Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Artan kollajen türevli ileri glikasyon son ürünleri (AGE'ler) sürekli olarak ağrılı hastalıklarla bağlantılıdır. Burada, glikasyonun duyusal nöronları kapsaisin uyarımına duyarlı hale getirip getirmediğini araştırdık.
Artan kollajen kaynaklı ileri glikasyon son ürünleri (AGE'ler) sürekli olarak osteoartrit, diyabetik nöropati ve nörodejeneratif bozukluklar dahil olmak üzere ağrılı hastalıklarla bağlantılıdır. SH-SY5Y hücre hattından farklılaşan insan duyu benzeri nöronlar, P maddesini serbest bırakarak ve geçici reseptör potansiyeli vanilloid 1 (TRPV1) ekspresyonunu yukarı regüle ederek AGE'lere maruz kaldıklarında pro-nosiseptif işlevler kazanırlar. Burada, bu reseptörün fonksiyonel olarak aktif olup olmadığını ve glikasyon işleminin duyusal nöronları kapsaisin uyarımına duyarlı hale getirip getirmediğini araştırdık. Duyusal benzeri nöron hücreleri, SH-SY5Y hücrelerinin all-trans-retinoik asit ve beyin kaynaklı nörotrofik faktör ile farklılaşmasından elde edildi. Glikasyonlu kollajen hücre dışı matriks (ECM-GC) ile inkübasyon, pro-nosiseptif bir uyaranı simüle etti. Kontrol hücreleri, glikasyona uğramamış hücre dışı kollajen matriksi (ECM-NC) ile inkübe edildi. Kapsaisin tarafından uyarılan kalsiyum akışını değerlendirmek için Fluo-8 Kalsiyum Akısı Test Kiti kullanıldı. Sonuçlar, glikasyonun normal kollajen ile tedavi edilen hücrelere kıyasla kalsiyum akışını artırdığını göstermektedir, bu da duyusal benzeri nöronların fonksiyonel TRPV1 kanallarını eksprese ettiğini ve glikasyonun kapsaisin uyarımını arttırdığını düşündürmektedir. Bu veriler, AGE'nin aşırı duyarlı duyu benzeri nöron hücrelerini gösterir ve pro-nosiseptif sinyalizasyonu tetikler. Birlikte, sonuçlarımız, ağrılı durumları yönetmek için adayları taramak için yararlı olabilecek kapsaisine yanıt veren fonksiyonel bir model oluşturduğumuzu göstermektedir.
Glikasyon, kollajen gibi proteinlerin indirgeyici şeker moleküllerine bağlanarak ileri glikasyon son ürünleri (AGE'ler) ile sonuçlandığı enzimatik olmayan, geri dönüşü olmayan ve spontan bir süreçtir. AGE'ler, hücre dışı sinyal regüle protein kinaz (ERK) 1/2, p38 mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) ve c-jun n-terminal kinazlar (JNK'ler), rho-GTPazlar, fosfoinositol-3-kinaz (PI3K), Janus kinaz / sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörü (JAK / STAT) ve protein kinaz C (PKC) gibi hücre içi yolların aktivasyonunu tetikleyerek hücresel zar reseptörlerini aktive edebilir, proinflamatuar moleküllerin salınımını ve oksidatif stresi artırabilir1. Glikasyonlu kollajen ayrıca hücre dışı matrisin yapısını ve özelliklerini bozar ve artan kollajen türevli AGE'ler sürekli olarak osteoartrit, diyabetik nöropati ve nörodejeneratif bozukluklar dahil olmak üzere ağrılı hastalıklarla bağlantılıdır 2,3.
