndolo repetidamente y dispensándolo de nuevo en el tubo con una pipeta.
4. Pipetear las células en el tubo de 15 ml y centrifugar a 290 g. Deseche el sobrenadante para eliminar el dimetilsulfóxido (DMSO), un agente crioprotector utilizado para prevenir la formación de cristales de hielo durante la congelación de las celdas.
5. Añadir 1 mL de medio de cultivo al pellet de células, mezclarlos bien con una pipeta y colocarlos en un matraz de^{cultivo de 25 cm2} para expandir las células. Coloque las células en una incubadora en una atmósfera humidificada de 5% de CO₂ a 37 °C.
   NOTA: Las celdas se pueden usar cuando alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia. Para la diferenciación neuronal, se recomienda utilizar células SH-SY5Y hasta el paso celular veinte.
6. Prepare la matriz de colágeno extracelular (100 μg/mL) diluyendo colágeno de cola de rata tipo I en PBS estéril y vierta 1 mL de esta solución en una placa de Petri (35/10 mm) para un recubrimiento.
7. Incubar en una incubadora en una atmósfera humidificada de 5% de_CO2 durante aproximadamente 1 h.
8. Después de este período, lave la placa dos veces con PBS estéril y luego cuente las células con la cámara de Neubauer.
9. Para contar las células, primero lave el matraz de cultivo de 25^cm2 que contiene la célula con 5 mL de PBS estéril para eliminar todo el medio de cultivo. A continuación, retire el PBS estéril, añada 3 ml de tripsina al 0,05% a las células y colóquelas en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ durante aproximadamente 3-5 minutos para completar el desprendimiento de la célula.
10. Después de eso, retire las células de la incubadora, agregue 6 mL de medio de cultivo al matraz de cultivo y transfiera esta solución a un tubo de 15 mL. Centrifugar a 290 g durante 5 min.
11. Retirar el sobrenadante y resuspender bien las células en 1 mL de medio de cultivo completo.
12. Por último, cuente las células con una cámara de recuento de Neubauer. Mezcle 20 μL de células y 20 μL de azul de tripano, y agregue 10 μL de esta mezcla a una cámara de Neubauer. Cuente las células vivas que no se manchan en azul.
13. Placa 5 × 10⁴ células/mL células en una placa de Petri (35/10 mm) en el mismo medio de cultivo descrito anteriormente. Utilice el volumen total de 1 ml por placa.
14. A continuación, espera 24 h para iniciar el protocolo de diferenciación neuronal. Para ello, retire el medio de cultivo y reemplácelo con 1 mL de DMEM/F12 suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor al 2%, penicilina-estreptomicina al 1% y 10 μM de ácido retinoico trans (RA 10 μM).
15. Espere 48 h y reemplace el medio de cultivo todos los días durante 3 días. Coloque las células en una incubadora en una atmósfera humidificada de 5% de CO₂ a 37 °C.
16. Al quinto día, retire el medio de las células y agregue 1 mL de medio de cultivo sin suero suplementado con factor neurotrófico derivado del cerebro humano (BDNF 50 ng/mL) en cada placa.
    NOTA: Se probó BDNF de diferentes empresas (ver tabla de materiales). Todos funcionaban de la misma manera.
17. En el séptimo día de diferenciación, lave las células con PBS estéril una vez y use células de neuronas similares a los sentidos para experimentos. Si es imposible usar estas células inmediatamente para experimentos, agregue un medio de cultivo sin suero para mantenerlas vivas hasta el uso.
    NOTA: Al final de la diferenciación neuronal, es necesario lavar las células con PBS estéril para eliminar el BDNF restante, evitando la toxicidad celular.

2. Colágeno glicosilado y proceso de glicación

NOTA: Todos los pasos de esta sección deben realizarse bajo una campana de flujo laminar, y todas las soluciones y suministros deben ser estériles.

1. Prepare la glicación del colágeno incubando colágeno tipo I a partir del estado fibrilar de la cola de rata (3,89 mg/mL) con 200 mM de D-ribosa, 160 mM de D-glucosa y 200 mM de D-treosa a 4 °C durante 7 días.
   NOTA: Para preparar colágeno glicosilado, pesa los azúcares en función de su peso molecular y mézclalos con colágeno tipo I procedente del estado fibrilar de cola de rata (3,89 mg/mL).
2. Incubar un cultivo de células neuronales sensoriales durante 24 h con matriz extracelular de colágeno glicosilado (ECM-GC, 100 μg/mL) o matriz extracelular de colágeno normal (ECM-NC, 100 μg/mL) preparada en medio de cultivo DMEM/F12 sin suplementación con suero y antibióticos.

