El desarrollo de qFSM es financiado por el NIH subvención GM06230 U01.

Sección 1: La obtención de la etiqueta fluorescente para actina FSM Materiales necesarios: purificada actina, fluoróforo (Alexa, X-rodamina recomendado). G-buffer, ultracentrífuga <ol><li> Un componente clave para la adquisición de buenas películas FSM exige el correcto etiquetado de actina (u otras proteínas del citoesqueleto), con el fluoróforo de su elección. Se recomienda el uso de fluoróforos Alexa (488, 568 longitudes de onda) y X-rodamina derivados de éster de succinimidilo que se dirigen a los residuos de lisina expuestos en la superficie de la actina. </li><li> Al elegir su fluoróforo y su longitud de onda apropiada, asegúrese de que la configuración de su microscopio tiene los filtros adecuados (excitación y de emisión) e iluminadores (arco de mercurio de la lámpara y / o láser) para dar cabida a la etiqueta fluorescente. Se recomienda seleccionar las longitudes de onda de la naranja para longitudes de onda roja (560-630 nm) para minimizar los efectos de la auto-fluorescencia y foto-daño y para garantizar su compatibilidad con las buenas prácticas agrarias-conjugados. </li><li> Actina pura se puede extraer de los tejidos musculares que pertenecen a la rata o el pollo, pero requiere de un procedimiento de extracción de polvo larga del músculo acetona. Polvo de acetona muscular puede ser adquirido de Invitrogen. El procedimiento de etiquetado no se discute en este protocolo, pero se puede encontrar aquí [1] </li><li> Alternativamente, usted puede comprar etiquetados proteínas actina del citoesqueleto incluyendo varios proveedores Inc., e Invitrogen. Los servicios personalizados de etiquetado también están disponibles a través de Invitrogen. Purificada, no etiquetados actina (actina músculo y no musculares) se pueden adquirir en Citoesqueleto Inc. </li><li> Ya sea que decida comprar o preparar su propia etiqueta de actina, que quieren asegurarse de que la relación entre el etiquetado es de alrededor de 0,3 a 0,7 colorantes por monómero de actina. Demasiado alto ratio de etiquetado puede afectar la cinética de rotación (y la unión a proteínas asociadas) de los filamentos de actina, mientras que una proporción muy baja de etiquetado dará lugar a los pobres que buscan manchas (baja señal a ruido) y puede causar problemas de microinyección (ver más abajo). Este es un factor crítico para conseguir un buen speckle imágenes. </li><li> Antes de su almacenamiento a largo plazo, la solución de actina etiqueta debe ser aclarada por girar a 75.000 - 80.000 g durante 20 minutos a 4 grados centígrados. Actina etiquetados deben ser almacenados en una solución de G-buffer y se mantiene -80 grados Celsius. Preparar alícuotas de 2 uL es muy recomendable para reducir los efectos perjudiciales de los ciclos de congelación-descongelación (conduce a agregados insolubles). Abstenerse de exponer la solución de actina etiquetados a la luz directa (se photobleaching de fluoróforos). Recomendamos el uso de tubos de microcentrífuga opaco para el almacenamiento a largo plazo. </li></ol> Sección 2: Preparación de las células y la microinyección de actina etiquetados Materiales necesarios: agujas de microinyección, microjeringa, microloaders, los medios de comunicación precalentado celular, buffer de inyección, un cubo de hielo, un microscopio (anillo de fase, el objetivo de contraste de fase 40x, transjector, extractor de aguja, micromanipulador) <ol><li> Muchos tipos de células son susceptibles de FSM, pero conseguir un buen speckle imágenes está directamente relacionada con el éxito del procedimiento de microinyección. Al seleccionar las células de Estados Federados de Micronesia, las células deben ser grandes (&gt; 50 um de diámetro), se extendió cuando se siembran y se adhiere a sustratos naturales (de plástico o cajas de cultivo de tejidos). También ayuda si el citosol de la célula ocupa un área mayor que su núcleo. Los criterios antes mencionados asegurar que las células son susceptibles a la microinyección. El éxito de las líneas celulares candidatos incluyen (pero no limitados a) PtK1 [2,3], las células tritón de pulmón [4], y las neuronas Aplysia [3]. </li><li> Las células deben ser chapada en cubreobjetos de vidrio cuadrados (22 x 22 mm;. No 1-1/2) que han