Grubumuz daha önce SH-SY5Y hücre hattının, duyusal benzeri nöron hücrelerine farklılaşabileceğini göstermiştir, çünkü bu hücreler, sodyum kanalları (Nav 1.7, Nav 1.8 ve Nav 1.9) ve geçici reseptör potansiyeli vanilloid tip 1 (TRPV1) gibi nosisepsiyonda yer alan kanalları eksprese eder, tipik olarak periferik duyusal nöronlardabulunan belirteçler 4. TRPV1, kalsiyum iyonlarına geçirgen ve kapsaisin uyaranına duyarlı, seçici olmayan bir katyon kanalıdır. Daha da önemlisi, duyusal benzeri nöron hücreleri glikasyonlu kollajen matrisine (ECM-GC) maruz kaldıklarında, nöronal aktivasyonda yer alan bir transkripsiyon faktörü olan c-Fos ekspresyonunu ve nöroinflamasyon ve ağrıda yaygın olarak yer alan bir nöropeptit olan P maddesi salınımını artırarak pro-nosiseptif işlevler kazanırlar. Bu hücreler, morfin, prototip opiat gibi analjeziklere yanıt vererek ECM-GC'nin neden olduğu madde P salınımını azaltır. Birlikte, bu veriler bu modelin pro ve anti-nosiseptif bir moleküle(4,5) duyarlı olduğunu göstermektedir.
Hücre içi Ca2+ konsantrasyon değişikliklerinin izlenmesi, çok sayıda hücresel süreci incelemek için gereklidir. Nöronlarda, nöronal hasarı ve ilaçların nöroprotektif özelliklerini tahmin etmek için yararlı bir araç olabilir. Acı biberlerin keskin aktif bileşeni olan kapsaisin, TRPV1 reseptörü5'in en çok çalışılan agonistidir ve ağrı mekanizmalarını incelemek ve potansiyel yeni analjezikleri taramak için değerli bir araçtır. Önceki çalışmalar, yüksek glikoz ile inkübe edilen kemirgenlerin dorsal kök gangliyonlarından elde edilen birincil duyusal nöronların, kapsaisin kaynaklı kalsiyum akışında önemli bir artış gösterdiğini göstermiştir6. Bununla birlikte, TRPV1 kanalının hücre modelimizde işlevsel olarak aktif olup olmadığı ve glikasyonlu kollajenin duyusal benzeri nöron hücrelerini, nosiseptif sinyal yollarını aktive edebilen kapsaisin uyarımına duyarlı hale getirip getirmediği bilinmemektedir. Bu nedenle, güvenilir analiz sağlarken duyusal benzeri hücrelerde gerçek zamanlı kalsiyum izleme için basit araçlar kullanan uygun maliyetli bir protokol geliştirmeyi amaçladık. Burada, araştırmacıların duyusal benzeri nöron hücrelerindeki SH-SY5Y hücrelerini ayırt etme adımlarından geçmelerine ve bunları pro-nosiseptif uyaranlara nasıl duyarlı hale getireceklerine yardımcı olmak için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, yeni analjezik veya nöroprotektif bileşiklerin keşfine katkıda bulunabilir.
1. SH-SY5Y kültürü ve duyu benzeri nöron hücrelerine farklılaşma
NOT 1: Bu bölümde yer alan tüm adımların laminer akış başlığı altında yapılması ve tüm solüsyonların ve sarf malzemelerinin steril olması gerekir.
2. Glikasyonlu kollajen ve glikasyon süreci
NOT: Bu bölümdeki tüm adımlar laminer akış başlığı altında yapılmalı ve tüm solüsyonlar ve sarf malzemeleri steril olmalıdır.
3. Kalsiyum akışı testi
4. Kapsaisin indüksiyonu
NOT: Bir TRPV1 agonisti olan kapsaisin, hücrelerde kalsiyum akışını indüklemek için kullanıldı.
5. Kalsiyum akışı görüntüleme ve konfokal mikroskopi analizi
NOT: Görüntüleme, 20x/0.75NA objektif ve 488 nm uyarma lazeri (%0.5 yoğunluk) ile donatılmış konfokal mikroskopta gerçekleştirildi. Emisyon 520 nm'de tespit edildi. Hücreler, xy eksenlerinde (512 x 512 piksel) zaman içinde (t) 600 Hz hızında, 433 ms'lik bir edinme aralığı ve toplam 5 dakikalık bir edinme süresi ile tarandı. Mikroskopi yazılımı kullanılarak hücrelerin fizyolojik durumunu korumak için görüntüleme 37 °C'de yapıldı.
6. İşlem sonrası/veri analizi
Şekil 1: LAS X yazılımında kalsiyum akışı analizi için seçilen hücrelerdeki ROI örneği. (A) Niceleme modunda LAS X arayüzü. Pembe dikdörtgen, niceleme sekmesini gösterir. Sarı dikdörtgen çoklu çizgi çizme aracını, camgöbeği dikdörtgen ise uzaklaştırma ve yakınlaştırma araçlarını gösterir. (B) Görüş alanı (FOV) yakalandı. (C) Tüm hücrede ROI çizimini kolaylaştırmak için FOV'u yakınlaştırın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: FIJI yazılımında kalsiyum akışı analizi için seçilen hücrelerdeki ROI örneği. (A) Ana menüyü ve aracı gösteren FIJI arayüzü. Kırmızı kare büyüteç aracını, yeşil kare ise Serbest El seçimini gösterir. (B) Yakınlaştırma ve çizilmiş bir ROI ile yakalanan görüş alanı (FOV). (C) ROI yöneticisi penceresi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
7. Sorun Giderme
SH-SY5Y hücrelerinin duyu benzeri nörona farklılaşması
Yüksek içerikli tarama görüntüleri, nöronal farklılaşma protokolünün SH-SY5Y hücre morfolojisini değiştirdiğini göstermektedir. Duyusal benzeri nöron hücreleri (farklılaşmış hücreler), geniş bir nörofilament ağını yansıtan yuvarlak bir hücre gövdesi sergiler. Olgun nöron özellikleriyle tutarlı olan çevredeki nöronları birbirine bağlayan daha uzun nörit çıkıntılarını...
Nosiseptörler, ağrıya aracılık eden duyusal nöronların özel alt kümeleridir. Bu hücreler, aktivasyonu kalsiyum akışına ve nosiseptif iletimi düzenleyen nöropeptitlerin ve nörotransmiterlerin salınmasına yol açan TRPV1 gibi voltaj kapılı ve ligand iyon kanallarını eksprese eder. Burada, kapsaisin kaynaklı kalsiyum akışınıdeğerlendirmek için SH-SY5Y'yi duyu benzeri nöron hücrelerine ayırmak için bir protokol açıklıyoruz 8,9<...
MCB, AMCT ve VOZ, osteoartrit ağrısında (BR102018008561-1) yer alan moleküler varlıkların tanımlanması sürecinde bir patente sahiptir.
Bu çalışma, 2015/50040-4 ve 2020/13139-0 numaralı Fundação Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo FAPESP Hibe numarası, São Paulo Araştırma Vakfı ve GlaxoSmithKline, FAPESP 2022/08417-7 ve 2024/04023-0 tarafından desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
All-trans retinoic acid | Tocris | 695 | |
BDNF | Tocris | TOCR-2837 | |
BDNF | Sigma-Aldrich | B3795 | |
Butterfly type 23GA sterile | Beckton Dickinson Asepto | 38833814 | Scalp vein set |
Capsaicin | Sigma-Aldrich | M2028 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
DMEM/F12 | Gibco | 12500062 | Basal medium |
D-ribose | Sigma-Aldrich | R7500 | |
D-threose | Sigma-Aldrich | T7392 | |
Fluo-8 Calcium Flux Assay Kit | Abcam | ab112129 | No wash |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | A5670801 | |
High Content Screening | Molecular Devices | ||
LASX software | Leica Microsystems | Microscopy software | |
Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 | Confocal microscope |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
Petri dish (35/10 mm) | Greiner bio-one | 627965 | |
Rat tail type I collagen | Corning | 354236 | |
SH-SY5Y | Merck | 94030304-1VL | Neuroblastoma cell line |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır