Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Резюме

Это видео демонстрирует технику микроинъекции в гонаде C. Элеганс для создания трансгенных животных.

Аннотация

Трансгенные Caenorhabditis Элеганс может быть легко создан с помощью микроинъекции ДНК плазмиды раствора в гонады ^1. ДНК плазмиды перестраивает сформировать внехромосомными concatamers, которые стабильно наследуются, хотя и не с такой же эффективностью, как фактическое хромосомы ^2. Интересующего гена совместно вводили очевидным фенотипических маркеров, таких как РОЛ-6 или GFP, чтобы отбор трансгенных животных при вскрытии микроскопом. Экзогенного гена может быть выражена от его родного промоутер для сотовых исследования локализации. Кроме того, трансгенов может быть вызвано различными тканеспецифические промоутер для оценки роли продукта гена в данной клетки или ткани. Этот метод эффективно диски экспрессии генов во всех тканях C. Элеганс, за исключением половых или раннего эмбриона ^3. Создание трансгенных животных широко применяется для целого ряда экспериментальных парадигм. Это видео демонстрирует микроинъекции процедуры для создания трансгенных червей. Кроме того, подбор и обеспечение стабильной трансгенных C. Элеганс линии описывается.

протокол

Выражение плазмиды Строительство

Два плазмид требуются: одна для тканеспецифические экспрессии гена интересов и второй, как селективный маркер трансформации.

Экспериментальные плазмиды

1. Выберите промоутер, что выражается в ткани / элемент тип интереса, например, нерва или мышцы конкретных промоутера. Если кто-то выразить нескольких генов в той же ткани, промоутер кассету плазмиды в шлюзе системы (Invitrogen) могут быть использованы. Такой подход позволяет вставлять любой ген интереса ниже по течению от промотора рекомбинационной ^{4 клонирования.} Правило, 2-5 кб предшествующих последовательностей достаточно иметь правильные и точные выражения.
   
   
2. КДНК гена может быть клонирован двумя способами:
   1. Обычные клонирования использованием ферментов рестрикции.
   2. Для клонирования шлюз, это ПЦР усиливается использованием праймеров, содержащих шлюз ATT B рекомбинационной последовательности. Усиливается кДНК первой объединить в pDONR201 доноров вектора, чтобы создать запись вектор, а затем превращается в E. палочки штамма DH5a. После выбора успешных рекомбинантов и мини-приготовительные изолирования ДНК, вступление вектор объединить в промоутер содержащих назначения вектор для создания выражения плазмиды. Подробности о рекомбинационной клонирования можно получить либо ручной шлюз Invitrogen или в Колдуэлл и соавт. ^5.

Выбор Маркера плазмиды

Примеры трансгенных плазмид маркер включают РОЛ-6 или использование мышц стенки тела промоутер UNC-54 для управления флуоресцентными экспрессии белка. Эти плазмиды маркера, как правило, доступны из научно-исследовательского сообщества по запросу.

Микроинъекции Элеганс C.

Подготовка

1. Выполните выделения ДНК из двух плазмид, которые должны быть введены. Количественно их и смешать в соотношении 1:1 на 50 нг / мкл.
   
   
2. Подготовка агара лап:
   1. Сделайте 2% агарозном раствора в воде, тепло или микроволновой печи до полного растворения.
   2. Изложить несколько 22 х 50 мм стекла крышка на настольный.
   3. С помощью пипетки Пастера, поместите каплю расплавленной агарозы на одной обложкой стекло и сразу же место второй стакан крышку над падение на 90 углом к ​​первой. Повторите несколько других стекол крышку. Диаметр уплощенной диск агарозы должна быть в пределах 15-20 мм.
   4. После агарозном укрепил (это займет всего моментов), снимите крышку стекла и позволяют площадку высохнуть полностью (несколько часов, чтобы на ночь).
   5. Хранить прокладки в окно стеклянной крышкой при комнатной температуре.
      
      
3. Сделать иглы погрузчиков ДНК решение:
   
   Иглы погрузчики создаются из 100 мкл капиллярной трубки, которые нагреваются в среднем на открытом огне и быстро вытащил примерно в два раза их длины. Две половинки привязываются друг от друга раз капиллярная трубка охлаждается. Запасами 10-20 иглы погрузчики для инъекций. Магазин в вертикальном положении в стойку трубки микроцентрифужных. Будьте осторожны, чтобы не прокалывать себе на очки.
   
   
4. Сделать микроинъекции игл:
   
   Игла изготовлена ​​из специального капилляра, который содержит внутренние нити стекла, нити этого служит фитиля для раствора ДНК. Эти тянут на иглу-съемник машины. Мы используем Narishige PP-830 Съемник с тепловой установки 24.8. Некоторые иглы потянул время и хранятся в небольшой пластиковой коробке. Несколько иглы могут быть легко «установлена» на полосу пластилин для долгосрочного хранения.
   
   
5. Иглы "выключатели":
   
   Кончике иглы микроинъекции вытягивается так хорошо, что это фактически закрыта в конце этого и должен быть взломан с помощью небольших осколков покровного стекла. Эти подготовленные упаковки 18 х 18 мм защитное стекло в бумажное полотенце и осторожно нажимая пока он разбивается на несколько частей. Осколки полезных размер примерно 3 х 4 мм.
   
   
6. Расти дикого типа (N2) червей ранней стадии взрослой для инъекций с использованием стандартных процедур ^6. Подготовка около 100 правильно поставил черви / построить вводили.

Процедура

1. Откройте основной клапан на бак гелия, который подключен к руке микроинъекции иглой и держателем. Закройте регулирующий клапан, чтобы газ, чтобы войти в линию, в результате чего давление до 35 атм. Обратите внимание, что газ может быть выпущен использованием педали.
   
   
2. Вставьте иглу погрузчика в стандартной трубы pipetter рот (находится в контейнерах стеклянные капилляры) и составить небольшое количество смеси плазмиды (~ 1 мкл).
   
   
3. Иглы погрузчика осторожно помещают в задней части инъекционной иглы и аккуратно вставляется весь путь до конца длинуиглу, пока не почувствуете сопротивление. Выгнать раствора ДНК, мягко дует, а затем удалить загрузчик.
   
   
4. Вставьте иглу в микроинъекции руку, стараясь, чтобы поместить его в небольшой внутренний резиновую прокладку.
   
   
5. Место иглы нарушение осколок покровного стекла на одном краю агар площадку. Обложка осколок, а также всей поверхности агара площадку, с галоидоуглеводородов нефти. Место агар накладка на стадии инвертированного микроскопа.
   
   
6. Расположите иглу в центр поля зрения использования 4X объективных и яркое освещение поля, но до сих пор не опустите его в масло. Кроме того, положение внутреннего края осколок покровного стекла в центре, затем сосредоточиться на нем (еще используют 4X цель). Опустите иглу в нефти, приведение его в той же фокальной плоскости, как осколок покровного стекла. Поднимите увеличение за счет перехода на 40Х цели. Переориентация на краю осколка и положение кончика иглы, если это необходимо.
   
   
7. Чтобы открыть до кончика инъекционной иглой, осторожно подталкивать иглу к краю покровного стекла осколок, и в то же время применение короткого импульса газа через ножную педаль. Иглы будет достаточно взломан, когда маленькие капельки жидкости побега конце иглы. Избыток жидкости потока из-за слишком большого открытия не желательно, так как он будет убивать животных.
   
   
8. Удалить агар площадку со сцены, поднимая иглу, но не меняют X-или Y-ось позиции. Слайд этапе из-под иглы, удалить агар площадку и разместить его на вскрытии микроскопом. Передача червя на панель, ниже поверхности нефти. Если червь извивается, нежно поглаживать его, пока он контактов агар площадку. Влажной червь должен придерживаться сухой агарозы.
   
