Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant EY 14.990.

Parte 1: Dissecção e isolamento de células Bipolar <ol><li> Preparar soluções listadas na Tabela 2; O pH de toques &quot;(externa) de soluções deve ser ajustado para 7,4 com NaOH e do pH da solução interna deve ser ajustado para 7,2 com CsOH. Proteger a solução interna da luz com papel alumínio e mantenha-o a 4 ° C até o uso; </li><li> Dark-se adaptar um peixinho dourado, pelo menos, 30 minutos antes da dissecção; </li><li> Enquanto o animal se adapta-escuro, preparar 5 mL de hialuronidase (V tipo hialuronidase, 1100 unidades / mL em baixo Ca 2 + Ringer; Sigma, St. Louis, MO) e 10 mL de L-cisteína (0,5 mg / mL em Ca 2 + baixo) da campainha as soluções e pesar os papaína (pó liofilizado, 40 unidades / mL; Sigma, St. Louis, MO) por 5 mL da solução de digestão; </li><li> Euthanize o goldfish por decapitação rápida com uma tesoura cirúrgica e destruir o cérebro ea medula espinhal com uma lâmina de bisturi # 11; </li><li> Remove os olhos, destruindo os músculos extra-oculares com a ajuda de uma pinça # 7 curvas Dumont e cortar o nervo óptico com tesoura de íris; </li><li> Lugar lâmpada um olho em um pedaço de papel de filtro e punção do limbo escleral com a ponta de uma lâmina de bisturi # 11; </li><li> Introduzir a lâmina de uma tesoura Vannas dentro do todo perfurado e cortar todo o segmento anterior de distância; </li><li> Coloque um pequeno pedaço de papel de filtro em cima do copo restante óptica e exercer alguma pressão, a fim de ter o papel de absorver com humor vítreo; </li><li> Levante o papel de filtro com a retina ligado a ele e cortar o nervo óptico com um par de tesouras Vannas; </li><li> Coloque o papel de filtro contendo a retina em um prato de 35 milímetros de plástico cultura com solução de hialuronidase e descolar a retina do papel de filtro com a ajuda de uma pinça # 7 Dumont; </li><li> Cortar a retina em 4-6 pedaços com metade de uma lâmina de aço carbono industrial único gumes e deixe descansar na solução de hialuronidase por 20 minutos; </li><li> Enquanto espera por hialuronidase para entrar em vigor, adicionar 5 mL da solução de L-cisteína ao papaína e deixe descansar até que o líquido se torna transparente (aproximadamente 5-10 minutos); </li><li> Lave os pedaços de retina 3x de baixa Ca 2 + Ringer e deixá-los sentar-se na solução de papaína por 30-35 minutos; </li><li> Lave os pedaços de retina 3x de baixa Ca 2 + Ringer e armazená-los até o uso a 4 ° C em um prato de cultura 35 milímetros de plástico contendo Ca 2 + baixo de Ringer; </li><li> Dissociar as células, coloque um pedaço de retina em um tubo de microcentrífuga contendo 500 mL de baixo Ca 2 + Ringer e lentamente triturar a retina pipetando cima e para baixo com uma dissociação de vidro pipeta, cuidadosamente para não produzir quaisquer bolhas de ar. Pipetas dissociação são fabricados por aquecimento até a ponta de uma pipeta Pasteur de vidro com um bico de Bunsen e ligeiramente dobrá-la com a ajuda de uma pinça anatômica; </li><li> A placa de células isoladas, adicionando uma gota da suspensão da retina a um home-made câmara de gravação previamente preenchidos com 2 mL de Ca 2 + baixo Ringer. A câmara consiste na metade inferior de uma placa de cultura de 35 mm de plástico com um todo circular no meio e uma lamela de vidro circular de 1,78 do índice de refração (PlanOptik, Alemanha), colado ao fundo com um elastômero de silicone (Sylgard 184; Dow Corning , Midland, MI). </li></ol> Parte 2: Bipolar Carregando Celular e Wash Out TIRF imagens das vesículas sinápticas é melhor realizado através de um microscópio TIRFM objetivo do tipo com um objetivo NA muito alta e uma câmera sensível. Para nossos experimentos, optamos por usar um 1,65 NA objetivo (x100 Apo O HR, NA 1,65, Olympus, Japão) com um EMCCD (Cascade 512B, Roper Scientific, Tucson, AZ). O uso do objectivo NA muito elevado exige a utilização de lamínulas de vidro de alta refração e fluido de imersão (di iodometano com enxofre). Nas nossas condições, luz de excitação está limitado a um campo de decaimento exponencial com um comprimento constante de aproximadamente 50 nm. <ol><li> Adicionar uma gota de líquido de alta índice de refração (série M, índice de refração = 1,7800, Cargille Labs, Cedar Grove, NJ) para a objetiva