sido lavados con ácido. Recubrimiento del sustrato norma se puede aplicar a la cubreobjetos y no afectará a la microinyección. </li><li> La correcta selección de las agujas de microinyección depende del tamaño de la abertura de la punta. Por lo general, los tamaños de agujero puede muy en tamaño de 0,5 um a tan grande como 3 um. Sin embargo, se recomienda que la inyección de actina requiere un tamaño de abertura óptimo entre 0,5 y 1 um. Si los problemas de obstrucción se encuentran constantemente, mayor tamaño de los agujeros con capacidad para el suministro de monómero no deseados, así como los filamentos de actina polimerizada. Agujas de microinyección se pueden comprar a través de varios proveedores, incluidos los sistemas Eppendorf que hacen que las agujas Femtotip microinyección. Alternativamente, si un extractor de aguja comercial está disponible, los tubos de cristal de microinyección se puede comprar a partir de Sutter, y sacó a la especificación. Para los principiantes, se recomienda tener 10 a 20 agujas se puso la mano antes de iniciar el procedimiento de inyección. </li><li> &#39;Concentración de inyección&#39; Ideal (concentración final de actina cargado en la aguja) de la actina es de entre 0,5 a 1,0 ug / ul sobre la base de una relación de etiquetado del 40% de medio de contraste para monómeros de actina. Menor proporción de etiquetado de la actina puede ser compensada mediante la inyección en concentraciones más altas (3.1 ug / ul). Sin embargo, la frecuencia de la obstrucción de la agujaser mayor. Esto puede reducirse en parte mediante el uso de agujas con grandes aberturas. Concentración de la actina puede ser diluido mediante la adición de tampón helado de la inyección. Helada ddH2O también puede ser utilizado para diluir para inyección rápida. En este punto, todas las soluciones de trabajo deben mantenerse en hielo. </li><li> De carga desde 0,5 hasta 1,0 l de la solución de actina con una microjeringa (de vía estrecha - Hamilton), o, alternativamente, mediante el uso de una punta de pipeta microloader. </li><li> Cuidadosamente dispensar la solución de actina, con cuidado la liberación de la solución. Las burbujas se debe evitar, pero se puede quitar fácilmente por ocupar el exceso de líquido que rodea la burbuja. </li><li> Asegúrese de que la solución de actina se apoya completamente en la punta de la aguja. El exceso de solución en cualquier lugar a lo largo de los capilares de la aguja puede interrumpir el flujo de inyección. </li><li> Ahora, con cuidado ponga la aguja, evitando el contacto con la punta de la aguja, al titular de la inyección. Coloque el soporte de forma que la aguja que hace un ángulo de 35 a 50 a la base de la platina del microscopio. Ángulos más bajos son los preferidos. </li><li> Baje la punta de la aguja hasta que apenas rompe la superficie de los medios de comunicación de baño de las células. </li><li> Ahora la posición de la punta de la aguja (sin bajar) para que se apoye directamente sobre el centro del objetivo. Si la punta de la aguja se alinea con el objetivo, debería ver un halo brillante a través del ocular. Este es el final de la punta de la aguja. Que se mueve lentamente al lado a lado la aguja (usando el manipulador) puede ayudar a localizar mejor el halo. </li><li> Ajuste el z-se centran en el microscopio hasta que sus células están a la vista. Ahora, baje lentamente la punta hasta que el halo se contrae gradualmente hasta que finalmente convergen en la punta de la aguja - se necesita para controlar el foco (z-posición) al mismo tiempo. Una característica adicional que buscar es el eje de la aguja, que proyectará sombras lineales. La reducción de la aguja poco a poco definir el eje de la aguja. Cuando se hace correctamente el extremo de la aguja y las células deben ser ambos a la vista. Ligero ajuste del anillo de fase puede ser necesaria para mejorar el contraste. </li><li> Al navegar, asegurar la punta de la aguja es muy superior a las células para evitar que se rompa la punta de la aguja. </li><li> Al seleccionar las células que se inyectan, las células con bordes libres debe estar mirando hacia la punta de la aguja. Esto asegurará que la disminución de la pendiente de la célula (del punto más grueso, donde reside el núcleo, la parte más delgada del borde