Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Résumé

Cette vidéo montre la technique de microinjection dans la gonade de C. elegans pour créer des animaux transgéniques.

Résumé

Caenorhabditis elegans transgéniques peuvent être facilement créées via la micro-injection d'une solution d'ADN plasmidique dans ^l'une des gonades. L'ADN plasmidique réorganise pour former concatémères extrachromosomique qui sont héritées de façon stable, mais pas avec la même efficacité que les chromosomes réelle ^2. Un gène d'intérêt est co-injecté avec un marqueur évident phénotypiques, comme rol-6 ou GFP, pour permettre la sélection d'animaux transgéniques sous un microscope à dissection. Le gène exogène peut être exprimée à partir de son promoteur natif pour les études de localisation cellulaire. Alternativement, le transgène peut être piloté par un promoteur différent tissu-spécifique d'évaluer le rôle du produit du gène dans la cellule ou un tissu particulier. Cette technique entraîne efficacement l'expression des gènes dans tous les tissus de C. elegans à l'exception des cellules germinales de l'embryon ou au début ^3. Création d'animaux transgéniques est largement utilisé pour une gamme de paradigmes expérimentaux. Cette vidéo montre la procédure de micro-injection pour produire des vers transgéniques. Par ailleurs, la sélection et le maintien de lignées transgéniques stables C. elegans est décrite.

Protocole

Construction plasmide d'expression

Deux plasmides sont nécessaires: un pour expression tissu-spécifique du gène d'intérêt et d'une seconde comme marqueur de la transformation sélectionnable.

Experimental plasmidique

1. Sélectionnez un promoteur qui est exprimé dans le type de tissu / cellule d'intérêt, par exemple, un nerf ou de muscle promoteur spécifique. Si l'on est d'exprimer des gènes multiples dans le même tissu, une cassette promoteur plasmide dans le système Gateway (Invitrogen) peuvent être utilisés. Cette approche permet l'insertion d'un gène d'intérêt en aval du promoteur par ⁴ le clonage par ^{recombinaison.} Généralement, 2-5 kb de séquences en amont est suffisante pour avoir l'expression correcte et précise.
   
   
2. L'ADNc du gène d'intérêt peut être cloné de deux façons:
   1. Clonage classiques utilisant des enzymes de restriction.
   2. Pour le clonage de la passerelle, il est amplifié par PCR utilisant des amorces qui contiennent la passerelle att séquence B recombinaison. L'ADNc amplifié est d'abord recombinés dans le vecteur donneur pDONR201 pour créer le vecteur d'entrée et ensuite transformé en E. coli souche DH5a. Après la sélection de recombinants succès et mini-prep isolation de l'ADN, le vecteur d'entrée est recombinée dans le vecteur de destination promoteur contenant de créer le plasmide d'expression. Détails sur le clonage par recombinaison sont disponibles à partir du manuel soit Passerelle Invitrogen ou dans Caldwell et al. ^5.

Marqueurs de sélection plasmidique

Des exemples de plasmides marqueur transgénique comprennent rol-6 ou l'utilisation du promoteur musculaire du corps murale unc-54 pour conduire l'expression de protéines fluorescentes. Ces plasmides marqueur sont généralement disponibles au sein de la communauté de la recherche sur demande.

Microinjection de C. elegans

Préparation

1. Effectuer isolement de l'ADN des deux plasmides qui doivent être injectés. Les quantifier et les mélanger dans un rapport 1:1 de 50 ng / ul chacun.
   
   
2. Préparer coussinets agar:
   1. Faire une solution à 2% d'agarose dans de l'eau, la chaleur ou micro-ondes jusqu'à dissolution.
   2. Énonce plusieurs verres 22 x 50 mm sur un couvercle de paillasse.
   3. En utilisant une pipette Pasteur, déposer une goutte de l'agarose fondu sur un couvercle en verre et placer immédiatement un couvercle en verre seconde sur la baisse à un angle de 90 à la première. Répétez l'opération pour plusieurs verres couvrir d'autres. Le diamètre du disque aplati d'agarose doit être comprise entre 15-20 mm.
   4. Après l'agarose solidifié (Cela ne prend que des moments), retirez le couvercle en verre et de permettre le pad à l'air complètement sec (plusieurs heures pour la nuit).
   5. Boutique des plaquettes dans une boîte en verre couvercle à la température ambiante.
      
      
3. Faire chargeurs aiguille pour la solution d'ADN:
   
   Chargeurs aiguille sont créés à partir de 100 ul tubes capillaires qui sont chauffés au milieu sur une flamme nue et rapidement tiré à environ deux fois leur longueur. Les deux moitiés sont cassé dehors une fois le tube capillaire se refroidit. Des stocks de 10 à 20 chargeurs de seringues pour l'injection. Conserver en position verticale dans un rack microtube. Faites preuve de prudence pour ne pas se empaler sur les points.
   
   
4. Faire des aiguilles de microinjection:
   
   L'aiguille est fabriquée à partir d'un tube capillaire spéciale qui contient un filament de verre interne; ce filament sert d'une mèche pour la solution d'ADN. Ce sont tirés sur une machine à aiguille extracteur. Nous utilisons un Narishige PP-830 Extracteur avec un réglage de chaleur de 24,8. Plusieurs aiguilles sont tirés à la fois et sont stockées dans une petite boîte en plastique. Aiguilles multiples peuvent être facilement "monté" sur une bande de pâte à modeler pour le stockage à long terme.
   
   
5. Pointe de l'aiguille "disjoncteurs":
   
   La pointe de l'aiguille de microinjection est tiré si fine qu'elle est effectivement fermé à son extrémité et doit être défoncé à l'aide des tessons de verre petite couverture. Ce sont préparés par emballage de 18 x 18 mm couvercle en verre dans une serviette de papier et appliquer une pression doucement jusqu'à ce qu'elle se brise en plusieurs morceaux. Les éclats d'une taille utile est d'environ 3 x 4 mm.
   
   
6. Cultivez de type sauvage (N2) vers le stade adulte au début d'injection en utilisant des procédures standard de ^6. Préparer environ 100 bien mis en scène des vers / construire injecté.

Procédure

1. Ouvrez la vanne principale sur un réservoir d'hélium qui est relié à un bras de l'aiguille de microinjection et titulaire. Fermez la vanne de régulation pour permettre au gaz d'entrer dans la ligne, amenant la pression à 35 psi. Notez que le gaz peut être libéré à l'aide d'une pédale.
   
   
2. Insérez un chargeur aiguille dans un tube pipetteur bouche standard (trouvés dans des récipients de tubes capillaires en verre) et d'établir une petite quantité du mélange plasmide (~ 1 pl).
   
   
3. Le chargeur de l'aiguille est bien placée dans l'extrémité arrière d'une aiguille d'injection et délicatement insérées tout au long de la longueur del'aiguille jusqu'à sentir une résistance. Expulser la solution d'ADN en soufflant doucement, puis retirer le chargeur.
   
   
4. Insérez l'aiguille dans le bras de micro-injection, en prenant soin de le placer dans le joint en caoutchouc internes de petite taille.
   
   
5. Placer un tesson aiguille bris de glace couvre sur un bord d'un tampon d'agar. Couvrir le fragment, ainsi que toute la surface du pad agar-agar, avec de l'huile d'halocarbures. Placez le tampon d'agar sur la scène d'un microscope inversé.
   
   
6. Position de l'aiguille dans le centre du champ visualisation en utilisant l'objectif 4X et l'illumination en champ clair, mais n'ont pas encore l'abaisser dans l'huile. En outre, la position du bord interne de l'éclat de verre de couverture dans le centre, puis se concentrer sur elle (toujours avec l'objectif 4X). Abaissez l'aiguille dans l'huile, le ramenant dans le même plan focal que l'éclat de verre de couverture. Soulevez le grossissement en passant à l'objectif 40X. Recentrage sur le bord du tesson et repositionner la pointe de l'aiguille, si nécessaire.
   
   
7. Pour ouvrir la pointe de l'aiguille d'injection, doucement pousser l'aiguille contre le bord du verre couvre éclat, tandis que dans le même temps l'application d'une impulsion courte de gaz via la pédale. L'aiguille sera suffisamment rompu ouvert lorsque de petites gouttelettes de liquide échapper à la fin de l'aiguille. L'excès de flux liquide due à une trop grande ouverture n'est pas souhaitable, car elle va tuer les animaux.
   
   
8. Enlever le tampon d'agar de la scène en levant l'aiguille en place, mais ne changent pas l'X ou l'axe Y de position. Faites glisser le stade de dessous de l'aiguille, retirer le tampon d'agar et le placer sur un microscope à dissection. Transfert d'un ver sur le pavé, en dessous de la surface de l'huile. Si le ver se tortille, doucement caresser jusqu'à ce qu'il touche le pad agar. Le ver humide doit adhérer à la sécheresse agarose.
   
   
9. Injection
   1. Placer rapidement le dos pad agar sur la scène, le centrage le ver dans le champ de vision.
   2. Abaissez l'aiguille dans le même plan d'orientation que le ver.
   3. Mettre le filtre à Hoffman éclairage (un type de filtre de contraste). Cela permet détails morphologiques du ver à devenir visibles. Si Nomarski / DIC optiques sont disponibles sur le champ inversé qui fonctionnera aussi bien. En utilisant l'objectif 40X, se concentrer sur le "grain" centre syncytial de la gonade ver, en dessous du "nid d'abeille" modèle des noyaux germinales (choisir le gonade est positionné sur le côté du ver face à l'aiguille).
   4. Ajustez la position de l'aiguille jusqu'à la pointe est également en discussion (le même plan que la gonade "grain").
   5. Insérer délicatement l'aiguille dans le centre de la gonade et appliquer une brève impulsion de pression de gaz d'expulser une goutte ou deux de l'ADN dans le bras des gonades. Vous devriez observer une vague de propagation de liquide dans la gonade distale. Ne présumez pas plus de liquide est préférable, car trop de liquide peut couler dans le virage proximale du bras gonades, qui peut arrêter la production d'ovocytes. Si possible, selon la position du ver, injecter le bras gonades d'autres de la même manière.
   6. Il est important de travailler rapidement tout en injectant un ver, car il peut facilement se dessèchent. La décision d'injecter le bras gonades seconde dépend de la rapidité avec laquelle vous pouvez repositionner l'aiguille et le ver. L'ensemble du processus devrait idéalement prendre moins de 1-2 minutes.
      
      
10. Retirez le couvercle en verre de la scène et placez-le sur un microscope à dissection. Appliquer 1 microlitre de M9 tampon (22mm KH ₂ PO _4, 42mm Na ₂ HPO _4, 85mm de NaCl, 1 mM MgSO ₄₎ directement sur ​​le ver injecté (cela pourrait entraîner submergeant la pointe de la pipette en dessous de la surface de l'huile d'halocarbures). Le tampon doit réhydrater le ver, il sera alors flotter la surface du tampon d'agarose. Transfert du ver à une plaque régulière en utilisant un pick ver. Le coussin d'agarose peuvent être réutilisées plusieurs fois jusqu'à ce qu'il est devenu trop saturé de tampon et les vers ne plus adhérer.

Sélection transgéniques

1. Ver injecté, le P ₀ génération, sont transférés à chaque nouvelle, les plaques des bactéries ensemencées (60 mm) et autorisé à reproduire. Typiquement, les animaux injectés sont incubées à 20 ° C pendant 2-3 jours jusqu'à ce que la progéniture apparaissent.
   
   
2. La progéniture F ₁ sont observés pour les preuves du marqueur transgénique (telles que la fluorescence) en utilisant un stéréomicroscope fluorescentes. Chaque fluorescentes, porteuse F _{1, un} animal cloné est séparément sur ​​une nouvelle plaque (depuis la progéniture de chaque F ₁ sont considérées comme une ligne distincte). Le ₁ F hermaphrodites sont autorisés à reproduire. Là encore, cela est généralement effectuée au moins 20 ° C pendant 2-3 jours jusqu'à ce que la progéniture apparaissent.
   
   
3. La génération F ₂ est observée pour les animaux transgéniques ainsi. F ₂ animaux qui ont hérité et d'exprimer le tableau transgéniques sont considérées comme un «stable» en ligne.
   
   REMARQUE: Lors de la F ₁ erâge, il peut y avoir beaucoup d'animaux transgéniques, mais ils ne sont pas stables. La majorité des animaux transgéniques F ₁ ne seront pas propagées dans F ₂ lignées stables.
   
   REMARQUE: Pour le contrôle de la variabilité du nombre de copies du gène, de générer un minimum de trois lignes indépendantes stable par la construction injecté.
   
   
4. Chaque ligne indépendante stables devraient être maintenues sur une ligne distincte des vers. Chaque ligne peut être propagé par le transfert de plusieurs animaux transgéniques pour une nouvelle plaque à chaque génération, ce qui doit être effectuée en utilisant un stéréomicroscope fluorescentes si le marqueur de sélection est fluorescent.

Discussion

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de:
- Injecter directement dans le centre de la gonade
- Ne pas injecter trop de liquide
- Travailler rapidement pour empêcher la dessication.

Si vous rencontrez des problèmes avec l'aiguille, comme elle est cassée trop grand, il est préférable de refaire une aiguille neuve, plutôt que d'essayer d'injecter avec une aiguille de moins idéale.

La génération des vers transgéniques a de nombreuses applications telle...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef	Hulle 10S	elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm		Fisher Scientific	12-548-A
Coverglass 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Coverglass 22x50 mm		Fisher Scientific	12-545-E
100 ul Capillary		VWR international	53432-921
Glass Capillary for Needles	"Kwik-Fil"	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Needle Puller	Tool	Narishige International	Model PP-830
microINJECTOR System		Tritech Research, Inc.	MINJ-1000	Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence	Microscope	Nikon Instruments	SMZ800
Dissecting	Microscope	Nikon Instruments	SMZ645