Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Resumen

Este video muestra la técnica de microinyección en la gónada de C. elegans para crear animales transgénicos.

Resumen

Transgénicos Caenorhabditis elegans pueden ser fácilmente creados a través de la microinyección de una solución de ADN plásmido en la gónada ^1. El ADN del plásmido se reorganiza para formar concatamers extracromosómico que son heredados de forma estable, aunque no con la misma eficacia que los cromosomas actual ^2. Un gen de interés es co-inyectados con un marcador fenotípico obvias, tales como rol-6 o las buenas prácticas agrarias, para permitir la selección de animales transgénicos con un microscopio de disección. El gen exógeno se puede expresar a partir de su promotor nativo para los estudios de localización celular. Por otra parte, el transgén puede ser impulsado por un promotor de diferentes tejidos específicos para evaluar la función del producto del gen en esa célula o tejido en particular. Esta técnica de manera eficiente las unidades de la expresión génica en todos los tejidos de C. elegans, excepto para el embrión o principios de la línea germinal ^3. La creación de animales transgénicos es ampliamente utilizado para una variedad de paradigmas experimentales. Este video muestra el procedimiento de microinyección para generar gusanos transgénicos. Además, la selección y mantenimiento de líneas transgénicas estables C. elegans se describe.

Protocolo

Plásmido de expresión de construcción

Dos plásmidos son necesarios: una para la expresión específica de tejido del gen de interés y un segundo como marcador de transformación seleccionables.

Experimental plásmido

1. Seleccione un promotor que se expresa en el tipo de tejidos / células de interés, por ejemplo, un nervio o músculo promotor específico. Si se va a expresar múltiples genes dentro del mismo tejido, un cassette promotor plásmido en el sistema de puerta de enlace (Invitrogen) se puede utilizar. Este enfoque permite la inserción de un gen de interés aguas abajo del promotor de ⁴ clonación de ^{recombinación.} En general, 2-5 kb de secuencias de aguas arriba es suficiente para tener una expresión correcta y exacta.
   
   
2. El cDNA del gen de interés puede ser clonado en dos formas:
   1. Clonación convencional con enzimas de restricción.
   2. Para la clonación de puerta de enlace, que es amplificada por PCR utilizando los cebadores que contienen la puerta de enlace att secuencia B de recombinación. El cDNA amplificado se recombinan en la primera pDONR201 vector de donantes para crear el vector de entrada y luego se transformó en E. coli cepa DH5a. Después de la selección de recombinantes éxito y mini-prep aislamiento de ADN, el vector de entrada se recombina en el vector destino promotor que contiene para crear el plásmido de expresión. Detalles sobre la clonación de recombinación están disponibles, ya sea el manual de Invitrogen Gateway o en Caldwell et al. ^5.

Marcador seleccionable plásmido

Ejemplos de plásmidos marcador transgénicos incluyen rol-6 o el uso del promotor de la pared muscular del cuerpo unc-54 para dirigir la expresión de proteínas fluorescentes. Estos plásmidos marcadores suelen estar disponibles dentro de la comunidad de investigación bajo pedido.

Microinyección de C. elegans

Preparación

1. Realizar el aislamiento del ADN de los dos plásmidos que se van a inyectar. Cuantificar ellos y se mezclan en una proporción de 1:1 de 50 ng / l cada uno.
   
   
2. Preparar pastillas de agar:
   1. Haga una solución al 2% de agarosa en el agua, el calor o en el microondas hasta que se disuelva.
   2. Establecido varios 22 x 50 mm cubreobjetos en una mesa de trabajo.
   3. Con una pipeta Pasteur, se coloca una gota de la agarosa derretida en una cubierta de vidrio y colocar inmediatamente una tapa de vidrio segundo a través de la caída en un ángulo de 90 a la primera. Repita este procedimiento para varios vasos de las demás. El diámetro del disco aplanado de agarosa debe estar entre 15-20 mm.
   4. Después de la agarosa se ha solidificado (esto sólo se tarda un minuto), retire la tapa de vidrio y deje que el cojín de aire seco por completo (varias horas o toda la noche).
   5. Tienda de las pastillas en una caja cubierta de vidrio a temperatura ambiente.
      
      
3. Hacer cargadores aguja para solución de ADN:
   
   Cargadores de aguja son creados a partir de 100 tubos capilares l que se calientan en el centro sobre una llama abierta y rápidamente sacó a sus aproximadamente el doble de longitud. Las dos mitades se rompió además una vez que el tubo capilar se enfría. 10-20 arsenal cargadores de aguja para la inyección. Guárdelo en posición vertical en un bastidor de tubo de microcentrífuga. Tenga cuidado de no atravesar a sí mismo en los puntos.
   
   
4. Hacen que las agujas de microinyección:
   
   La aguja está hecho de un tubo especial capilar que contiene un filamento de vidrio interior, este filamento sirve como mecha para la solución de ADN. Estos se extraen en una máquina de aguja-tirador. Utilizamos un Narishige PP-830 extractor con un ajuste de calor de 24,8. Varias agujas se tiran a la vez y se almacenan en una pequeña caja de plástico. Agujas múltiples pueden ser fácilmente "montado" en una tira de plastilina para almacenamiento a largo plazo.
   
   
5. Punta de la aguja "interruptores":
   
   La punta de la aguja de microinyección se tira tan bien que en realidad es cerrado a fin, y debe ser rota abierta con pequeños fragmentos de cristal de la cubierta. Estos son preparados por el ajuste de un 18 x 18 mm cubierta de cristal en una toalla de papel y ejerciendo una suave presión hasta que se rompe en varios pedazos. Fragmentos de un tamaño útil es de aproximadamente 3 x 4 mm.
   
   
6. Crecen de forma silvestre tipo (N2) los gusanos a la etapa adulta temprana para la inyección mediante procedimientos estándar de ^6. Preparar adecuadamente organizado cerca de 100 gusanos / construir inyectado.

Procedimiento

1. Abra la válvula principal en un tanque de helio que está conectado a un brazo de la aguja de microinyección y el soporte. Cierre la válvula de regulación para permitir que el gas para entrar en la línea, con lo que la presión a 35 psi. Tenga en cuenta que el gas puede ser liberado mediante un pedal.
   
   
2. Inserte un cargador de aguja en un tubo de la boca pipeteador estándar (que se encuentran en envases de tubos capilares) y la elaboración de una pequeña cantidad de la mezcla de plásmidos (~ 1 l).
   
   
3. El cargador de la aguja se coloca cuidadosamente en el extremo posterior de una aguja de inyección y se inserta suavemente todo el camino a través de la longitud dela aguja hasta que sienta resistencia. Expulsar a la solución de ADN por soplando suavemente, a continuación, retire el cargador.
   
   
4. Insertar la aguja en el brazo de la microinyección, teniendo cuidado de colocarla dentro de la junta de goma interno pequeño.
   
   
5. Coloque un trozo de aguja rotura de cristal de la cubierta en un borde de una plataforma de agar. Cubrir el fragmento, así como toda la superficie de la almohadilla de agar, con aceite de halocarbonos. Coloque la almohadilla de agar en el escenario de un microscopio invertido.
   
   
6. Posición de la aguja en el centro del campo de visión con el objetivo de 4X y la iluminación de campo claro, pero aún no se baja en el aceite. Además, la posición del borde interior de la astilla de cristal de la cubierta en el centro, a continuación, centrarse en él (aún con el objetivo 4X). Bajar la aguja en el aceite, con lo que en el mismo plano focal que el trozo de cubierta de vidrio. Levante la ampliación por el cambio con el objetivo de 40X. Centrarse en el borde del casco y la posición de la punta de la aguja, si es necesario.
   
   
7. La apertura de la punta de la aguja de inyección, suavemente empujar la aguja en el borde de la tapa de vidrio fragmento, mientras que al mismo tiempo la aplicación de un pulso corto de gas a través del pedal. La aguja se rompe lo suficientemente abierta cuando pequeñas gotas de líquido escapar del extremo de la aguja. Exceso de flujo de líquido debido a una abertura muy grande no es deseable, ya que matar a los animales.
   
   
8. Retire la almohadilla de agar a partir de la etapa de aumento de la aguja hacia arriba, pero no cambiar la posición de X o Y-eje. Deslice la etapa de debajo de la aguja, retire la almohadilla agar y colocarlo en un microscopio de disección. La transferencia de un gusano en la almohadilla, debajo de la superficie del aceite. Si el gusano se retuerce, frotar suavemente hasta que haga contacto con la almohadilla de agar. El gusano húmedos deben adherirse a los secos de agarosa.
   
   
9. Inyección
   1. Coloque rápidamente la parte de atrás pad agar en el escenario, centrando el gusano en el campo de visión.
   2. Baje la aguja en el mismo plano de enfoque como el gusano.
   3. Cambie el filtro de Hoffman Iluminación (un tipo de filtro de contraste). Esto permite que los detalles morfológicos del gusano a ser visible. Si Nomarski / DIC óptica están disponibles en el ámbito invertida que funciona tan bien. Utilizando el objetivo 40X, se centran en el "grano" centro sincitial de las gónadas del gusano, por debajo del "nido de abeja", patrón de los núcleos germinales (elegir la gónada se coloca en el lado de la lombriz frente a la aguja).
   4. Afinar la posición de la aguja hasta que la punta está también en el foco (el mismo plano que la gónada "grano").
   5. Suavemente inserte la aguja en el centro de la gónada y aplicar un breve pulso de la presión del gas para expulsar a una gota o dos de ADN en el brazo de las gónadas. Usted debe observar una ola de expansión de líquido a través de la gónada distal. No asuma más líquido es mejor, ya que un exceso de líquido puede fluir en la curva proximal del brazo de las gónadas, lo que puede detener la producción de ovocitos. Si es posible, dependiendo de la posición del gusano, se inyecta el brazo gonadal otros de la misma manera.
   6. Es importante trabajar con rapidez, mientras que la inyección de un gusano, ya que puede secarse. La decisión de inyectar el brazo gonadal segundo depende de la rapidez con que puede volver a la posición de la aguja y el gusano. Todo el proceso lo ideal sería que en menos de 1-2 minutos.
      
      
10. Quite la cubierta de vidrio desde el escenario y colóquelo en una microscopio de disección. Aplicar 1μl de buffer M9 (22 mm de KH ₂ PO _4, 42 mm de Na ₂ HPO _4, 85 mm de NaCl, 1 mM MgSO ₄₎ directamente sobre el gusano inyecta (esto podría implicar sumergir la punta de la pipeta por debajo de la superficie del aceite de halocarbonos). El tampón debe rehidratar el gusano, sino que se va a flotar fuera de la superficie de la placa de agarosa. La transferencia de la lombriz en un plato normal con un pico del gusano. La almohadilla de agarosa puede ser reutilizado varias veces más hasta que se ha convertido en demasiado saturado con tampón y los gusanos ya no se adhieren.

Selección de transgénicos

1. Gusanos se inyecta, la generación P _0, se transfieren a platos individuales fresco, sin semillas con bacterias (60 mm) y les permite reproducirse. Por lo general, los animales inyectados se incuban a 20 ° C durante 2-3 días hasta que las crías aparecen.
   
   
2. La F ₁ se observa la evidencia del marcador de transgénicos (como la fluorescencia), utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente. Cada portador fluorescentes, F _1, los animales clonados por separado en un plato nuevo (ya que la descendencia de cada F ₁ se considera una línea distinta). La F ₁ hermafroditas se les permite reproducirse. De nuevo, esto se realiza normalmente en menos de 20 ° C durante 2-3 días hasta que las crías aparecen.
   
   
3. La generación F ₂ se observa en los animales transgénicos así. F ₂ animales que han heredado y expresan la variedad transgénica se consideran "estable" de línea.
   
   NOTA: En la F _{1 de}edad, puede haber muchos animales transgénicos, pero no son estables. La mayoría de los animales transgénicos F ₁ no se propagarán en F ₂ líneas estables.
   
   NOTA: Para el control de la variabilidad en el número de copias del gen, generar un mínimo de tres líneas independientes estables por la construcción de inyección.
   
   
4. Cada línea estable independiente debe mantenerse como una línea separada de los gusanos. Cada línea se puede propagar mediante la transferencia de varios animales transgénicos para una nueva placa en cada generación, lo que debe llevarse a cabo utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente si el marcador de selección es fluorescente.

Discusión

Cuando se realiza este procedimiento, es importante recordar lo siguiente:
- Inyectar directamente en el centro de la gónada
- No inyectar demasiado líquido
- Trabajar con rapidez para evitar la desecación.

Si llegas a tener problemas con la aguja, como se rompe demasiado grande, lo mejor es rehacer una aguja nueva, en lugar de tratar de inyectar con una aguja de menos de ideal.

La generación de gusanos transgénicos tiene muchas aplicaciones, tales como:
- La identificación de genes mutantes...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef	Hulle 10S	elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm		Fisher Scientific	12-548-A
Coverglass 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Coverglass 22x50 mm		Fisher Scientific	12-545-E
100 ul Capillary		VWR international	53432-921
Glass Capillary for Needles	"Kwik-Fil"	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Needle Puller	Tool	Narishige International	Model PP-830
microINJECTOR System		Tritech Research, Inc.	MINJ-1000	Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence	Microscope	Nikon Instruments	SMZ800
Dissecting	Microscope	Nikon Instruments	SMZ645