A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
תוצרי גליקציה מתקדמים מוגברים שמקורם בקולגן (AGEs) קשורים באופן עקבי למחלות כואבות. כאן, חקרנו אם גליקציה מרגישה נוירונים חושיים לעירור קפסאיצין.
תוצרי גליקציה מתקדמים מוגברים שמקורם בקולגן נקשרים באופן עקבי למחלות כואבות, כולל דלקת מפרקים ניוונית, נוירופתיה סוכרתית והפרעות ניווניות. נוירונים דמויי חושים אנושיים המובחנים מקו התאים SH-SY5Y משיגים פונקציות פרו-נוסיספטיביות כאשר הם נחשפים ל-AGEs על ידי שחרור חומר P וויסות ביטוי פוטנציאלי לקולטן חולף ונילואיד 1 (TRPV1). כאן, חקרנו אם קולטן זה היה פעיל מבחינה תפקודית והאם תהליך הגליקציה רגיש לנוירונים חושיים לעירור קפסאיצין. תאי עצב דמויי תחושה התקבלו מהתמיינות של תאי SH-SY5Y עם חומצה טרנס-רטינואית וגורם נוירוטרופי שמקורו במוח. דגירה עם מטריצה חוץ-תאית של קולגן מסוכרר (ECM-GC) דימתה גירוי פרו-נוציספטיבי. תאי הביקורת הודגרו עם מטריצת קולגן חוץ-תאית לא מסוכררת (ECM-NC). ערכת בדיקת שטף הסידן Fluo-8 שימשה להערכת זרם הסידן, שעורר על ידי קפסאיצין. התוצאות מראות כי גליקציה מגבירה את זרם הסידן בהשוואה לתאים שטופלו בקולגן רגיל, מה שמצביע על כך שתאי עצב דמויי חוש מבטאים תעלות TRPV1 פונקציונליות וכי גליקציה מגבירה את עירור הקפסאיצין. נתונים אלה מצביעים על תאי עצב דמויי חוש רגישים יתר על המידה של AGE, המפעילים איתות פרו-נוסיספטיבי. יחד, התוצאות שלנו מצביעות על כך שיצרנו מודל פונקציונלי המגיב לקפסאיצין שיכול להיות שימושי לסינון מועמדים לניהול מצבים כואבים.
גליקציה היא תהליך לא אנזימטי, בלתי הפיך וספונטני שבו חלבונים, כגון קולגן, נקשרים למולקולות סוכר מפחיתות, וכתוצאה מכך תוצרי קצה מתקדמים של גליקציה (AGEs). AGEs עשויים להפעיל קולטני ממברנה תאית, ולהפעיל מסלולים תוך-תאיים, כגון חלבון קינאז מווסת אותות חוץ-תאיים (ERK) 1/2, p38 חלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן (MAPK), וקינאזות c-jun n-terminal (JNKs), rho-GTPases, פוספואינוזיטול-3-קינאז (PI3K), ג'אנוס קינאז/מתמר אותות ומפעיל שעתוק (JAK/STAT), וחלבון קינאז C (PKC), מגביר את שחרור המולקולות הפרו-דלקתיות ומתח חמצוני1. קולגן מסוכרר פוגע גם במבנה ובתכונות של המטריצה החוץ-תאית, ועלייה ב-AGEs שמקורם בקולגן נקשרת באופן עקבי למחלות כואבות, כולל דלקת מפרקים ניוונית, נוירופתיה סוכרתית והפרעות ניווניות 2,3.
קבוצתנו הדגימה בעבר כי ניתן להתמיין בקו התאים SH-SY5Y לתאי עצב דמויי חוש מכיוון שתאים אלה מבטאים תעלות המעורבות בנוסיספציה, כגון תעלות נתרן (Nav 1.7, Nav 1.8 ו-Nav 1.9) וקולטן חולף פוטנציאלי ונילואיד מסוג 1 (TRPV1), סמנים הנמצאים בדרך כלל בתאי עצב חושיים היקפיים4. TRPV1 הוא תעלת קטיון לא סלקטיבית, חדירה ליוני סידן ורגישה לגירוי קפסאיצין. חשוב לציין, כאשר תאי העצב דמויי התחושה נחשפים למטריצת קולגן מסוכררת (ECM-GC), הם משיגים פונקציות פרו-נוציספטיביות על ידי הגברת ביטוי c-Fos, גורם שעתוק המעורב בהפעלה עצבית, ושחרור חומר P, נוירופפטיד המעורב באופן נרחב בדלקת עצבית וכאב. תאים אלה מגיבים למשככי כאבים, כגון מורפיום, אב הטיפוס של אופיאטים, ומפחיתים את שחרור החומר P המושרה על ידי ECM-GC. יחד, נתונים אלה מצביעים על כך שמודל זה מגיב למולקולה פרו-ואנטי-נוציספטיבית 4,5.
ניטור שינויים בריכוז Ca2+ תוך תאיים חיוני לחקר תהליכים תאיים רבים. בתאי עצב, זה יכול להיות כלי שימושי לחיזוי נזק עצבי ותכונות נוירו-פרוטקטיביות של תרופות. קפסאיצין, המרכיב הפעיל החריף של פלפל צ'ילי חריף, הוא האגוניסט הנחקר ביותר של קולטן TRPV15 וכלי רב ערך לחקר מנגנוני הכאב ולסינון משככי כאבים פוטנציאליים חדשים. מחקרים קודמים הראו כי נוירונים חושיים ראשוניים מגרעיני השורש הגבי של מכרסמים שהודגרו עם גלוקוז גבוה מציגים עלייה משמעותית בזרם הסידן המושרה על ידי קפסאיצין6. עם זאת, לא ידוע אם ערוץ TRPV1 היה פעיל מבחינה תפקודית במודל התאים שלנו והאם הקולגן המסוכרר רגיש לתאי עצב דמויי תחושה לעירור קפסאיצין, שעשוי להפעיל מסלולי איתות נוסיספטיביים. לכן, שאפנו לפתח פרוטוקול חסכוני המשתמש בכלים פשוטים לניטור סידן בזמן אמת בתאים דמויי חישה תוך הקפדה על ניתוח אמין. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מקיף המסייע לחוקרים לעבור את השלבים להתמיינות תאי SH-SY5Y בתאי עצב דמויי תחושה, וכיצד לעורר בהם רגישות לגירויים פרו-נוציספטיביים. שיטה זו יכולה לתרום לגילוי תרכובות משככות כאבים או נוירו-פרוטקטיביות חדשות.
תרבית 1. SH-SY5Y והתמיינות לתאי עצב דמויי חישה
הערה 1: כל השלבים הקיימים בסעיף זה צריכים להיעשות מתחת למכסה זרימה למינר, וכל הפתרונות והאספקה צריכים להיות סטריליים.
2. קולגן מסוכרר ותהליך גליקציה
הערה: כל השלבים בסעיף זה חייבים להיעשות מתחת למכסה זרימה למינר, וכל הפתרונות והאספקה חייבים להיות סטריליים.
3. בדיקת זרם סידן
4. אינדוקציה של קפסאיצין
הערה: קפסאיצין, אגוניסט TRPV1, שימש להשראת זרימת סידן בתאים.
5. הדמיית זרם סידן וניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית
הערה: ההדמיה בוצעה במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד באובייקט 20x/0.75NA ובלייזר עירור 488 ננומטר (עוצמה של 0.5%). הפליטה זוהתה ב-520 ננומטר. התאים נסרקו בצירי xy (512 x 512 פיקסלים) לאורך זמן (t) במהירות של 600 הרץ עם מרווח רכישה של 433 אלפיות השנייה וזמן רכישה כולל של 5 דקות. ההדמיה בוצעה ב-37 מעלות צלזיוס כדי לשמור על מצבם הפיזיולוגי של התאים באמצעות תוכנת המיקרוסקופיה.
6. עיבוד לאחר / ניתוח נתונים
איור 1: דוגמה להחזר ROI בתאים שנבחרו עבור ניתוח זרם סידן בתוכנת LAS X. (A) ממשק LAS X במצב כמות. המלבן הוורוד מציג את לשונית הכימות. המלבן הצהוב מציג את הכלי ציור פולי-קווים, ומלבן הציאן מציג את כלי התצוגה וההתקרבות. (B) שדה ראייה (FOV) שנלכד. (C) התקרב ל-FOV כדי להקל על ציור החזר ה-ROI בתא כולו. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דוגמה להחזר ROI בתאים שנבחרו עבור ניתוח זרם סידן בתוכנת FIJI. (A) ממשק FIJI המציג את התפריט הראשי והכלי. הריבוע האדום מציג את הכלי זכוכית מגדלת, והריבוע הירוק מציג את הבחירה ביד חופשית. (B) שדה ראייה (FOV) שצולם עם זום אין והחזר ROI מצויר. (ג) חלון מנהל ההחזר על ההשקעה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
7. פתרון בעיות
התמיינות תאי SH-SY5Y לנוירון דמוי חושי
תמונות הקרנה בעלות תוכן גבוה מדגימות כי פרוטוקול ההתמיינות העצבית משנה את המורפולוגיה של תאי SH-SY5Y. תאי העצב דמויי החישה (תאים מובחנים) מציגים גוף תאים מעוגל שמקרין רשת נרחבת של נוירופילמנטים. הם יוצרים ענפים של הקרנות נויריט...
קולטני כאב הם תת-קבוצות מיוחדות של נוירונים חושיים המתווכים כאב. תאים אלה מבטאים תעלות יונים מגודרות מתח וליגנד, כגון TRPV1, שהפעלתן מובילה לזרם סידן ולשחרור נוירופפטידים ונוירוטרנסמיטורים המווסתים את ההעברה הנוסיספטיבית. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להבדיל SH-SY5Y לתאי עצב דמו?...
MCB, AMCT ו-VOZ מחזיקים בפטנט על תהליך זיהוי ישויות מולקולריות המעורבות בכאבי דלקת מפרקים ניוונית (BR102018008561-1).
עבודה זו נתמכה על ידי Fundação Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo FAPESP Grant Number 2015/50040-4 ו-2020/13139-0, קרן המחקר של סאו פאולו ו-GlaxoSmithKline, FAPESP 2022/08417-7 ו-2024/04023-0.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
All-trans retinoic acid | Tocris | 695 | |
BDNF | Tocris | TOCR-2837 | |
BDNF | Sigma-Aldrich | B3795 | |
Butterfly type 23GA sterile | Beckton Dickinson Asepto | 38833814 | Scalp vein set |
Capsaicin | Sigma-Aldrich | M2028 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
DMEM/F12 | Gibco | 12500062 | Basal medium |
D-ribose | Sigma-Aldrich | R7500 | |
D-threose | Sigma-Aldrich | T7392 | |
Fluo-8 Calcium Flux Assay Kit | Abcam | ab112129 | No wash |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | A5670801 | |
High Content Screening | Molecular Devices | ||
LASX software | Leica Microsystems | Microscopy software | |
Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 | Confocal microscope |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
Petri dish (35/10 mm) | Greiner bio-one | 627965 | |
Rat tail type I collagen | Corning | 354236 | |
SH-SY5Y | Merck | 94030304-1VL | Neuroblastoma cell line |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved