Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH EY 14990.

Partie 1: Dissection et isolement des cellules bipolaires <ol><li> Préparer des solutions énumérées dans le tableau 2; Le pH de sonneries &#39;(extérieurs) des solutions devraient être ajusté à 7,4 avec NaOH et le pH de la solution interne devrait être ajusté à 7,2 avec CsOH. Protéger la solution interne de la lumière avec du papier aluminium et gardez à 4 ° C jusqu&#39;à leur utilisation; </li><li> Dark-adapter un poisson rouge pendant au moins 30 minutes avant la dissection; </li><li> Alors que l&#39;animal s&#39;adapte sombre, préparer 5 ml de hyaluronidase (V hyaluronidase type, 1100 unités / ml à faible Ca 2 + de Ringer; Sigma, St. Louis, MO) et 10 mL de la L-cystéine (0,5 mg / ml à faible Ca 2 + de Ringer) et peser les solutions papaïne (poudre lyophilisée, 40 unités / ml; Sigma, St. Louis, MO) pour 5 mL de la solution de digestion; </li><li> Euthanasier les poissons rouges par décapitation rapide avec des ciseaux chirurgicaux et détruire le cerveau et la moelle épinière avec une lame de bistouri n ° 11; </li><li> Retirer les yeux en détruisant les muscles extra-oculaires à l&#39;aide d&#39;une pince Dumont # 7 courbes et couper le nerf optique avec des ciseaux iris; </li><li> Ampoule oeil seul endroit sur un morceau de papier filtre et perforer le limbe scléral avec la pointe d&#39;une lame de bistouri n ° 11; </li><li> Introduire la lame d&#39;une paire de ciseaux Vannas l&#39;intérieur de la totalité percé et coupé l&#39;ensemble du segment antérieur de suite; </li><li> Placer un petit morceau de papier filtre sur le dessus de la tasse restante optique et exercer une certaine pression afin d&#39;avoir le papier tremper avec humeur vitrée; </li><li> Soulevez le papier filtre avec la rétine attachée à lui et couper le nerf optique d&#39;une valeur nominale de ciseaux Vannas; </li><li> Placez le papier filtre contenant de la rétine dans un plat de culture en plastique de 35 mm avec une solution de hyaluronidase et de décoller la rétine du papier filtre à l&#39;aide d&#39;une pince à épiler Dumont n ° 7; </li><li> Couper la rétine en 4-6 morceaux avec la moitié d&#39;un acier au carbone industrielles seul tranchant de lame et laisser reposer dans la solution de hyaluronidase pendant 20 minutes; </li><li> En attendant la hyaluronidase pour prendre effet, ajouter 5 ml de la solution de L-cystéine à la papaïne et laisser reposer jusqu&#39;à ce que le liquide devient transparent (environ 5-10 minutes); </li><li> Lavez les morceaux de la rétine 3x à faible Ca 2 + de Ringer et laissez-les reposer dans la solution papaïne pendant 30-35 minutes; </li><li> Lavez les morceaux de la rétine 3x à faible Ca 2 + de Ringer et de les stocker jusqu&#39;à utilisation à 4 ° C dans une boîte de culture en plastique de 35 mm contenant une faible Ca 2 + de Ringer; </li><li> Pour dissocier les cellules, mettre un morceau de la rétine dans un microtube contenant 500 ml de faible teneur en Ca 2 + de Ringer et lentement triturer la rétine par l&#39;aspiration et refoulement avec une pipette en verre de dissociation, soigneusement pour ne pas produire les bulles d&#39;air. Pipettes de dissociation sont fabriqués par chauffage jusqu&#39;à la pointe d&#39;une pipette Pasteur en verre avec un bec Bunsen et légèrement plier à l&#39;aide d&#39;une pince anatomique; </li><li> Assiette des cellules isolées en ajoutant une goutte de la suspension rétiniennes à un home-made chambre d&#39;enregistrement préalablement remplie avec 2 ml de faible teneur en Ca 2 + de Ringer. La chambre se compose de la moitié inférieure d&#39;un plat de 35 mm de culture en plastique avec un ensemble de circulaires au milieu et une lamelle de verre circulaire de 1,78 indice de réfraction (PlanOptik, Allemagne) collé au fond d&#39;un élastomère de silicone (Sylgard 184; Dow Corning , Midland, MI). </li></ol> Partie 2: Chargement cellule bipolaire et Wash Out FRBR imagerie des vésicules synaptiques est mieux réalisée à l&#39;aide d&#39;un microscope TIRFM objectif de type avec un objectif très élevé NA et une caméra sensible. Pour nos expériences, nous avons choisi d&#39;utiliser un objectif de 1,65 NA (Apo O x100 RH, NA 1,65, Olympus, Japon) avec une EMCCD (Cascade 512B, Roper Scientific, Tucson, AZ). L&#39;utilisation de l&#39;objectif très élevé NA nécessite l&#39;utilisation de lamelles de verre de haute réfraction et liquide d&#39;immersion (di-iodométhane avec du soufre). Dans nos conditions, la lumière d&#39;excitation est limitée à un champ de décroissance exponentielle avec une longueur constante d&#39;environ 50 nm. <ol><li> Ajouter une goutte de liquide à indice de réfraction élevé (série M, l&#39;indice de réfraction = 1,7800, Cargille Labs, Cedar Grove, New Jersey) à l&#39;objectif du microscope; </li><li> Placez la chambre d&#39;enregistrement attentivement sur le dessus de l&#39;objectif du microscope et soigneusement monter électrode de terre et le tuyau de sortie à la chambre de surfusion; </li><li> Laissez-chambre de s&#39;asseoir sur microscope pour 10-20 minutes pour permettre aux cellules de l&#39;évier et adhérer au fond; </li><li> En attendant, préparer 5 ml d&#39;une trolox 1mM ® ((±)- 6-hydroxy-2 ,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylique; Sigma, St. Louis, MO) solution dans K + haute Ringer . Soniquer jusqu&#39;à dissolution; </li><li> Préparer 15 ml de solution ADVASEP-7 à laver: 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, St. Louis, MO) à faible Ca 2 + de Ringer. Notez que ADVASEP-7 l&#39;utilisation est facultative et peut être omise si désiré; </li><li> Purger la li surfusionsolution de NDA et ajouter ADVASEP-7 à laver, faible teneur en Ca 2 + de la sonnerie et le contrôle de la sonnerie au système de surfusion; </li><li> Tirez de chargement pipettes de parois minces en verre borosilicate (Kwik-FIL ® TW150-3; WPI, Sarasota, Floride). Puffer résistances pipette sont dans la gamme de 1.5 à 2.5 MQ; </li><li> Préparer le FM1-43 ® (N-(3-triethylammoniumpropyl) -4 - (4 - (dibutylamino) styryle) pyridinium dibromure, &quot;emballage spécial&quot;; Invitrogen, Carlsbad, CA) des solutions. Tout d&#39;abord, faire un bouillon de 1 mM en ajoutant 160 uL d&#39;eau distillée dans un flacon (100 mg) de FM1-43 ®. Ce stock peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine. Ensuite, ajoutez 5 pi de FM1-43 ® à 1 mL de haute K + + ® Ringer 1mM trolox. Protéger la solution de la lumière avec du papier aluminium et gardez à 4 ° C jusqu&#39;à leur utilisation; </li><li> Tournez la lumière microscope en champ lumineux et rechercher des cellules bipolaires intacte. Légèrement appuyez sur le microscope pour s&#39;assurer que les neurones sont fermement attachés à la partie inférieure de la chambre; </li><li> Position du stylo surfusion proche de la cellule d&#39;intérêt et de permanence perfuser la préparation avec faible teneur en Ca 2 + de Ringer; </li><li> Éteignez les lumières ambiante et ajouter un rouge longue passe de filtre (c&#39;est à dire RG630; Schott, Allemagne) pour le chemin optique de minimiser l&#39;excitation du colorant FM; </li><li> Remplir une pipette de chargement avec 10 ul de la solution de colorant FM, monter la pipette dans le micromanipulateur et inférieure de la pipette sur la préparation sans surpression jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit au même plan focal que la cellule bipolaire que vous voulez charger. Assurez-vous d&#39;avoir au moins deux porte-électrodes: celui utilisé pour la teinture FM ne peut pas être utilisé pour patch clamp, ou bien elle peut contaminer la solution intracellulaire; </li><li> Position de l&#39;ouverture pompe à une distance d&#39;environ 10 um de la terminaison axonale, mettez le système hors tension et surfusion feuilletée la solution de colorant pendant 10 secondes en tournant la pipette sur la surpression; </li><li> Tournez la surpression off et, sans déplacer la pipette, attendre 30 secondes; </li><li> Tourner la surfusion et se baigner sur la chambre en ADVASEP-7 solution pendant 5 minutes. En attendant, retirer la pipette pompe de la baignoire; </li><li> Après 5 minutes, passez à faible teneur en Ca 2 + de la sonnerie et perfuser la chambre pendant 25-30 minutes pour permettre le retrait d&#39;un excès de colorant. </li></ol> Partie 3: patch clamp et imagerie TIRFM <ol><li> Alors que la préparation est lavage, tirez les pipettes de patch de parois épaisses en verre borosilicate (B150-86-10; Sutter Instrument Company, Novato, CA). Patch résistances pipette dans les 8-10 MQ large; </li><li> Après laver est terminée, placer le terminal de l&#39;axone dans le centre du champ de vue; </li><li> Remplir une pipette de patch avec 7μL de solution interne, appuyez sur la pipette pour se débarrasser des bulles d&#39;air, le manteau de la pipette avec de la cire fondue dentaires (cire collante; Kerr Corporation, Orange, CA) et le monter dans le micromanipulateur; </li><li> Tournez la surpression pipette sur la pipette et inférieur lentement sur la préparation. Vérifiez la résistance pipette dans l&#39;amplificateur et les décalages pipette correct et la capacité avec les commandes amplificateur respectif; </li><li> Mettez la surfusion de contrôler Ringer. Pour créer un gigaseal entre la pipette et la cellule, légèrement toucher la pointe de l&#39;électrode contre le corps cellulaire et tourner la surpression pipette hors tout doucement appliquant une pression négative à l&#39;électrode; </li><li> Bien scellés, choisissez &quot;cellule entière&quot; mode de l&#39;amplificateur et mis au cachot potentiel de -60 mV; </li><li> Choisissez une région d&#39;intérêt avec le logiciel d&#39;imagerie qui englobe toute la terminaison axonale, allumer la lumière hors champ clair et, par un bref exposé (30 ms), le terminal pour le laser à 488 nm, de trouver le bon plan de convergence pour la FRBR imagerie; </li><li> Pause dans la cellule en utilisant le «zapper» le commandement de l&#39;amplificateur tout en appliquant une pression légèrement négative à la pipette; </li><li> Correct pour la capacité des cellules et la résistance série, puis appliquer le protocole de tension d&#39;intérêt tout en imagerie du mouvement des vésicules synaptiques. Il est à ce stade important d&#39;avoir le protocole de tension synchrone à la cadence caméra. Dans notre cas, chaque image est de 30 ms de temps, donc les changements de tension se produisent dans des multiples de cette valeur (c&#39;est à dire, 300 ms ou 10 images); </li><li> Attendre au moins 40 secondes entre les essais pour permettre la récupération; </li><li> Pour vérifier la position des rubans synaptiques, prendre des photos tout en tournant le laser 561 nm sur. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1305/fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: Le montage expérimental. A 488 nm (bleu) laser est focalisé à la périphérie du plan focal arrière de l&#39;objectif et souffre réflexion interne totale quand il atteint le verre aqueuse d&#39;interface moyenne. Le champ électromagnétique généré par le faisceau réfléchi excite le fluorophore chargé dans les vésicules synaptiques plus proche de l&#39;Bottom de la chambre de verre, qui a ensuite fluorescence (vert). La lumière fluorescente est alors guidé vers l&#39;œil de l&#39;observateur (représenté) ou à une caméra CCD. Le potentiel de membrane des cellules imagée est contrôlée simultanément par les patch-clamp. Cette approche permet l&#39;étude de la relation entre les signaux entrants (la tension de membrane) et la sortie des neurones (exocytose). <img src="/files/ftp_upload/1305/fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2: Résultats typiques. A gauche: l&#39;image en champ clair d&#39;une cellule bipolaire poissons rouges isolés. En haut à droite: image TIRF des vésicules synaptiques dans le terminal bipolaires axone des cellules chargées avec FM 1-43 ® et imagés avec le 488 nm (FM colorant) au laser. En bas à droite: image d&#39;un même terminal, après patcher la cellule et l&#39;imagerie de la terminaison axonale avec le laser 561 nm. Rubans synaptiques sont étiquetés par la rhodamine basé RIBEYE peptide de liaison (Rpep_rhod). Tableau 1: Réactifs et équipements spécifiques. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Tapez </td><td> Fabricant </td><td> Catalogue </td><td> Commentaire </td></tr><tr><td> - </td><td> Air Table </td><td> Newport Corporation </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> IX70 </td><td> Microscope inversé </td><td> Olympus </td><td> - </td><td> Equipé d&#39;une lampe au tungstène pour le champ lumineux et un port ouverture latérale de la FRBR </td></tr><tr><td> TH4-100 </td><td> Source d&#39;alimentation de la lampe </td><td> Olympus </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> FF498_581-DI01 </td><td> Filtre dichroïque </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> NF01-405_488_568 </td><td> Filtre d&#39;émission </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Apo x100 O RH </td><td> Objectif </td><td> Olympus </td><td> - </td><td> NA 1.65 </td></tr><tr><td> RG630 </td><td> Red Glass Filter </td><td> Schott </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 488 nm Laser </td><td> Cohérente </td><td> - </td><td> Utilisez à la puissance minimale </td></tr><tr><td> - </td><td> Obturateur </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D1 </td><td> Pilote d&#39;obturation </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 561 nm Laser </td><td> Melles Griot </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Obturateur </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D3 </td><td> Pilote d&#39;obturation </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Kit de pression de perfusion </td><td> Système superfusion </td><td> Automatiser scientifique </td><td> 09-04 </td><td> - </td></tr><tr><td> Pen perfusion </td><td> Système superfusion </td><td> Automatiser scientifique </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> ValveLink 8 </td><td> System Controller superfusion </td><td> Automatiser scientifique </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Cascade 512B </td><td> EM caméra CCD </td><td> Roper Scientific </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Metamorph 7.1 </td><td> Logiciel d&#39;imagerie </td><td> Molecular Devices </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> EPC-9 </td><td> Amplificateur Patch Clamp </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Pulse </td><td> Logiciel Amplificateur </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MP-285 </td><td> Micromanipulateur </td><td> Instrument Sutter </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Titulaire d&#39;électrode </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> Pour en verre 1,5 mm de diamètre extérieur, 2 unités </td></tr><tr><td> Kwik-FIL ® TW150-3 </td><td> Borosilicate capillaire en verre </td><td> WPI </td><td> - </td><td> Sans fil </td></tr><tr><td> B150-86-10 </td><td> Borosilicate capillaire en verre </td><td> Instrument Sutter </td><td> - </td><td> Avec filaments </td></tr><tr><td> P-97 </td><td> Extracteur de microélectrodes </td><td> Instrument Sutter </td><td> - </td><td> Equipé de filaments boîte 3x3 et de la chambre de l&#39;environnement </td></tr><tr><td> - </td><td> Pompe de pression d&#39;air à vide </td><td> Thomas scientifique </td><td> 7893B05 </td><td> Crée à vide pour éliminer les liquides de la chambre et de surpression pour les pipettes </td></tr><tr><td> MatLab R2008a </td><td> Logiciel d&#39;analyse </td><td> The MathWorks </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 353001 </td><td> 35 mm en plastique des boîtes de culture </td><td> Falcon </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Haute de verre à indice de réfraction </td><td> PlanOptik </td><td> - </td><td> Indice de réfraction à 488 nm = 1,78 </td></tr><tr><td> Série M </td><td> Liquide à haute indice de réfraction </td><td> Labs Cargille </td><td> - </td><td> Indice de réfraction = 1,78 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Kit élastomère de silicone </td><td> Dow Corning </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Le glutathion </td><td> Tripeptide </td><td> EMD Chemicals </td><td></td><td> Radica gratuitL trésor </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> L&#39;enzyme </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td> Type V </td></tr><tr><td> L-cystéine </td><td> Amino Acid </td><td> Fluka </td><td> 30090 </td><td> Active la papaïne </td></tr><tr><td> La papaïne </td><td> L&#39;enzyme </td><td> Fluka </td><td> 76220 </td><td> De Carica papaya </td></tr><tr><td> Trolox ® </td><td> Soluble vitamine E </td><td> Sigma </td><td> 56510 </td><td> Gratuit capteur de radicaux </td></tr><tr><td> ADVASEP-7 </td><td> Sulfonés B-cyclodextrine </td><td> Sigma </td><td> A3723 </td><td> Réduit FM 1-43 ® fond de fluorescence </td></tr><tr><td> FM 1-43 ® </td><td> Colorant fluorescent </td><td> Invitrogen </td><td> T35356 </td><td> &quot;Un emballage spécial&quot; </td></tr><tr><td> Cire collante </td><td> Agent d&#39;enrobage pipette </td><td> Kerr Corporation </td><td> - </td><td> Diminue la capacité pipette </td></tr></tbody></table> Tableau 2: des solutions physiologiques utilisées dans cette étude. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Substance </td><td> Faible Ca 2 + de Ringer </td><td> Contrôle de Ringer </td><td> High K + Ringer </td><td> Solution interne </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 mM </td><td> 120 mM </td><td> 97,5 mm </td><td> - </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> 25mM </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,75 mM </td><td> - </td><td> - </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Le glutathion </td><td> 2 mM </td><td> 2 mM </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> CH 3 CsO 3 S * </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> TEACl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> ATP-Mg </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> GTP-Li </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> RPEP-Rhod ** </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Volume </td><td> 200 ml </td><td> 100 ml </td><td> 5 ul </td><td> 100 uL </td></tr></tbody></table> * Méthanesulfonate de césium. ** RIBEYE peptide de liaison: la rhodamine + EQTVPVDLSVARDR-COOH (MW 1997,75).

<ol>
	<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology.">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li><li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport,+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones.">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li><li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals.">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li><li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell.">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse.">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li></ol>

Les avantages de l&#39;objectif de type microscopie TIRF sont que 1) il fournit une excellente sectionnement optique en limitant la lumière d&#39;excitation à une région étroite dans le plan focal de l&#39;objectif, minimisant ainsi les focus-du-léger; 2) car la lumière tombe exponentiellement avec la distance , le mouvement dans une direction verticale peut être surveillé comme un changement dans l&#39;intensité de fluorescence; 3) la collecte efficace de la lumière à travers l&#39;objectif d&#39;ouverture numérique élevée <s...

imaging exocytosis in retinal bipolar cells with tirf microscopy

Réflectance interne totale de fluorescence (FRBR) microscopie est une technique qui permet l&#39;étude des événements qui se déroulent à la membrane cellulaire, l&#39;imagerie par sélectif des molécules fluorescentes qui sont proches d&#39;une substance indice de réfraction élevé, comme le verre<sup&gt; 1</sup&gt;. Dans cet article, nous appliquons cette technique à l&#39;exocytose image de vésicules synaptiques dans les cellules rétiniennes bipolaires isolés de la rétine des poissons rouges. Ces neurones sont très convenable pour ce genre d&#39;étude en raison de leur grande terminaisons axonales. Par simultanément patch clamp les cellules bipolaires, il est possible d&#39;étudier la relation entre la tension pré-synaptique et la libération synaptique<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Les vésicules synaptiques l&#39;intérieur des terminaux cellulaires bipolaires sont chargées avec un colorant fluorescent (FM 1-43 ®) par la co-soufflant le colorant et une solution de Ringer contenant un K élevé<sup&gt; +</supConcentration&gt; sur le terminaisons synaptiques. Cette dépolarise les cellules et stimule l&#39;endocytose et conséquente absorption de colorants dans les vésicules glutamatergique. Après le lavage l&#39;excès de colorant loin pour environ 30 minutes, les cellules sont prêtes pour être serré de patch et imagé simultanément avec un laser à 488 nm. La solution la pipette de patch contient un peptide rhodamine base qui se lie sélectivement à l&#39;RIBEYE protéines synaptiques ruban<sup&gt; 4</sup&gt;, Ce qui l&#39;étiquetage des rubans spécifiquement lorsque les terminaux sont imagés avec un laser 561 nm. Cela permet la localisation précise des zones actives et la séparation des synaptique à partir des événements extra-synaptiques.

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Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Dans cette vidéo, nous démontrons comment étiqueter et de visualiser seule exocytose des vésicules synaptiques et la traite des cellules rétiniennes bipolaires poissons rouges en utilisant la fluorescence totale internes réflectance (FRBR) microscopie.

L&#39;exocytose imagerie dans les cellules bipolaires rétine par microscopie TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

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11.6K vues.  Yale University School of Medicine. Dans cette vidéo, nous démontrons comment étiqueter et de visualiser seule exocytose des vésicules synaptiques et la traite des cellules rétiniennes bipolaires poissons rouges en utilisant la fluorescence totale internes réflectance (FRBR) microscopie.

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Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Mesure exocytose dans les neurones en utilisant un étiquetage FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

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Biologie

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Cellules d&#39;imagerie à long terme des mammifères en utilisant la microscopie à champ large

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basées sur la fluorescence de mesure de l&#39;entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

L&#39;imagerie de fluorescence avec un nanomètre Précision (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

Visualisation endocytose clathrine de G récepteurs couplés aux protéines à un seul événement résolution par microscopie TIRF

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated exocytosis is fundamental for intercellular communication and is a key mechanism for the secretion of neurotransmitters, hormones, inflammatory mediators, and other compounds, by a variety of cells. At least three distinct mechanisms are known for regulated exocytosis: full exocytosis, where a single SG fully fuses with the plasma membrane, kiss-and-run exocytosis, where a single SG transiently fuses with the plasma membrane, and compound exocytosis, where several SGs fuse with each other, prior to or after SG fusion with the plasma membrane. The type of regulated exocytosis undertaken by a cell is often dictated by the type of secretory trigger. However, in many cells, a single secretory trigger can activate multiple modes of regulated exocytosis simultaneously. Despite their abundance and importance across cell types and species, the mechanisms that determine the different modes of secretion are largely unresolved. One of the main challenges in investigating the different modes of regulated exocytosis, is the difficulty in distinguishing between them as well as exploring them separately. Here we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran as an exocytosis reporter, and live cell imaging, to differentiate between the different pathways of regulated exocytosis, focusing on compound exocytosis, based on the robustness and duration of the exocytic events.

Here we detail a method for live cell imaging of regulated exocytosis. This method utilizes FITC-dextran, which accumulates in lysosome-related organelles, as a reporter. This simple method also allows distinguishing between different modes of regulated exocytosis in cells that are difficult to manipulate genetically.

L’imagerie FITC-dextran comme Reporter pour l’exocytose régulée

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Préparation de l’échantillon biologique par congélation à haute pression, amélioration du contraste assistée par micro-ondes et minime résine enrobage pour l’imagerie de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...