3. Ensayo de afluencia de calcio

1. Para la afluencia de calcio, utilice el kit de ensayo de flujo de calcio y prepare las soluciones de acuerdo con las instrucciones del fabricante, como se indica a continuación.
2. Inicialmente, prepare 1 mL de carga de colorante Fluo-8 agregando 2 μL de solución madre Fluo-8 en 998 μL de tampón de ensayo 1x (una mezcla de tampón HBSS y 10x Pluronic F127 Plus.
   NOTA: Esta solución de trabajo es estable durante al menos 2 h a temperatura ambiente (RT).
3. Posteriormente, incubar 250 μL de esta solución en cada placa de células de neuronas sensoriales previamente diferenciadas y tratadas con ECM-NC o ECM-GC durante 30 min en una atmósfera humidificada de 5% CO₂ a 37 °C. Luego, retire la placa de la incubadora y manténgala a RT (en la oscuridad) durante 30 minutos.
   NOTA: Esta solución se vuelve citotóxica si se extrapola la incubación de 2 h. Prepare la solución de capsaicina durante el período de incubación.

4. Inducción de capsaicina

NOTA: La capsaicina, un agonista de TRPV1, se utilizó para inducir la afluencia de calcio en las células.

1. Pesar y diluir la capsaicina en etanol al 1% y agua ultrapura. A continuación, se preparó una solución a una concentración de 2 μM, que también se diluyó en agua ultrapura.
   NOTA: La solución de capsaicina debe prepararse el día de su uso. Diluir la capsaicina primero en etanol y luego en agua; de lo contrario, se precipitará.
2. Añadir 250 μL de solución de capsaicina de 2 μM a cada placa de Petri de 35/10 mm para que la concentración final sea de 1 μM.
   NOTA: La concentración de la solución madre de capsaicina fue de 2 μM para garantizar una mejor dispersión y evitar picos de fluorescencia aislados.

5. Imágenes de afluencia de calcio y análisis de microscopía confocal

NOTA: Las imágenes se realizaron en un microscopio confocal equipado con un objetivo de 20x/0,75NA y un láser de excitación de 488 nm (intensidad del 0,5%). La emisión se detectó a 520 nm. Las celdas se escanearon en ejes xy (512 x 512 píxeles) a lo largo del tiempo (t) a una velocidad de 600 Hz con un intervalo de adquisición de 433 ms y un tiempo total de adquisición de 5 min. Las imágenes se realizaron a 37 °C para mantener la condición fisiológica de las células utilizando el software de microscopía.

1. Prepare una jeringa con 250 μL de solución de capsaicina de 2 μM (la concentración final en la placa será de 1 μM) y conéctela a un juego de venas del cuero cabelludo - Butterfly tipo 23 GA estéril. Asegure la jeringa con un soporte de laboratorio y una pinza.
2. Coloque la placa de Petri en la etapa del microscopio y, con extrema precaución, coloque la aguja del cuero cabelludo en la placa de Petri, evitando el contacto con el fondo, la punta de la aguja no debe sumergirse en el líquido.
   NOTA: Se puede utilizar una cinta adhesiva para fijar la posición del cuero cabelludo.
3. Encuentre un campo con un número adecuado de celdas (más de 20) y ajuste el enfoque usando luz de campo brillante.
4. Inicie el modo Live con un láser de 488 nm y ajuste los parámetros de enfoque e iluminación.
5. Inicie el registro de adquisición y, después del período de referencia (t = 0 a t = 60 segundos), aplique 250 μL de 2 μM de capsaicina y empuje suavemente el émbolo de la jeringa para estimular la entrada de calcio en las células.
   NOTA: El tiempo final de adquisición de la grabación fue de aproximadamente 300 s por placa.

6. Post-procesamiento/análisis de datos

1. Realice el análisis de células utilizando el software de microscopía en el modo de cuantificación . En primer lugar, analice las células de la espícula de fluorescencia antes y después del estímulo de capsaicina.
2. Cree una región de interés (ROI) en cada célula que responda, es decir, células que muestren un pico de fluorescencia después de la capsaicina. Asegúrese de dibujar el ROI en toda el área de la celda, como se muestra arriba (Figura 1).
3. Exporte los datos en un archivo de valores separados por comas (CSV) para su posterior análisis.
4. Alternativamente, realice el análisis utilizando el software gratuito FIJI⁷ (https://fiji.sc).
   1. Para abrir los archivos de imagen, utilice el plugin Bio-Formats navegando hasta Archivo > Importar > Bio-Formatos y seleccionando el archivo.
5. A continuación, utilice la herramienta Lupa para acercar y la herramienta Selección a mano alzada para dibujar una región de interés (ROI) alrededor de las celdas responsivas.
6. Después de dibujar cada ROI, presione la tecla T para agregarlo al Administrador de ROI. Repita este proceso para todas las celdas de interés (Figura 2).
7. Una vez que se agreguen todos los ROI, vaya a la ventana Administrador de ROI , seleccione todos los ROI y luego navegue hasta Analizar > establecer mediciones en el menú principal.
8. A continuación, vuelve al Administrador de ROI y selecciona Más > Multi Measure para medir la intensidad en todos los fotogramas. Los resultados aparecerán en una nueva ventana; exporte como un archivo CSV yendo a Archivo > Guardar como.
   NOTA: El archivo CSV se puede analizar en el software Excel, Google Sheets y GraphPad. Utilice la ecuación ΔF/F₀ = (F(t) - F₀)/F₀ para convertir los valores de intensidad de fluorescencia obtenidos con el kit de ensayo de flujo de calcio Fluo-8 en una medida relativa del cambio de afluencia de calcio. Aquí, F₀ representa la fluorescencia basal, calculada como la intensidad media de las imágenes capturadas desde t = 0 s hasta t = 60 s antes de la estimulación con capsaicina. F(t) es el valor de la intensidad máxima de fluorescencia observada después del estímulo, lo que permite evaluar el flujo máximo de calcio. Este enfoque destaca el aumento de la fluorescencia en relación con la línea de base, donde un aumento en ΔF/F₀ indica un nivel elevado de calcio intracelular.

