Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Resumo

Este vídeo demonstra a técnica de microinjeção no gônadas de C. elegans para criar animais transgênicos.

Resumo

Elegans Caenorhabditis transgênicos podem ser facilmente criados através de microinjeção de uma solução de DNA plasmidial para o ¹ gonadal. O DNA plasmidial se reorganizam para formar concatamers extracromossómicos que são herdados de maneira estável, embora não com a mesma eficiência como cromossomos reais ^2. Um gene de interesse é co-injetado com um marcador fenotípico óbvio, como rol-6 ou GFP, para permitir a seleção de animais transgênicos sob um microscópio de dissecação. O gene exógeno pode ser expressa de seu promotor nativo para estudos de localização celular. Alternativamente, o transgene pode ser conduzido por um promotor diferentes tecidos específicos para avaliar o papel do produto do gene em que determinada célula ou tecido. Esta técnica eficiente drives expressão do gene em todos os tecidos de C. elegans, exceto para o embrião ou início de linha germinal ^3. Criação de animais transgênicos é amplamente utilizado para uma série de paradigmas experimentais. Este vídeo demonstra o processo de microinjeção para gerar vermes transgênicos. Além disso, a seleção e manutenção de transgênicos estável C. elegans é descrita linhas.

Protocolo

Construção expressão Plasmid

Dois plasmídeos são necessários: um para o tecido-específicos a expressão do gene de interesse e um segundo como marcador de transformação selecionáveis.

Experimental Plasmid

1. Selecione um promotor que se expressa no tipo de tecido / células de interesse, por exemplo, um nervo ou músculo-específicos promotor. Se uma é a de expressar genes múltiplos dentro do mesmo tecido, uma fita cassete promotor plasmídeo no sistema Gateway (Invitrogen) pode ser usado. Esta abordagem permite a inserção de qualquer gene de interesse a jusante do promotor por ⁴ a clonagem ^{recombinational.} Geralmente, 2-5 kb de sequências a montante é suficiente para ter expressão correta e precisa.
   
   
2. O cDNA do gene de interesse pode ser clonado de duas maneiras:
   1. Clonagem convencional, usando enzimas de restrição.
   2. Para clonagem Gateway, que é amplificado PCR usando primers que contêm o Gateway att seqüência B recombinational. O cDNA amplificado é primeiro recombinados no pDONR201 vetor doador para criar o vetor de entrada e depois transformado em E. coli DH5a tensão. Após a selecção de recombinantes de sucesso e mini-prep isolamento de DNA, o vetor de entrada é recombinados no vetor destino promotor contendo para criar a expressão plasmídeo. Detalhes sobre a clonagem recombinational estão disponíveis a partir de qualquer manual de gateway da Invitrogen ou em Caldwell et al. ^5.

Marcador selecionável Plasmid

Exemplos de plasmídeos marcador transgênicos incluem rol-6 ou o uso do promotor de parede muscular do corpo unc-54 para dirigir a expressão da proteína fluorescente. Estes plasmídeos marcador normalmente estão disponíveis dentro da comunidade de pesquisa, mediante solicitação.

Microinjeção de C. elegans

Preparação

1. Realizar o isolamento do DNA dos dois plasmídeos que estão a ser injetado. Quantificar-los e misturar na proporção de 1:1 de 50 ng / mL cada.
   
   
2. Prepare almofadas agar:
   1. Faça uma solução de 2% agarose em água, calor ou microondas até dissolver.
   2. Estabelecidos vários 22 x 50 mm na tampa óculos de uma bancada.
   3. Com uma pipeta Pasteur, colocar uma gota do agarose derretida em uma tampa de vidro e coloque imediatamente uma tampa de vidro, o segundo sobre a queda em um ângulo de 90 com o primeiro. Repita o procedimento para vários copos cobrir outro. O diâmetro do disco achatado de agarose deve ser entre 15-20 mm.
   4. Após a agarose solidificou (este só tem momentos), retire a tampa de vidro e permitir que a almofada de ar para secar completamente (várias horas durante a noite).
   5. Armazenar os blocos em uma caixa de vidro da tampa à temperatura ambiente.
      
      
3. Faça carregadores de agulha para a solução de DNA:
   
   Carregadores de agulha são criados a partir de 100 l tubos capilares que são aquecidas no meio sobre uma flama aberta e rapidamente puxado para cerca de duas vezes o seu comprimento. As duas metades são agarrados à parte uma vez que o tubo capilar esfria. Estoque 10-20 carregadores agulha para a injecção. Guardar na posição vertical em um rack tubo de microcentrífuga. Tenha cuidado para não empalar-se nos pontos.
   
   
4. Faça agulhas microinjeção:
   
   A agulha é feita a partir de um tubo especial capilar que contém um filamento de vidro interno; este filamento serve como um pavio para a solução de DNA. Essas são puxados em uma máquina de agulha extrator. Nós usamos um Narishige PP-830 com uma configuração extrator de calor de 24,8. Agulhas diversas são puxados em um momento e são armazenadas em uma pequena caixa de plástico. Várias agulhas podem ser facilmente "montado" em uma tira de massa de modelar para armazenamento de longo prazo.
   
   
5. Ponta da agulha "breakers":
   
   A ponta da agulha microinjeção é puxado tão fina que é realmente fechado para ele final e deve ser quebrado usando cacos de vidro pequena tampa. Estes são preparados por um embrulho 18 x 18 mm de tampa de vidro um papel toalha e gentilmente aplicando pressão até que quebre em vários pedaços. Fragmentos de um tamanho útil é de aproximadamente 3 x 4 mm.
   
   
6. Crescer tipo selvagem (N2) worms para a fase adulta cedo para injeção usando procedimentos padrão ^6. Prepare corretamente cerca de 100 encenou worms / construir injetado.

Procedimento

1. Abra a válvula principal em um tanque de hélio que está conectado a um braço e agulha microinjeção titular. Fechar a válvula reguladora para permitir que o gás entrar na linha, trazendo a pressão para 35 psi. Observe que o gás pode ser liberado através de um pedal.
   
   
2. Inserir uma agulha em um carregador de tubos padrão boca pipeta (encontrado em embalagens de tubos capilares de vidro) e elaborar uma pequena quantidade da mistura de plasmídeo (~ mL 1).
   
   
3. O carregador de agulha é cuidadosamente colocada na extremidade traseira de uma agulha de injeção e gentilmente inserido todo o caminho até o comprimento dea agulha até sentir resistência. Expulsar a solução de DNA por soprando suavemente, em seguida, retire o carregador.
   
   
4. Inserir a agulha no braço microinjeção, tendo o cuidado de colocá-lo dentro da junta de borracha pequena interna.
   
   
5. Coloque um pedaço de agulha quebra de vidro da tampa sobre uma extremidade de um bloco de ágar. Cobrir o shard, bem como toda a superfície do pad agar, com o petróleo halocarbonos. Coloque o bloco de ágar no palco de um microscópio invertido.
   
   
6. Posição da agulha no centro do campo de visão usando o objetivo de 4X e iluminação de campo claro, mas ainda não diminuí-lo para o óleo. Além disso, a posição da borda interna do caco de vidro no centro da capa, então o foco sobre ele (ainda usando objetivo 4X). Abaixe a agulha no petróleo, trazendo-o no mesmo plano focal como o caco de vidro da tampa. Elevar a ampliação mudar para a objetiva de 40X. Recentrar na borda do fragmento e reposicionar a ponta da agulha, se necessário.
   
   
7. Para abrir a ponta da agulha de injeção, cutucar gentilmente a agulha contra a borda da tampa de vidro caco, enquanto ao mesmo tempo, a aplicação de um pulso curto de gás através do pedal. A agulha vai ser suficientemente arrombado quando pequenas gotas de líquido escapar da ponta da agulha. Fluxo de líquido em excesso, devido à abertura de uma muito grande não é desejável, uma vez que irá matar os animais.
   
   
8. Remover o bloco de ágar do palco, levantando a agulha para cima, mas não altere a X ou eixo Y posição. Deslize o estágio de baixo da agulha, retire o bloco de ágar e colocá-lo em um microscópio de dissecação. Transferência de um worm para o bloco, abaixo da superfície do óleo. Se o verme se contorce, gentilmente acariciá-lo até que o bloco de contatos agar. O worm úmido devem aderir ao agarose seca.
   