do microscópio; </li><li> Coloque a câmara de gravação cuidadosamente em cima da objetiva do microscópio e cuidadosamente montagem eletrodo terra e tubo de saída para superfusão câmara; </li><li> Deixe câmara de sentar-se no microscópio por 10-20 minutos para permitir que as células a afundar e aderir ao fundo; </li><li> Nesse meio tempo, preparar 5 mL de uma trolox 1mM ® ácido ((±)- 6-hidroxi-2 ,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxílico; Sigma, St. Louis, MO solução) em alta K + Ringer . Sonicate até à dissolução; </li><li> Prepare 15 mL de solução ADVASEP-7 lavagem: 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, St. Louis, MO) em baixo Ca 2 + Ringer. Note-se que ADVASEP-7 uso é opcional e pode ser omitido, se desejar; </li><li> Purgar o li superfusãones e adicione solução ADVASEP-7 de lavar roupa, Ca 2 + baixo toque e controle de campainha para o sistema superfusão; </li><li> Puxar carga pipetas de paredes finas de vidro de borosilicato (Kwik-Fil ® TW150-3; WPI, Sarasota, FL). Resistências Puffer pipeta estão na faixa de 1,5-2,5 mohms; </li><li> Prepare o FM1-43 ® (N-(3-triethylammoniumpropyl) -4 - (4 - (dibutylamino) styryl) pyridinium dibrometo &quot;, embalagens especiais&quot;; Invitrogen, Carlsbad, CA) soluções. Primeiro, faça um estoque de 1 mm, adicionando 160 mL de água destilada para um frasco (100 mg) de FM1-43 ®. Este estoque pode ser mantido a 4 ° C por até uma semana. Em seguida, adicionar 5 mL de FM1-43 ® a 1 mL de alto K + + Ringer 1mM trolox ®. Proteger a solução da luz com papel alumínio e mantenha-o a 4 ° C até o uso; </li><li> Ligue o microscópio de luz brilhante em campo e procurar células intactas bipolar. Ligeiramente toque no microscópio para se certificar de que os neurônios estão firmemente ligado ao fundo da câmara; </li><li> Posição da caneta superfusão próximo à célula de interesse e de forma contínua perfundir a preparação com baixo Ca 2 + Ringer; </li><li> Desligue as luzes da sala e adicionar um longo vermelho filtro passa (isto é, RG630, Schott, Alemanha) para o caminho óptico para minimizar a excitação do corante FM; </li><li> Preencha uma pipeta de carga com 10 mL da solução corante FM, montar a pipeta na micromanipulador e inferior da pipeta sobre o preparo, sem sobrepressão até que esteja no mesmo plano focal como a célula bipolar você deseja carregar. Certifique-se de ter pelo menos dois titulares eletrodo: o utilizado para o corante FM não pode ser usado para patch clamping, ou então ele pode contaminar a solução intracelular; </li><li> Posição da abertura do soprador a uma distância de cerca de 10 mM do terminal axônio, por sua vez o sistema superfusão off e puff a solução corante por 10 segundos girando a sobrepressão pipeta sobre; </li><li> Vire a sobrepressão fora e, sem mover a pipeta, aguarde 30 segundos; </li><li> Vire o superfusão e tomar banho na câmara em ADVASEP-7 solução por 5 minutos. Nesse meio tempo, retire a pipeta puffer do banho; </li><li> Depois de cinco minutos, mude para baixo Ca 2 + campainha e perfundir a câmara por 25-30 minutos para permitir a remoção de corante em excesso. </li></ol> Parte 3: Patch de fixação e TIRFM Imagem <ol><li> Enquanto a preparação é lavar para fora, puxe pipetas patch da espessura de paredes de vidro de borosilicato (B150-86-10; Sutter Instrument Company, Novato, CA). Resistências remendo pipeta estão na faixa de 80-10 mohms; </li><li> Depois de lavar estiver concluída, coloque o axônio terminal no centro do campo de visão; </li><li> Preencha uma pipeta patch com 7μL de solução interna, toque a pipeta para se livrar de bolhas de ar, revestimento da pipeta com cera dental fundido (cera pegajosa; Kerr Corporation, Orange, CA) e montá-la na micromanipulador; </li><li> Vire a sobrepressão pipeta sobre e inferior a pipeta lentamente sobre a preparação. Verifique a resistência da pipeta no amplificador e deslocamentos pipeta correto e capacitância com os controles do amplificador respectivos; </li><li> Mudar o superfusão para controlar Ringer. Para criar um gigaseal entre a pipeta ea célula, ligeiramente tocar a ponta do eletrodo contra o corpo da célula e ligue a sobrepressão pipeta off, enquanto gentilmente a aplicação de pressão negativa para o eletrodo; </li><li> Enquanto fechado, escolha &quot;toda célula&quot; modo no amplificador e definir a cela potencial de -60 mV; </li><li> Escolha uma região de interesse com o software de imagem que engloba o axônio terminal inteiro, ligar a luz de campo claro off e, por breves instantes, expondo (30 ms) do terminal para o laser nm 488, encontrar o plano certo para TIRF focal de imagem; </li><li> Invadir a célula usando o &quot;zap&quot; comando do amplificador ao aplicar pressão ligeiramente negativa para a pipeta; </li><li> Correto para capacitância da célula e resistência em série, e depois aplicar o protocolo de tensão de interesse, enquanto movimento de imagens de vesículas sinápticas. É nesta fase importante ter o protocolo de tensão sincronizada com a taxa de quadros da câmera. No nosso caso, cada quadro é de 30 ms de comprimento, de modo a variações de tensão ocorrem em múltiplos desse valor (ou seja, a cada 300 ms ou 10 quadros); </li><li> Espere pelo menos 40 segundos entre ensaios para permitir a recuperação; </li><li> Para verificar a posição de fitas sinápticas, tirar fotos ao girar o laser nm em 561. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1305/fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1: A configuração experimental. Um laser de 488 nm (azul) é voltado para a periferia do plano focal posterior da objetiva e sofre reflexão interna total quando ele atinge o vidro aquoso interface de médio porte. O campo eletromagnético gerado pelo feixe refletido excita o fluoróforo carregado no vesículas sinápticas mais próximo do bottom da câmara de vidro, que então fluorescência (verde). A luz fluorescente é então guiado ao olho do observador (representado) ou a uma câmera CCD. O potencial de membrana das células imaged é controlado simultaneamente por patch-aperto-los. Esta abordagem permite o estudo da relação entre os sinais de entrada (a tensão de membrana) ea saída neuronal (exocitose). <img src="/files/ftp_upload/1305/fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2: Resultados típicos. Esquerda: Imagem de campo claro de uma célula isolada goldfish bipolar. Superior direito: image TIRF das vesículas sinápticas no terminal axonal célula bipolar carregado com FM 1-43 ® e fotografada com o laser de 488 nm (FM corante). Parte inferior direita: imagem do terminal mesmo depois remendar o celular e as imagens do terminal axonal com o laser nm 561. Fitas sinápticas são rotulados pela rodamina baseado em peptídeo de ligação de olho de lombo (Rpep_rhod). Tabela 1: Reagentes e equipamentos específicos. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Tipo </td><td> Fabricante </td><td> Catálogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> - </td><td> Air Tabela </td><td> Newport Corporation </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> IX70 </td><td> Microscópio invertido </td><td> Olimpo </td><td> - </td><td> Equipado com uma lâmpada de tungstênio para campo claro e uma porta de abertura lateral para TIRF </td></tr><tr><td> TH4-100 </td><td> Fonte de energia da lâmpada </td><td> Olimpo </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> FF498_581-DI01 </td><td> Dichroic Filtro </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> NF01-405_488_568 </td><td> Filtro de emissão </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> X100 Apo O HR </td><td> Objetivo </td><td> Olimpo </td><td> - </td><td> NA 1,65 </td></tr><tr><td> RG630 </td><td> Red Filtro de Vidro </td><td> Schott </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Laser 488 nm </td><td> Coerente </td><td> - </td><td> Use o mínimo de energia </td></tr><tr><td> - </td><td> Obturador </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D1 </td><td> Driver de obturador </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Laser 561 nm </td><td> Melles Griot </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Obturador </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D3 </td><td> Driver de obturador </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Kit de pressão de perfusão </td><td> Sistema superfusão </td><td> Automatizar Scientific </td><td> 04/09 </td><td> - </td></tr><tr><td> Pen perfusão </td><td> Sistema superfusão </td><td> Automatizar Scientific </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> ValveLink 8 </td><td> Controlador do Sistema superfusão </td><td> Automatizar Scientific </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Cascade 512B </td><td> EM CCD Camera </td><td> Roper Scientific </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Metamorph 7,1 </td><td> Software de imagem </td><td> Os dispositivos moleculares </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> EPC-9 </td><td> Amplificador de patch clamp </td><td> Heka Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Pulso </td><td> Software amplificador </td><td> Heka Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MP-285 </td><td> Micromanipulador </td><td> Instrumento Sutter </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Titular eletrodo </td><td> Heka Elektronik </td><td> - </td><td> Por 1,5 mm de diâmetro externo de vidro, 2 unidades </td></tr><tr><td> Kwik-Fil ® TW150-3 </td><td> Capilar de vidro de borosilicato </td><td> WPI </td><td> - </td><td> Sem filamento </td></tr><tr><td> B150-86-10 </td><td> Capilar de vidro de borosilicato </td><td> Instrumento Sutter </td><td> - </td><td> Com filamento </td></tr><tr><td> P-97 </td><td> Puller microeletrodo </td><td> Instrumento Sutter </td><td> - </td><td> Equipado com filamento caixa 3x3 e câmara ambiental </td></tr><tr><td> - </td><td> Pressão da bomba de ar de vácuo </td><td> Thomas Scientific </td><td> 7893B05 </td><td> Cria vácuo para remover líquidos de câmara e sobrepressão para pipetas </td></tr><tr><td> MatLab R2008a </td><td> Software de análise </td><td> MathWorks </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 353001 </td><td> 35 milímetros de plástico Pratos Cultura </td><td> Falcão </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Vidro alto índice de refração </td><td> PlanOptik </td><td> - </td><td> Índice de refração 488 nm = 1,78 </td></tr><tr><td> Série M </td><td> Líquido de elevado índice de refração </td><td> Cargille Labs </td><td> - </td><td> Índice de refração = 1,78 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Kit de silicone elastômero </td><td> Dow Corning </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glutationa </td><td> Tripeptídeo </td><td> Merck Química </td><td></td><td> Radica livrescavenger l </td></tr><tr><td> Hialuronidase </td><td> Enzima </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td> Tipo V </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> Aminoácidos </td><td> Fluka </td><td> 30090 </td><td> Ativa papaína </td></tr><tr><td> Papaína </td><td> Enzima </td><td> Fluka </td><td> 76220 </td><td> De Carica papaya </td></tr><tr><td> Trolox ® </td><td> Vitamina E solúvel </td><td> Sigma </td><td> 56510 </td><td> Scavenger de radicais livres </td></tr><tr><td> ADVASEP-7 </td><td> Sulfonado B-Ciclodextrina Derivativos </td><td> Sigma </td><td> A3723 </td><td> Reduz FM 1-43 ® fluorescência de fundo </td></tr><tr><td> FM 1-43 ® </td><td> Corante fluorescente </td><td> Invitrogen </td><td> T35356 </td><td> &quot;Embalagem Especial&quot; </td></tr><tr><td> Cera pegajosa </td><td> Pipeta agente de revestimento </td><td> Kerr Corporação </td><td> - </td><td> Diminui a capacitância pipeta </td></tr></tbody></table> Tabela 2: soluções fisiológicas utilizadas neste estudo. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Substância </td><td> Ca 2 + baixo Ringer </td><td> Controle de Ringer </td><td> Alto K + Ringer </td><td> Solução interna </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 mM </td><td> 120 mM </td><td> 97,5 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> 25 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,75 mM </td><td> - </td><td> - </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glutationa </td><td> 2 mM </td><td> 2 mM </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> * CH 3 CSO 3 S </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> TEACl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> ATP-Mg </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> GTP-Li </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Rpep-Rhod ** </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Volume </td><td> 200 mL </td><td> 100 mL </td><td> 5 mL </td><td> 100 L </td></tr></tbody></table> * Metanossulfonato Césio. ** Peptídeo de olho de lombo de ligação: rodamina + EQTVPVDLSVARDR-COOH (mw 1.997,75).