de ataque) se reunirá con la punta de la aguja, en lugar de correr paralela a ella. </li><li> La presión de la aguja debe ser fijado en 0,3 a 0,8 psi. La constante presión aplicada se traducirá en un flujo constante de la solución de actina. </li><li> Después de decidir sobre una célula de inyectar, la posición de la aguja de modo que la punta está al lado del núcleo (región perinuclear, la parte más gruesa de la célula donde el núcleo no se encuentra justo debajo). </li><li> Baje lentamente, y reajustar la posición de la aguja hasta que la punta es deprimente de la membrana, ahora progresivamente menor hasta que la punta de la aguja ha perforado la membrana. Si la aguja ha traspasado completamente la membrana, la célula será más brillante, tan pronto como usted ve esta diferencia levantar la aguja hasta que ya no es tocar la célula. La perforación actual y el proceso de inyección se llevará 0,5 a 2 segundos. </li><li> Cuando se hace correctamente, la forma de la célula aparece sin cambios, mientras que la inyección demasiado dará lugar a la retracción rápida del borde de la celda y en algunos casos, usted verá realmente la célula explotar. </li><li> Si usted no ve cambios en la célula cuando la microinyección (no más brillante), la punta de la aguja puede ser cerrado. Usted puede probar esto presionando la &quot;limpia&quot; botón si está disponible en transjector. Si está abierto, esto aumentará significativamente el flujo de la presión constante que se puede ver a través de los oculares - que aparecerá como olas y los escombros cerca se puede ver la dispersión. </li><li> Si la punta de la aguja está cerrada, puede optar por insertar una aguja de microinyección nuevo o intentar romper la punta de la aguja con cuidado bajar la aguja hasta la punta de la aguja presiona contra el portaobjetos de vidrio, lo que provoca el final de la punta de romper. La zona de rotura no debe ser más que un ª 1 / 5 de la zona de la punta de la aguja (la parte de la aguja que comienza a converger a un punto). </li><li> Continuar con la inyección, el gasto de no más de 20 - 45 minutos para cada sesión de microinyección (dependerá del tipo de célula). Como regla general, se recomiendan sesiones más cortas para minimizar el estrés en las células. </li><li> Después de terminar la microinyección, cambiar los medios de comunicación celular en el plato mediante la adición de nuevos medios de comunicación precalentado. A continuación, permiten a las células para recuperarse durante 30 minutos en una incubadora antes de exponer. Esto también permitirá a los filamentos de actina a integrarse en la red del citoesqueleto existentes. </li></ol> Sección 3: Montaje de la Cámara de imágenes Materiales necesarios: Cinta de cubre objetos, de doble cara, q-tips, pinzas, valap, kim limpiar, oxyrase, los medios de comunicación de imagen, hoja de afeitar, p200 piPette, etanol puro <ol><li> Empiece por precalentar los medios de comunicación de imagen y descongelar una alícuota de 15 uL de Oxyrase. Asegúrese de proteger la oxyrase fotosensibles de la luz. La adición de oxyrase reducirá en gran medida los efectos de photobleaching. </li><li> Precalentar el valap, mediante el establecimiento de la temperatura de la placa caliente a baja. No sobrecalentar / quemar la valap de que perderá su eficacia como un sellador. </li><li> Limpie un cubreobjetos con un Kimwipe rociado con etanol puro para limpiar y eliminar los desechos pequeños. </li><li> Pila de dos longitudes de igual tamaño (2,5 cm de largo) de cinta de doble cara en la parte superior de cada uno, con una superficie plana y limpia como una plataforma. Pulse cualquier burbuja de aire atrapada para crear un plano completamente plana. </li><li> Usando una hoja de afeitar, cortar dos tiras de recta a lo largo del eje longitudinal, de manera que cada tira mide 0,5 cm de ancho. </li><li> Con unas pinzas, coloque cada tira contra el borde largo de su cubreobjetos de modo que las dos tiras de cinta crea un vacío en el centro de su cubre objetos. Presione suavemente en la cinta para sellar bien con el vidrio. Las tiras de cinta actúan como espaciadores entre el cubre objetos y cubreobjetos los. </li><li> Asegúrese de que el valap esté completamente licuado antes de comenzar el siguiente paso. </li><li> Recuperar