   
9. Injeção
   1. Colocar rapidamente as costas pad agar para o palco, centrando o worm no campo de visão.
   2. Abaixe a agulha no mesmo plano de foco como o worm.
   3. Mudar os filtros para Hoffman Iluminação (um tipo de filtro de contraste). Isso permite que os detalhes morfológicos do verme para se tornar visível. Se Nomarski / DIC óptica estão disponíveis no âmbito invertido que vai funcionar tão bem. Usando a objetiva de 40X, o foco no centro de "granulado" sincicial da gônada worm, abaixo do padrão de "favo de mel" dos núcleos germinativas (escolher qualquer das gônadas é posicionado no lado do worm enfrentar a agulha).
   4. Afinar a posição da agulha até que a ponta também está em foco (o mesmo plano que o "grão" gônadas).
   5. Insira cuidadosamente a agulha no centro da gônada e aplicar um breve pulso de pressão de gás para expulsar uma gota ou duas de DNA no braço gonadal. Você deve observar uma onda de propagação de líquido através da gônada distal. Não assuma mais líquido é melhor, desde muito líquido pode fluir para dentro da curva proximal do braço gônadas, o que pode encerrar a produção de oócitos. Se possível, dependendo da posição do worm, injetar o braço gônadas outros da mesma maneira.
   6. É importante trabalhar rapidamente, enquanto a injeção de um worm, pois ele pode facilmente desidratar. A decisão de injetar o braço gônadas segunda é dependente de como rapidamente você pode re-posicionar a agulha e worm. Todo o processo devem, idealmente, ter menos de 1-2 minutos.
      
      
10. Remova a tampa de vidro do palco e colocá-lo em um escopo de dissecação. Aplicar 1μl de tampão M9 (22mm KH ₂ PO _4, 42mm Na ₂ HPO _4, NaCl 85mm, 1mM MgSO ₄₎ diretamente sobre o worm injetado (isso implicaria submergindo a ponta da pipeta abaixo da superfície do óleo halocarbonos). O buffer deve hidratar o worm, que então flutuam na superfície pad agarose. Transferir o worm para um prato regular usando uma picareta worm. A almofada de agarose podem ser reutilizados várias vezes mais até que ela se tornou muito saturado com tampão e os vermes já não aderir.

Seleção de transgênicos

1. Worms injetada, a P ₀ geração, são transferidos para nova individuais, placas de bactérias semeadas (60 mm) e permissão para reproduzir. Normalmente, os animais injetados são incubados a 20 ° C por 2-3 dias até que os filhotes aparecem.
   
   
2. A F ₁ filhos são observados para a evidência do marcador de transgênicos (como fluorescência) usando um estereomicroscópio fluorescente. Cada operadora, fluorescente F _1, animal clonado é separado em um prato novo (já que a prole de cada F ₁ são considerados uma linha distinta). A F ₁ hermafroditas têm permissão para se reproduzir. Novamente, isso é normalmente realizada em menos 20 ° C por 2-3 dias até que os filhotes aparecem.
   
   
3. A geração F ₂ é observado para os animais transgênicos também. F ₂ animais que herdaram e expressar a matriz transgênicos são considerados uma linha de "estável".
   
   NOTA: No ₁ º Fidade pode haver muitos animais transgênicos, mas eles não são estáveis. A maioria dos animais transgênicos F ₁ não serão propagadas em F ₂ linhas estável.
   
   NOTA: Para controlar a variabilidade no número de cópias do gene, gerar um mínimo de três linhas independentes estável por construir injetado.
   
   
4. Cada linha independente e estável deve ser mantida como uma linha separada de vermes. Cada linha pode ser propagada através da transferência de vários animais transgênicos para um prato novo a cada geração, o que deve ser realizada em um estereomicroscópio fluorescentes se o marcador selecionável é fluorescente.

Discussão

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar-se de:
- Injectar directamente no centro da gônada
- Não injetar muito líquido
- Trabalhar com rapidez para evitar dessecação.

Se você tiver problemas com a agulha, tal como ela é quebrada muito grande, o melhor é remake de uma agulha fresco, ao invés de tentar injetar com menos de agulha ideal.

A geração de worms transgênico tem muitas aplicações, tais como:
- Identificação de genes mutantes, no método chamado de resgate de transf...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef	Hulle 10S	elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm		Fisher Scientific	12-548-A
Coverglass 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Coverglass 22x50 mm		Fisher Scientific	12-545-E
100 ul Capillary		VWR international	53432-921
Glass Capillary for Needles	"Kwik-Fil"	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Needle Puller	Tool	Narishige International	Model PP-830
microINJECTOR System		Tritech Research, Inc.	MINJ-1000	Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence	Microscope	Nikon Instruments	SMZ800
Dissecting	Microscope	Nikon Instruments	SMZ645