   
9. Инъекция
   1. Быстро место обратно агар площадку на сцену, центрирования червя в поле зрения.
   2. Опустите иглу в той же плоскости, в фокусе, как червь.
   3. Переключатель фильтров для освещения Хоффман (тип контраста фильтра). Это позволяет морфологическая деталь червя становятся видимыми. Если Номарского / DIC оптики можно найти на перевернутый масштаб, который будет работать также. Использование 40X цели, сосредоточиться на "зернистым" синцитиальный центре червь гонады, ниже "сотовый" узор ростка ядер (выбрать в зависимости от того гонады расположен на стороне червя перед иглой).
   4. Точная настройка положения иглы до кончика также находится в фокусе (той же плоскости, гонад "зернистости").
   5. Осторожно введите иглу в центре гонады и применять короткого импульса давления газа изгнать капля или две ДНК в гонады руку. Вы должны наблюдать волну жидкости распределены по дистальной гонады. Не думайте, что больше жидкости, лучше, так как слишком много жидкости может поступать в проксимальных изгиб гонады руки, которые могут закрыть ооцитов производства. Если это возможно, в зависимости от положения червя, ввести другую руку гонады в том же порядке.
   6. Важно, чтобы работать быстро, в результате употребления инъекционных червя, так как она может легко пересушивает. Решение придать второе плечо гонад зависит от того, насколько быстро вы можете повторно положение иглы и червя. Весь процесс в идеале должны принимать не более 1-2 минут.
      
      
10. Снимите крышку стекла со сцены и поместите его на вскрытии области. Применять 1 мкл М9 буфера (22 мм KH ₂ PO _4, 42мм Na ₂ HPO _4, 85 мм NaCl, 1 мМ MgSO ₄₎ непосредственно на вводили червя (это может повлечь за собой погружение кончика пипетки от поверхности галоидоуглеводородов нефти). Буфер должен увлажняет червя, он будет плавать от поверхности агарозном площадку. Передача червя регулярные пластины с использованием червя выбор. Площадку агарозы можно повторно использовать еще несколько раз, пока не стало слишком насыщенным буфера и червей не придерживаться.

Трансгенные выбор

1. Введенный червей, P ₀ поколения, перечисляемых на индивидуальные свежие, бактериально посеяны пластины (60 мм) и позволила воспроизвести. Как правило, вводят животным инкубируют при 20 ° С в течение 2-3 дней, пока потомство появится.
   
   
2. F ₁ потомства наблюдаются на наличие трансгенной маркер (например, флуоресценции) при помощи флуоресцентного стереомикроскопа. Каждый люминесцентные, перевозчик F _1, животное отдельно клонирована на новую пластинку (так как потомство от каждого F ₁ рассматриваются различные линии). F ₁ гермафродитов допускаются к размножению. Опять же, это, как правило, осуществляется на при 20 ° С в течение 2-3 дней, пока потомство появится.
   
   
3. F ₂ поколения наблюдается у трансгенных животных, а также. F ₂ животных, которые унаследовали и выразить трансгенных массива считаются «стабильный» линии.
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: В F _1-йвозраст может быть много трансгенных животных, но они не являются стабильными. Большинство F ₁ трансгенных животных, не будут распространяться на F ₂ устойчивых линий.
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля за изменчивости числа копий гена, создавать не менее трех независимых стабильных линий на построить вводили.
   
   
4. Каждый независимый стабильный линия должна быть сохранена в качестве отдельной строкой червей. Каждая строка может распространяться путем передачи нескольких трансгенных животных для новой пластинкой в ​​каждом поколении, что должно быть выполнено с использованием флуоресцентного стереомикроскопа если выбор маркера флуоресцентные.

Обсуждение

При выполнении этой процедуры, важно помнить, чтобы:
- Вводят непосредственно в центре гонады
- Не вводить слишком много жидкости
- Работать быстро, чтобы предотвратить высыхание.

Если у вас возникли проблемы с иглой, такие, как он сломан слишком большой, то лучше переделать свежей иг...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef	Hulle 10S	elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm		Fisher Scientific	12-548-A
Coverglass 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Coverglass 22x50 mm		Fisher Scientific	12-545-E
100 ul Capillary		VWR international	53432-921
Glass Capillary for Needles	"Kwik-Fil"	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Needle Puller	Tool	Narishige International	Model PP-830
microINJECTOR System		Tritech Research, Inc.	MINJ-1000	Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence	Microscope	Nikon Instruments	SMZ800
Dissecting	Microscope	Nikon Instruments	SMZ645