Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

Riepilogo

Questo video mostra la tecnica di microiniezione nella gonade di C. elegans per creare animali transgenici.

Abstract

Transgenici Caenorhabditis elegans possono essere facilmente create tramite microiniezione di una soluzione di DNA plasmidico in gonade ^1. Il DNA plasmidico riorganizza per formare concatamers extracromosomico che sono stabilmente ereditato, anche se non con la stessa efficienza di cromosomi effettivo ^2. Un gene di interesse è co-iniettata con un marker fenotipici evidenti, come ad esempio rol-6 o GFP, per consentire la selezione di animali transgenici sotto un microscopio da dissezione. Il gene esogeno può essere espresso dal suo promotore nativo per gli studi di localizzazione cellulare. In alternativa, il transgene può essere guidata da un diverso tessuto-specifica promotore di valutare il ruolo del prodotto genico in quella cella particolare o tessuto. Questa tecnica di guida in modo efficiente l'espressione genica in tutti i tessuti del C. elegans, tranne per l'embrione linea germinale o ai primi ^3. Creazione di animali transgenici è ampiamente utilizzata per una vasta gamma di paradigmi sperimentali. Questo video mostra la procedura di microiniezione di generare vermi transgenici. Inoltre, la selezione e la manutenzione di stabili transgenici C. elegans linee è descritto.

Protocollo

Espressione Costruzione plasmidi

Due plasmidi sono necessari: uno per espressione tessuto-specifica del gene di interesse e un secondo come marcatore trasformazione selezionabili.

Sperimentale plasmidi

1. Selezionare un promotore che si esprime nel tessuto / cellula tipo di interesse, ad esempio, un nervo o muscolo-specifico promotore. Se uno è di esprimere geni multipli all'interno del tessuto stesso, una cassetta promotore plasmide nel sistema Gateway (Invitrogen) può essere utilizzato. Questo approccio consente l'inserimento di un gene di interesse a valle del promotore di ⁴ clonazione ^{ricombinazione.} Generalmente, 2-5 kb di sequenze a monte è sufficiente disporre di espressione corretta e precisa.
   
   
2. Il cDNA del gene di interesse può essere clonato in due modi:
   1. Clonazione convenzionale utilizzando enzimi di restrizione.
   2. Gateway per la clonazione, è amplificato mediante PCR utilizzando primers che contengono il Gateway att sequenza B ricombinazione. Il cDNA amplificato viene prima ricombinato nel pDONR201 vettore donatore per creare il vettore di ingresso e poi trasformato in E. coli ceppo DH5a. A seguito di selezione dei ricombinanti successo e mini-prep isolamento del DNA, il vettore di ingresso viene ricombinato nel promotore contenenti vettore destinazione per creare il plasmide di espressione. Dettagli sulla clonazione ricombinazione sono disponibili sia dal manuale Gateway Invitrogen o in Caldwell et al. ^5.

Marker selezionabile plasmidi

Esempi di plasmidi marcatore transgenici sono rol-6 o utilizzo del promotore muscolo del corpo muro unc-54 per guidare l'espressione di proteine ​​fluorescenti. Questi plasmidi marker sono generalmente disponibili all'interno della comunità scientifica su richiesta.

Microiniezione di C. elegans

Preparazione

1. Procedere all'isolamento del DNA dei due plasmidi che devono essere iniettati. Quantificare loro e si mescolano in un rapporto 1:1 di 50 ng / mL ciascuno.
   
   
2. Preparare pastiglie agar:
   1. Fare una soluzione al 2% di agarosio in acqua, calore o microonde fino alla dissoluzione.
   2. Sono di varie 22 x 50 bicchieri di copertura mm su un banco.
   3. Utilizzando una pipetta Pasteur, una goccia di agarosio fuso su una copertura in vetro e collocare immediatamente un secondo bicchiere coprire il calo a 90 alla prima. Ripetere l'operazione per diversi bicchieri coprire altre. Il diametro del disco appiattito di agarosio deve essere compreso tra 15-20 mm.
   4. Dopo l'agarosio si è solidificato (questo richiede solo momenti), togliere il vetro di copertura e permettere al pad per asciugare completamente (diverse ore a notte).
   5. Conservare le pastiglie in una scatola di vetro di copertura a temperatura ambiente.
      
      
3. Fai caricatori aghi per soluzione di DNA:
   
   Caricatori aghi vengono creati da 100 microlitri tubi capillari che vengono riscaldate in mezzo su una fiamma aperta e rapidamente tirato a circa il doppio della loro lunghezza. Le due metà sono scattato a parte una volta che il tubo capillare si raffredda. Accumulo 10-20 caricatori ago per l'iniezione. Conservare in posizione verticale in un rack provetta. Prestare attenzione per non impalare se stessi i punti.
   
   
4. Fai aghi microiniezione:
   
   L'ago è costituito da un tubo capillare speciale che contiene un filamento interno in vetro, questo filamento funge da stoppino per la soluzione del DNA. Questi sono tirati su un ago-estrattore macchina. Usiamo un Narishige PP-830 estrattore con una regolazione di calore di 24,8. Aghi diversi sono tirati alla volta e sono memorizzati in una scatola di plastica di piccole dimensioni. Aghi multipli possono essere facilmente "montata" su una striscia di plastilina per la conservazione a lungo termine.
   
   
5. La punta dell'ago "interruttori":
   
   La punta dell'ago microiniezione viene tirato così fine che in realtà è chiuso a finire e deve essere rotto aperto con frammenti di piccole di vetro di copertura. Questi sono preparati avvolgendo una x 18 18 vetro di copertura mm in un tovagliolo di carta e delicatamente applicando una pressione fino a quando si rompe in vari pezzi. Frammenti di dimensioni utili sono circa 3 x 4 mm.
   
   
6. Crescono wild type (N2) vermi allo stadio adulto in anticipo per iniezione utilizzando le procedure standard ^6. Preparare adeguatamente messo in scena circa 100 worm / costruire iniettato.

Procedura

1. Aprire la valvola principale di un serbatoio di elio che è collegato ad un braccio l'ago microiniezione e supporto. Chiudere la valvola di regolazione per consentire al gas di entrare nella linea, portando la pressione a 35 bar. Si noti che il gas può essere rilasciato con un pedale.
   
   
2. Inserire un caricatore ago in una tubazione tradizionale pipetter bocca (che si trova in contenitori di vetro, tubi capillari) e redige una piccola quantità di miscela plasmide (~ 1 ml).
   
   
3. Il caricatore ago è accuratamente inserito nel back-end di un ago per l'iniezione e delicatamente inserito tutto il percorso attraverso la lunghezza dell'ago fino ad avvertire resistenza. Espellere la soluzione di DNA da parte soffia dolcemente, quindi rimuovere il caricatore.
   
   
4. Inserire l'ago nel braccio microiniezione, avendo cura di collocarla all'interno della guarnizione di gomma interno.
   
   
5. Inserire un ago-rottura scheggia di vetro di copertura su un bordo di un pad agar. Coprire il frammento, così come tutta la superficie del pad agar, con olio alocarburi. Posizionare il pad agar sul palcoscenico di un microscopio invertito.
   
   
6. Posizionare l'ago nel centro del campo visivo con l'obiettivo di 4X e di illuminazione in campo chiaro, ma non ancora la più bassa nell'olio. Inoltre, la posizione del bordo interno del frammento di copertura in vetro del centro, per poi focalizzarsi su di esso (ancora con obiettivo 4X). Abbassare l'ago nel petrolio, portandola nello stesso piano focale, come il frammento di vetro di copertura. Sollevare l'ingrandimento passando per l'obiettivo 40X. Ridefinire sul bordo del frammento e riposizionare la punta dell'ago, se necessario.
   
   
7. Per aprire la punta di un ago per l'iniezione, DELICATAMENTE spingere l'ago contro il bordo del coperchio in vetro coccio, mentre allo stesso tempo, applicando un breve impulso di gas attraverso il pedale. L'ago sarà sufficientemente rotto aperto quando piccole gocce di liquido sfuggire alla fine l'ago. Eccesso di flusso di liquido a causa di un'apertura troppo grande non è auspicabile, in quanto uccidono gli animali.
   
   
8. Rimuovere il tampone di agar dal palco sollevando l'ago, ma non cambiare la X o Y. posizione. Far scorrere il palco fuori da sotto l'ago, rimuovere il pad agar e mettetelo su un microscopio da dissezione. Trasferire un worm sul pad, sotto la superficie dell'olio. Se il verme si contorce, DELICATAMENTE accarezzarlo finché non tocca la tastiera agar. Il worm umido dovrebbe aderire al secco agarosio.
   
   
9. Iniezione
   1. Rapidamente posto sul retro pad agar sul palco, centrando il verme nel campo visivo.
   2. Abbassare l'ago nel stesso piano di messa a fuoco come il verme.
   3. Passa i filtri per Hoffman illuminazione (un tipo di filtro di contrasto). Questo permette dettaglio morfologico del worm per diventare visibili. Se Nomarski / DIC ottica sono disponibili sulla portata rovesciata che funziona altrettanto bene. Utilizzando l'obiettivo 40X, si concentrano sul centro "sgranata" sinciziale della gonade verme, sotto il pattern "a nido d'ape" dei nuclei germinali (scegliere quale gonade è posizionato sul lato del worm verso l'ago).
   4. Ottimizzare la posizione dell'ago fino a quando la punta è messa a fuoco (sullo stesso piano della gonade "granulosità").
   5. Inserire delicatamente l'ago nel centro della gonade e applicare un breve impulso di pressione del gas per espellere una goccia o due di DNA nel braccio gonade. Si dovrebbe osservare un'onda di diffusione in tutto il liquido gonade distale. Non assumere più liquidi è meglio, in quanto il liquido troppo può fluire nel piegare prossimale del braccio gonade, che può fermare la produzione di ovociti. Se possibile, a seconda della posizione del worm, iniettare l'altro braccio gonade nello stesso modo.
   6. E 'importante lavorare velocemente, mentre l'iniezione di un verme, come si può facilmente essiccare. La decisione di iniettare il secondo braccio gonade dipende da quanto velocemente si può riposizionare l'ago e worm. L'intero processo è effettuato, a meno di 1-2 minuti.
      
      
10. Togliere il vetro di copertura dal palco e posizionarlo su una portata dissezione. Applicare 1ml di M9 tampone (22mm KH ₂ PO _4, 42mm Na ₂ HPO _4, 85mm NaCl, 1 mM MgSO ₄₎ direttamente sul verme iniettato (questo potrebbe comportare immergendo la punta della pipetta sotto la superficie del petrolio alocarburi). Il buffer dovrebbe reidratare il worm, che sarà poi galleggiare sulla superficie pad agarosio. Trasferimento al worm di un piatto normale con un pick verme. Il pad agarosio può essere riutilizzato più volte fino a quando non è diventato troppo saturo di buffer e il worm non aderire.

Selezione transgenici

1. Vermi iniettato, il P ₀ generazione, vengono trasferiti ai singoli fresca, piatti batteri seminati (60 mm) e ha permesso di riprodurre. Tipicamente, gli animali iniettati vengono incubate a 20 ° C per 2-3 giorni fino a quando la prole apparire.
   
   
2. Il ₁ prole F sono osservati per la prova del marcatore transgenici (come fluorescenza) utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza. Ogni fluorescente, vettore F _1, animale è clonato separatamente su una piastra di nuovo (in quanto discendenti da ogni F ₁ sono considerati una linea distinta). La F ₁ ermafroditi sono autorizzati a riprodurre. Di nuovo, questo è tipicamente effettuata a 20 ° C per 2-3 giorni fino a quando la prole apparire.
   
   
3. La generazione F ₂ è osservato per gli animali transgenici pure. F ₂ animali che hanno ereditato ed esprimere l'array transgenici sono considerati una linea di "stabile".
   
   NOTA: Al ₁ ° Fetà ci possono essere molti animali transgenici, ma non sono stabili. La maggior parte degli F ₁ animali transgenici non saranno diffusi in F ₂ linee stabili.
   
   NOTA: Per controllare la variabilità del numero di copie del gene, generare un minimo di tre linee indipendenti stabile per costruire iniettato.
   
   
4. Ogni linea indipendente stabile dovrebbe essere mantenuto come una linea separata di vermi. Ogni linea può essere propagato con il trasferimento di diversi animali transgenici per un piatto di nuovo ad ogni generazione, questo deve essere eseguita utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza se il marcatore è fluorescente.

Discussione

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di:
- Iniettare direttamente nel centro della gonade
- Non iniettare liquidi troppo
- Lavorare velocemente per evitare essiccazione.

Se si verificano problemi con l'ago, come si è rotto troppo grande, è meglio rifare un ago fresco, piuttosto che cercare di iniettare con meno di aghi ideale.

La generazione di vermi transgenici ha molte applicazioni quali:
- Identificazione di geni mutanti, nel metodo chiamato soccorso trasformazione ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef	Hulle 10S	elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm		Fisher Scientific	12-548-A
Coverglass 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Coverglass 22x50 mm		Fisher Scientific	12-545-E
100 ul Capillary		VWR international	53432-921
Glass Capillary for Needles	"Kwik-Fil"	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Needle Puller	Tool	Narishige International	Model PP-830
microINJECTOR System		Tritech Research, Inc.	MINJ-1000	Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence	Microscope	Nikon Instruments	SMZ800
Dissecting	Microscope	Nikon Instruments	SMZ645