sus medios de comunicación imágenes de precalentado, añadiendo 15 ul de oxyrase de cada 500 uL de los medios de comunicación. </li><li> Kimwipes veces en forma de triángulos para crear tres bordes duros. Esto será utilizado para crear una superficie seca de la cinta para pegar en. </li><li> Recuperar las células de la incubadora. Con unas pinzas, agarre una esquina del cubreobjetos. Rápidamente coloque el cubreobjetos en una Kimwipe (lado célula es hacia arriba, sin tocar el tejido), y el uso de la Kimwipe doblado para limpiar dos lados opuestos del cubreobjetos para crear una superficie semi-seca (en la superficie, donde su descanso las células). </li><li> Con unas pinzas, agarre una esquina del cubreobjetos y se coloca sobre el cubreobjetos de modo que las superficies secas están alineados con las dos tiras de cinta. Observe que ahora tiene dos lados cerrados y dos ranuras abiertas. Poco a poco pipeta 200 uL de la solución de imagen, los medios de comunicación oxyrase cerca de una abertura. Es importante destacar que no queden burbujas de aire debe ser introducido. La solución debe ser aspirado en la cámara de nuevo reunidos por las fuerzas de capilaridad, sumergiendo sus células en una solución. </li><li> Usando un toque Q-tip las cuatro esquinas de su cubreobjetos con valap fundido para fijar y estabilizar rápidamente el portaobjetos. Se dará cuenta de que se seque el valap instante (en cuestión de segundos a temperatura ambiente). </li><li> Ahora comienzo con los lados abiertos (sin cinta lateral), había una delgada franja de valap usando un Q-tip y simula un accidente cerebrovascular el cepillado. Repita para el lado cerrado. Poco a poco construir el escudo de valap, reforzando así el sello mediante la repetición de las etapas de recubrimiento. El valap debe limitarse a los bordes, dejando el centro del cubreobjetos claro. </li><li> Limpie suavemente la parte central del cubreobjetos con un Q-tip con ddH2O de extraer cualquier soporte residual, siendo consciente de no aplastar las células. Repita el paso de limpieza con etanol puro. </li><li> Ahora tendrá una cámara de imágenes completamente cerrado optimizado para speckle imágenes. Tener una caja completamente sellada para evitar que su fluoróforos de forma rápida photobleaching. </li></ol> Sección 4: las células de imagen Materiales necesarios: microscopio invertido de campo amplio, lámpara mecury, los filtros adecuados, enfriado cámara CCD con 6,7 micron píxeles, apertura numérica, de inmersión en aceite los objetivos del plan-Apocromático (60X a 100X, fase o CID). Vibraciones mesa. Software de imágenes. <ol><li> Precaliente la platina del microscopio a 37 grados. Coloque la cámara de imágenes recién terminado, y esperar 10-15 minutos para que la temperatura se estabilice antes de exponer. </li><li> Empezar por centrarse en las células de campo brillante, y luego encontrar las células inyectadas por alternar la configuración correcta de fluorescencia. Trate de minimizar el tiempo de exposición de fluorescencia para reducir photobleaching. </li><li> Verificar si hay células que se han inyectado saludable bordes de ataque curvado. Más de inyección de las células (despiece) se caracteriza por los bordes dentados y se retractó, asemejándose a numerosos filopodios - evitar la imagen de estas células. </li><li> Ajustes de adquisición dependerá del tipo de célula, la calidad de la actina etiquetados, y los componentes del microscopio. Sin embargo, los ajustes de exposición no debe ser mayor de 2 segundos, y el intervalo de tiempo entre los fotogramas se debe establecer entre 5 y 10 segundos. Tiempo típico de una serie de tiempo (por celda imágenes) puede variar entre 10 a 30 minutos, y está limitado por los efectos de photobleaching. Ajustes de ganancia de la cámara se puede girar hacia arriba para aumentar la relación señal-ruido. </li><li> Ideal speckle características debe tener cada uno de manchas separadas por ~ 2 speckle diámetros para los próximos vecinos de manchas. Esto garantiza óptima de muestreo espacial y temporal de la estructura de la actina. Para las células epiteliales, la red de actina moteada aparece homogéneo, con puntos uniformemente separados. Las líneas celulares que contienen fibras de densidad estrés o lamellipodiase distinguen, sino