Figura 1: Ejemplo de ROI en las celdas seleccionadas para el análisis de afluencia de calcio en el software LAS X. (A) Interfaz LAS X en modo de cuantificación. El rectángulo rosa muestra la pestaña de cuantificación. El rectángulo amarillo muestra la herramienta de dibujo de polilínea, y el rectángulo cian muestra las herramientas de alejamiento y acercamiento. (B) Campo de visión (FOV) capturado. (C) Acérquese al campo de visión para facilitar el dibujo del ROI en toda la celda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ejemplo de ROI en las celdas seleccionadas para el análisis de afluencia de calcio en el software FIJI. (A) Interfaz FIJI que muestra el menú principal y la herramienta. El cuadrado rojo muestra la herramienta de lupa y el cuadrado verde muestra la selección a mano alzada. (B) Campo de visión (FOV) capturado con zoom y un ROI dibujado. (C) La ventana del administrador de ROI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Solución de problemas

1. Si la imagen está desenfocada, pruebe lo siguiente:
   1. Compruebe la adherencia de la cinta; Si se ha aflojado, esto puede hacer que la aguja se desplace y afecte el enfoque.
   2. Vuelva a colocar la aguja con cinta adhesiva adicional para aumentar la estabilidad.
   3. Sustitución de agujas estándar. Utilice las puntas de las agujas dentales predobladas para mejorar la alineación en la placa.
2. Si las células muestran una señal saturada, pruebe los siguientes pasos:
   1. Disminuya la intensidad del láser y los ajustes de ganancia.
   2. Verifique el tiempo de incubación de los reactivos. Si excede las recomendaciones del fabricante, puede provocar saturación de la señal, lo que complica la detección de la afluencia de calcio.
3. Siga estas sugerencias adicionales para solucionar problemas:
   1. Calibración regular: Asegúrese de que el equipo de imágenes se calibra regularmente para mantener la calidad del enfoque y la detección de señales.
   2. Documente los cambios: Mantenga un registro de los ajustes realizados en el protocolo para futuras referencias y para facilitar la resolución de problemas.
   3. Ajustes reactivos: Si los problemas persisten, considere la posibilidad de realizar pruebas con diferentes concentraciones de reactivos o métodos alternativos de detección de señales.

Resultados

Diferenciación de las células SH-SY5Y en neurona sensorial
Las imágenes de cribado de alto contenido demuestran que el protocolo de diferenciación neuronal cambia la morfología de las células SH-SY5Y. Las células neuronales sensoriales (células diferenciadas) muestran un cuerpo celular redondeado que proyecta una extensa red de neurofilamentos. Forman ramas de proyecciones de neuritas más alargadas que conectan las neuronas circundantes, lo que es consistente...

Discusión

Los nociceptores son subconjuntos especializados de neuronas sensoriales que median el dolor. Estas células expresan canales iónicos dependientes de voltaje y ligandos, como TRPV1, cuya activación conduce a la afluencia de calcio y la liberación de neuropéptidos y neurotransmisores que regulan la transmisión nociceptiva. Aquí, describimos un protocolo para diferenciar SH-SY5Y en células neuronales sensoriales para evaluar la afluencia de calcio inducida por capsaicina

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
All-trans retinoic acid	Tocris	695
BDNF	Tocris	TOCR-2837
BDNF	Sigma-Aldrich	B3795
Butterfly type 23GA sterile	Beckton Dickinson Asepto	38833814	Scalp vein set
Capsaicin	Sigma-Aldrich	M2028
D-glucose	Sigma-Aldrich	G5767
DMEM/F12	Gibco	12500062	Basal medium
D-ribose	Sigma-Aldrich	R7500
D-threose	Sigma-Aldrich	T7392
Fluo-8 Calcium Flux Assay Kit	Abcam	ab112129	No wash
Heat-inactivated fetal bovine serum	Gibco	A5670801
High Content Screening	Molecular Devices
LASX software	Leica Microsystems		Microscopy software
Leica TCS SP8	Leica Microsystems	Leica TCS SP8	Confocal microscope
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140130
Petri dish (35/10 mm)	Greiner bio-one	627965
Rat tail type I collagen	Corning	354236
SH-SY5Y	Merck	94030304-1VL	Neuroblastoma cell line