הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Summary

וידאו זה מדגים את הטכניקה של microinjection לתוך בלוטת המין של C. elegans כדי ליצור חיות טרנסגניות.

Abstract

טראנסגנטי Caenorhabditis elegans ניתן ליצור בקלות דרך microinjection של פתרון ה-DNA פלסמיד לתוך בלוטת המין ^1. ה-DNA פלסמיד מארגן מחדש כדי ליצור concatamers extrachromosomal כי הם ירשו ביציבות, למרות שלא כמו כרומוזומים בפועל ² עם יעילות זהה. הגן של עניין הוא שיתוף מוזרק עם סמן פנוטיפי ברור, כגון רול-6 או ה-GFP, כדי לאפשר בחירה של בעלי חיים מהונדס תחת מיקרוסקופ לנתח. הגן אקסוגני יכול להיות מבוטא מן האמרגן שלו דובר ללימודי לוקליזציה הסלולר. לחלופין, transgene יכול להיות מונע על ידי האמרגן שונה ברקמות ספציפיות על מנת להעריך את התפקיד של המוצר גנים תא רקמה מסוימת. טכניקה זו יעילה כוננים ביטוי הגן בכל רקמות של C. elegans למעט העובר germline או בתחילת ^3. יצירת חיות טרנסגניות הוא מנוצל באופן נרחב עבור מגוון של פרדיגמות הניסוי. וידאו זה מדגים את הליך microinjection לייצר תולעים מהונדס. יתר על כן, הבחירה ותחזוקה של יציבה מהונדס C. elegans קווי מתואר.

Protocol

הביטוי פלסמיד בנייה

שני פלסמידים נדרשים: אחד עבור הביטוי רקמות ספציפיות של הגן ריבית שנייה כסמן שינוי לבחירה.

ניסיוני פלסמיד

1. בחר האמרגן אשר באה לידי ביטוי סוג רקמה / תא של עניין, למשל, עצב או שריר ספציפי האמרגן. אם אחד הוא להביע גנים מרובים בתוך הרקמה באותו קלטת האמרגן פלסמיד במערכת Gateway (Invitrogen) יכול לשמש. גישה זו מאפשרת החדרת גן כל הזרם עניין של האמרגן על ידי ⁴ שיבוט ^{recombinational.} ככלל, 2-5 קילו של רצפים הזרם מספיקה יש ביטוי נכון ומדויק.
   
   
2. CDNA של הגן של עניין ניתן לשכפל בשתי דרכים:
   1. שיבוט קונבנציונלי באמצעות אנזימי הגבלה.
   2. עבור שיבוט Gateway, הוא מוגבר באמצעות PCR primers המכילים את עו"ד Gateway רצף B recombinational. CDNA הגברה הוא recombined הראשון לתוך pDONR201 התורם וקטור כדי ליצור את וקטור הערך ולאחר מכן הפך E. coli זן DH5a. להלן מבחר של recombinants מוצלח ומיני הכנה הבידוד של ה-DNA, וקטור הכניסה recombined לתוך וקטור המכיל מקדם היעד כדי ליצור את הביטוי פלסמיד. פרטים על שיבוט recombinational זמינים ידנית או Gateway Invitrogen או קולדוול et al. ^5.

דה מרקר לבחירה פלסמיד

דוגמאות של פלסמידים סמן מהונדס כוללים רול-6 או שימוש מקדם קיר השרירים בגוף UNC-54 לנהוג ביטוי חלבון פלואורסצנטי. אלה פלסמידים סמן זמינים בדרך כלל מתוך הקהילה מחקר על פי דרישה.

Microinjection של C. elegans

הכנה

1. ביצוע בידוד DNA של שני פלסמידים, כי הם להיות מוזרק. לכמת אותם ומערבבים יחד ביחס של 1:1 של 50 ng / μl כל אחד.
   
   
2. הכנת כריות אגר:
   1. הפוך את פתרון 2% agarose במים; חום או במיקרוגל עד שהיא נמסה.
   2. הגדר את מספר 22 x 50 מ"מ על המשקפיים לכסות benchtop.
   3. בעזרת פיפטה פסטר, במקום ירידה של agarose נמס על כוס אחת לכסות מיד במקום זכוכית העטיפה השנייה על ירידה בזווית של 90 על הראשונה. חזור על מספר המשקפיים לכסות אחרים. הקוטר של הדיסק שטוח של agarose צריך להיות בין 15-20 מ"מ.
   4. לאחר agarose יש הקרושה (זה לוקח רק רגעים), להסיר את הזכוכית המכסה ולאפשר כרית אוויר יבש לגמרי (כמה שעות בלילה).
   5. חנות כריות בתא זכוכית לכסות בטמפרטורת החדר.
      
      
3. הפוך את מעמיסים מחט פתרון ה-DNA:
   
   מעמיסים מחט נוצרות 100 צינורות נימי μl כי מחוממים באמצע מעל להבה פתוחה ומשך במהירות אורך כ פעמיים שלהם. שני חצאים הם התיז מלבד פעם את צינור נימי מתקרר. לאגור 10-20 מעמיסים מחט להזרקה. חנות זקוף מתלה צינור microcentrifuge. היזהר שלא לדקור את עצמך על הנקודות.
   
   
4. הפוך את המחטים microinjection:
   
   המחט עשוי צינור נימי מיוחד המכיל סיב זכוכית פנימית; נימה זו משמשת הפתיל עבור פתרון ה-DNA. אלה משכו במחשב מחט חולץ. אנו משתמשים PP-830 Narishige חולץ עם הגדרה חום של 24.8. כמה מחטים נמשכים בכל פעם מאוחסנים בקופסת פלסטיק קטנה. מחטים מרובות ניתן בקלות "רכוב" על פיסת פלסטלינה עבור אחסון לטווח ארוך.
   
   
5. קצה המחט "פורעי":
   
   קצה המחט microinjection נמשך קנס כך שהיא למעשה סגורה על זה בסוף וצריך שבור פתוח באמצעות רסיסים קטנים של זכוכית המכסה. אלה מוכנים על ידי לפפה 18 x 18 מ"מ זכוכית לכסות במגבת נייר ובעדינות הפעלת לחץ עד שהוא נשבר לחתיכות מספר. שברי גודל שימושי כ 3 x 4 מ"מ.
   
   
6. לגדול פרא (N2) תולעים סוג לשלב הבגרות המוקדמת להזרקה באמצעות נהלים תקן ^6. הכן על 100 מבוים כהלכה תולעים / לבנות מוזרק.

נוהל

1. פתח את השסתום הראשי על טנק הליום המחובר זרוע microinjection המחט מחזיק. סגור את שסתום הרגולטור על מנת לאפשר הגז כדי להזין את הקו, להביא את הלחץ עד 35 psi. שימו לב כי גז ניתן לשחרר באמצעות דוושת רגל.
   
   
2. הכנס מטעין מחט לתוך צינורות pipetter תקן הפה (נמצא במיכלים של צינורות זכוכית נימי) וכן להכין כמות קטנה של התערובת פלסמיד (~ 1 μl).
   
   
3. מטעין המחט ממוקם בזהירות לתוך האחורי של מחט מזרק ונוסף בעדינות לאורך כל הדרך באורך שלהמחט עד התנגדות מורגשת. לגרש את פתרון ה-DNA על ידי נושבת בעדינות, ולאחר מכן להסיר את מטעין.
   
   
4. הכנס את המחט בזרוע microinjection, נזהר כדי למקם אותה בתוך אטם גומי קטן הפנימי.
   
   
5. מקום שבר מחט שבירת הכוס לכסות על קצה אחד של משטח אגר. מכסים את הרסיס, כמו גם את פני השטח של כל כרית אגר, עם שמן halocarbon. הנח את כרית אגר על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה.
   
   
6. מקמו את המחט במרכז השדה צפייה באמצעות המטרה 4X ואת התאורה שדה בהיר, אבל עדיין לא הורידו אותה לתוך השמן. כמו כן, עמדת הקצה הפנימי של רסיס של זכוכית לכסות במרכז, ולאחר מכן להתמקד בה (עדיין משתמש המטרה 4X). מנמיכים את מחט לתוך השמן, להביא אותו לתוך המטוס מוקד כמו רסיס של זכוכית המכסה. תרים את ההגדלה ידי מעבר המטרה 40X. מקדו מחדש על סף שבר ואת למקם את קצה המחט, במידת הצורך.
   
   
7. כדי לפתוח את קצה מחט הזריקה, דחיפה בעדינות את המחט על קצה הזכוכית המכסה שבר, ואילו באותו זמן החלת פולסים קצרים של גז באמצעות דוושת רגל. המחט יהיה שבור מספיק פתוח כאשר טיפות קטנות של נוזל לברוח לסוף המחט. זרימת נוזל עודף בשל פתיחת גדולה מדי אינו רצוי, שכן הוא יהרוג את החיות.
   
   
8. הסר את כרית אגר משלב ידי הרמת את המחט, אבל לא לשנות את ה-X או ציר Y המיקום. החלק את הבמה החוצה מתחת למחט, הסר את פנקס אגר ומניחים אותו על גבי מיקרוסקופ לנתח. העברת תולעת על כרית, מתחת לפני השטח של השמן. אם תולעת מתפתלת, שבץ בעדינות עד שהוא קשר את הפנקס אגר. התולעת לח צריך לדבוק agarose יבש.
   
   
9. הזרקה
   1. במהירות למקום לרפד אגר בחזרה אל הבמה, מרכוז תולעת בתחום התצוגה.
   2. מנמיכים את מחט לתוך המטוס אותו להתמקד כמו התולעת.
   3. החלף את המסננים כדי הופמן תאורה (סוג של מסנן ניגודיות). זה מאפשר פרט המורפולוגי של התולעת להיות גלוי. אם Nomarski / אופטיקה DIC זמינים על היקף הפוך זה יעבוד גם. שימוש המטרה 40X, להתמקד במרכז "מגורען" סינסיציאלי של בלוטת המין התולעת, מתחת דפוס "חלת דבש" של גרעיני נבט (לבחור לפי אשך ממוקם בצד של התולעת מול מחט).
   4. לכוונן את המיקום של המחט עד קצה גם בפוקוס (את המטוס כמו "גרעיניות" את בלוטת המין).
   5. הכנס בעדינות את המחט למרכז אשך ולהחיל הדופק קצרה של לחץ הגז לגרש טיפה או שתיים של דנ"א לתוך הזרוע בלוטת המין. אתה צריך לראות גל של התפשטות הנוזל על פני אשך הדיסטלית. אל תניחו נוזלי יותר הוא טוב יותר, שכן נוזלי מדי יכול לזרום לתוך העיקול הפרוקסימלי של הזרוע בלוטת המין, אשר יכול לסגור ייצור הביצית. במידת האפשר, בהתאם למיקום של התולעת, להזריק הזרוע בלוטת המין השני באותו אופן.
   6. חשוב לעבוד במהירות תוך הזרקת תולעת, כפי שהוא יכול בקלות ליבש. ההחלטה להזרים הזרוע בלוטת המין השני הוא תלוי כמה מהר אתה יכול מחדש לתפקיד תולעת המחט. התהליך כולו רצוי לקחת פחות מ 1-2 דקות.
      
      
10. הסר את מכסה זכוכית משלב ולמקם אותו על היקף הניתוחים. החל 1μl של M9 חיץ (22mm KH ₂ PO _4, 42mM Na ₂ HPO _4, NaCl 85mm, 1mm MgSO ₄₎ ישירות על גבי התולעת מוזרק (זו עלולה להביא לפעולה והטביע את קצה פיפטה מתחת לפני השטח של הנפט halocarbon). המאגר אמור רעננותם התולעת, הוא יהיה אז לצוף מעל פני השטח משטח agarose. מעבירים את התולעת לצלחת קבוע באמצעות לאסוף תולעת. כרית agarose ניתן לעשות שימוש חוזר כמה פעמים עד שזה יותר הפך רווי מדי עם חיץ התולעים כבר לא לדבוק.

טראנסגנטי בחירה

1. תולעים מוזרק, דור P _0, מועברים הפרט, צלחות טרי seeded bacterially (60 מ"מ) מותר להתרבות. בדרך כלל, בעלי חיים מוזרק מודגרת על 20 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים עד הצאצאים להופיע.
   
   
2. הצאצאים ₁ F הם נצפו ראיות של הסמן מהונדס (כגון פלואורסצנטי) באמצעות stereomicroscope ניאון. כל נושא ניאון, F _1, בעלי חיים משובטים היא בנפרד לצלחת חדשה (מאז צאצאים של F כל ₁ נחשבים קו מובהק). F ₁ הרמפרודיטים מותר להתרבות. שוב, זה מתבצע בדרך כלל על 20 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים עד הצאצאים להופיע.
   
   
3. דור ₂ F הוא ציין לבעלי חיים מהונדס גם כן. F ₂ חיות ירשו ולהביע את מערך מהונדס נחשבים קו "יציב".
   
   הערה: לכל ₁ F רחובגיל ייתכנו חיים מהונדס רבים, אך הם אינם יציבים. רוב F ₁ חיות טרנסגניות לא יופצו לתוך F ₂ קווי יציב.
   
   הערה: כדי לשלוט על השתנות במספר עותק הגן, ליצור מינימום של שלוש שורות יציב עצמאית לכל לבנות מוזרק.
   
   
4. כל שורה יציבה עצמאי צריך להישמר כפי בשורה נפרדת של תולעים. כל שורה יכולה להיות מופצות על ידי העברת בעלי חיים מהונדס מספר לוחית חדשה בכל דור, זה חייב להתבצע באמצעות stereomicroscope פלורסנט אם את הסמן לבחירה הוא פלורסנט.

Discussion

כשעושים הליך זה, חשוב לזכור:
- להזריק ישירות למרכז אשך
- לא להזריק יותר מדי נוזלים
- עובדים מהר כדי למנוע dessication.

אם אתה נתקל בבעיות עם מחט, כגון זה נשבר גדול מדי, עדיף מהדורה מחודשת מחט טריים, במקום לנסות להזריק עם מחט פחות אידיאלי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef	Hulle 10S	elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm		Fisher Scientific	12-548-A
Coverglass 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Coverglass 22x50 mm		Fisher Scientific	12-545-E
100 ul Capillary		VWR international	53432-921
Glass Capillary for Needles	"Kwik-Fil"	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Needle Puller	Tool	Narishige International	Model PP-830
microINJECTOR System		Tritech Research, Inc.	MINJ-1000	Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence	Microscope	Nikon Instruments	SMZ800
Dissecting	Microscope	Nikon Instruments	SMZ645