<ol>
	<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology.">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li><li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport,+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones.">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li><li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals.">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li><li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell.">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse.">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li></ol>

As vantagens do objectivo do tipo de microscopia TIRF são que 1) ele fornece seccionamento óptico excelente restringindo luz de excitação a uma estreita região dentro do plano focal da objetiva, minimizando assim o fora-de-foco de luz, 2) já que a luz cai exponencialmente com a distância , o movimento em uma direção vertical pode ser monitorado como uma mudança na intensidade de fluorescência, 3) a coleta de luz eficiente através do objectivo de alta abertura numérica 1,5. A principal desvantagem da técnica ...

imaging exocytosis in retinal bipolar cells with tirf microscopy

Refletância interna total de fluorescência microscopia (TIRF) é uma técnica que permite o estudo dos eventos que acontecem na membrana celular, pela imagem seletiva de moléculas fluorescentes que são mais próximos a uma substância de alto índice de refração, como vidro<sup&gt; 1</sup&gt;. Neste artigo, nós aplicamos essa técnica para exocitose imagem de vesículas sinápticas em células da retina bipolar isolado da retina goldfish. Esses neurônios são muito adequados para esse tipo de estudo, devido à sua terminais dos axônios de grande porte. Ao mesmo tempo patch clamping as células bipolares, é possível investigar a relação entre pré-sináptica de tensão e liberação sináptica<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Vesículas sinápticas no interior da célula bipolar terminais são carregados com um corante fluorescente (FM 1-43 ®) por co-puffing o corante e uma solução contendo um toque de alto K<sup&gt; +</sup&gt; Concentração para os terminais sinápticos. Este despolariza as células e estimula a endocitose e conseqüente captação de corante em vesículas glutamatérgica. Depois de lavar o excesso de corante afastado por cerca de 30 minutos, as células estão prontos para ser pinçada e correção representados simultaneamente com um laser nm 488. A solução da pipeta patch contém um peptídeo rodamina-base que se liga seletivamente ao olho de lombo sináptica fita de proteína<sup&gt; 4</sup&gt;, Assim, a rotulagem fitas especificamente quando os terminais são gravadas com um laser nm 561. Isso permite que a localização precisa das zonas de ativos e da separação dos sináptica de extra-sináptica eventos.

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Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Neste vídeo, demonstramos como rotular e visualizar exocitose das vesículas sinápticas única e tráfico de células da retina goldfish bipolar usando reflexão interna total de fluorescência microscopia (TIRF).

Exocitose imagem em células da retina com Bipolar Microscopia TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

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Research

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Biology

11.6K visualizações.  Yale University School of Medicine. Neste vídeo, demonstramos como rotular e visualizar exocitose das vesículas sinápticas única e tráfico de células da retina goldfish bipolar usando reflexão interna total de fluorescência microscopia (TIRF).

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Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Medição Exocitose em Neurônios Usando Labeling FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Biologia

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Longo prazo células de mamíferos utilizando imagens do Largo-Campo Microscopia

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Imagens de fluorescência com um nanômetros Precisão (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated exocytosis is fundamental for intercellular communication and is a key mechanism for the secretion of neurotransmitters, hormones, inflammatory mediators, and other compounds, by a variety of cells. At least three distinct mechanisms are known for regulated exocytosis: full exocytosis, where a single SG fully fuses with the plasma membrane, kiss-and-run exocytosis, where a single SG transiently fuses with the plasma membrane, and compound exocytosis, where several SGs fuse with each other, prior to or after SG fusion with the plasma membrane. The type of regulated exocytosis undertaken by a cell is often dictated by the type of secretory trigger. However, in many cells, a single secretory trigger can activate multiple modes of regulated exocytosis simultaneously. Despite their abundance and importance across cell types and species, the mechanisms that determine the different modes of secretion are largely unresolved. One of the main challenges in investigating the different modes of regulated exocytosis, is the difficulty in distinguishing between them as well as exploring them separately. Here we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran as an exocytosis reporter, and live cell imaging, to differentiate between the different pathways of regulated exocytosis, focusing on compound exocytosis, based on the robustness and duration of the exocytic events.

Here we detail a method for live cell imaging of regulated exocytosis. This method utilizes FITC-dextran, which accumulates in lysosome-related organelles, as a reporter. This simple method also allows distinguishing between different modes of regulated exocytosis in cells that are difficult to manipulate genetically.

Imagem latente FITC-dextrano como repórter por exocitose regulada

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...