Cuantificación de microorganismos ambientales y virus utilizando qPCR

1. muestras

1. Recoger el suelo con una barrena o pala a una profundidad determinada. Recogida de suelo de la rizosfera, sólo recoger suelo de 7 mm alrededor de la raíz de la planta, por golpear el exceso de suciedad de la raíz y raspar el suelo deseada en un barril de la colección.
2. Coloque una botella de Nalgene estéril en palillo de la inmersión. Sujete el extremo del palo y recoger agua sumergiendo la botella. Coloque la botella en una hielera con hielo.
3. Transferencia de muestras al laboratorio.

2. los ácidos nucleicos extracción

1. Para aislar microorganismos a partir de las muestras recolectadas y extraer DNA o RNA de ellos, por favor ver el video de Zeus Ciencias de la educación en la extracción de ácidos nucleicos de comunidad.

3. transcripción reversa

1. Si el material genético se ensayaron es ARN, debe utilizarse para generar ADN complementario (ADNc) mediante transcripción inversa antes de proceder a la PCR. Para obtener más información, consulte educación JoVE video de RT-PCR.

4. configuración del qPCR

1. Recuperar reactivos almacenados a-20 ° C y descongelarles en hielo o a temperatura ambiente dentro de una campana limpia. Reactivos utilizados en este ejemplo son la mezcla de reacción de qPCR (depende de la máquina de qPCR utilizado; contiene DNA polimerasa), cartillas de avance y retroceso y la sonda TaqMan. Las secuencias de la cartilla y la sonda están diseñadas con secuencias específicas en el organismo que se se enumeran. Se refieren a la literatura actual para encontrar secuencias de interés. En este ejemplo, se utilizará el sistema de reactivos Roche Light Cycler 480 puntas mezcla. Virus de moteado suave del pimiento se enumeran en la muestra de agua. ^1.2 ver tabla 1 para la cartilla y sonda de secuencias.
2. Deshielo extraído (c) el ADN de las muestras y el control positivo ADN (que se compone de secuencias específicas del organismo clonadas en plásmidos bacterianos) a temperatura ambiente.
3. Preparar una plantilla de 96 celdas de tabla que se asemeja a la placa de 96 pocillos qPCR. Etiqueta de cada célula con la que se cargará sobre la placa de reacción. Incluyen reacciones para cada muestra y estándar por triplicado, así como para el control positivo y control negativo, como una reacción no-DNA.
4. Calcular los volúmenes de reactivo necesarios para una reacción "master mix", que incluye todos los reactivos que son constantes entre las reacciones, basadas en las instrucciones del fabricante y de la literatura. Preparar suficiente mezcla maestra para reacciones por triplicado para todas las muestras y controles y un 10% adicional para tener en cuenta errores de pipeteo. Para un maestro muestra mezcla receta, refiérase a la tabla 2.
5. Trabajando dentro de una campana de limpieza, una vez que todos los reactivos son completamente descongelados, agregar la cantidad calculada de cada reactivo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL enlace de bajo para crear mix master. Vórtice y brevemente minicentrifuge cada reactivo antes de agregar. Cambiar la punta de la pipeta entre cada reactivo para evitar contaminación y asegurar concentraciones correctas. Después se han añadido los reactivos, vortex y minicentrifuge el tubo con la mezcla principal para asegurar la homogeneidad.
6. Alícuota del volumen adecuado de mezcla principal en cada uno señalado en la placa PCR de 96 pocillos.
7. Añadir el volumen adecuado de muestra de ADN (c), plásmido de control positivo y control negativo (agua grado molecular) en los pocillos designados.
8. Una vez que se han añadido todas las muestras y los controles, placa del sello con papel de aluminio del lacre. Utilice una herramienta de sellado para empujar el aire hacia fuera de debajo de la hoja y evitar burbujas. Corte los bordes de la hoja con cuidado.
9. Centrifugar la placa de 96 pocillos sellada en una centrifugadora con un sostenedor de la placa para obtener la mezcla en el fondo de cada pozo. Asegúrese de utilizar una placa de contrapeso para que la centrífuga equilibrará adecuadamente mientras gira. Pulse centrifugar a 1000 rpm y luego dejó la centrífuga lentamente deje sin frenos.

5. operación de qPCR

1. Coloque la placa de 96 pocillos sellada en qPCR máquina. Asegúrese de que la máquina indica que está listo para comenzar.
2. Siga las instrucciones de máquina de qPCR para ingresar correctamente toda la información necesaria por el software, luego fije el qPCR máquina para funcionar.
3. Una vez finalizada la máquina funcione, el software será capaz de utilizar las concentraciones conocidas de control positivo para calcular la cantidad de cDNA en cada reacción. Entonces se puede calcular la cantidad de virus en la muestra original basada en la dilución, filtración, concentración, amplificación y procesos de extracción para obtener la muestra de ADN.

Reactivo de	Secuencia (5' → 3')	Volumen (μL / pozo)	Concentrado final
Primer avance	GAGTGGTTTGACCTTAACGTTTGA	2.25	900 nM
Primer revés	TTGTCGGTTGCAATGCAAGT	2.25	900 nM
Punta de prueba	FAM-CCTACCGAAGCAAATG-BHQ1	1.0	200 nM

Tabla 1. Secuencias de la cartilla y la sonda de muestra para la detección de virus del moteado suave de la pimienta.

Reactivo de	Volumen (μL / pozo)	Número de pozos	Master Mix volumen (μL)
Mezcla de LC 480	12.5	26	325
Molecular H2O	4.5		117
Primer avance	2.25		58.5
Primer revés	2.25		58.5
Punta de prueba	1.0		26
Total	22.5		585

Tabla 2. Volúmenes de reactivo para cada reacción y mezcla principal.