que tendrá un aspecto de puntos / moteado. Ajustes de la exposición se debe ajustar para obtener las mejores imágenes moteado. </li><li> El exceso de microinyección de células tendrán manchas densas que no parecen ser discretos. Fibras de estrés y lamellipodia la perderá su aspecto de puntos. </li><li> Menores de microinyección de células aparecerá muy oscura a través del ocular, que contiene manchas que están muy alejados (&gt; 10 motas de separación) y que aparecen dispersos al azar. Fibras de estrés y lamellipodia en estas células se distinguen. </li><li> Clave para obtener &quot;buenas&quot; películas speckle es mantener la atención. Esto es particularmente importante para los análisis posteriores de la participación de manchas de flujo y las mediciones de volumen de negocio. Por lo tanto la calidad del análisis cuantitativo dependerá de bloqueo en el centro de la duración del lapso de tiempo. Esto puede ser especialmente difícil si el plano de la imagen es muy delgada. Otros factores que dependen de la estabilidad del sistema de microscopio, en particular la vivienda escenario y la cámara de imágenes. Basado en el contraste de enfoque se puede utilizar si las longitudes de la imagen de intervalo son suficientes para dar cabida a esta función. Otras opciones incluyen la compra de un infrarrojo cercano sistema basado enfoque que proporciona fiable en tiempo real los ajustes de enfoque. Usted puede encontrar estas ofertas de Nikon, Olympus y ASI. </li></ol> Sección 5: Análisis qFSM Esta sección no se discute en detalle, pero la información sobre el software de análisis se puede encontrar aquí [5]. Peticiones de descarga de software se pueden realizar en nuestro sitio web (lccb.scripps.edu). Temas tratados: <ul><li> El ruido de calibración </li><li> Moteado de detección </li><li> El seguimiento mediante una aproximación mixta de la imagen basada en la correlación de seguimiento del movimiento grueso de las áreas de manchas y el seguimiento de una sola partícula del movimiento detallado de manchas individuales. </li><li> Cálculo de la asamblea de polímero y las tasas de desmontaje de las fluctuaciones de intensidad durante la aparición de manchas y eventos desaparición. </li></ul>

<ol>
	<li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+(FSM)+of+microtubules+and+actin+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells.">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li><li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow.">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li><li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells.">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li><li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics.">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Varios factores clave son cruciales para el éxito de la obtención de imágenes de manchas, manchas por bueno comenzar y terminar con la calidad de la actina marcados con fluorescencia. Una proporción alta de etiquetado de tinte a la actina monómero, en torno a 0,4 a 0,7 se asegurará de que van a aparecer manchas brillantes y discreto, mientras que la proteína marcada en sí debe ser soluble y libre de los agregados. Igualmente importante es el procedimiento de microinyección. Para asegurar la homeostasis celular ...

Inyección de tampón (IB) 50 mM de glutamato de potasio 0,5 M MgCl2 (Anexo 2a) Almacenar hasta 2 años a -20 ° C &nbsp; G-buffer 2 mM Tris ⋅ Cl, pH 8.0 (Anexo 2a) 0.2 mM CaCl2 (Anexo 2a) Añadir justo antes del uso: 0,2 mM ATP (ver receta a 100 mM) 0,5 mM 2-mercaptoetanol Almacenar hasta 1 día a 4 ° C

live cell imaging of f-actin dynamics via fluorescent speckle microscopy (fsm)

En este protocolo se describe el uso de fluorescentes Speckle Microscopía (FSM) para capturar imágenes de alta resolución de la dinámica de actina en las células PtK1. Una ventaja única del FSM es su capacidad para captar el movimiento y la cinética de rotación (armado / desarmado) de la red de F-actina en las células vivas. Esta técnica es particularmente útil en la obtención de mediciones cuantitativas de la dinámica de actina F-cuando se combina con el software de visión por computador (qFSM). Se describe la selección, la microinyección y la visualización de las sondas fluorescentes de actina en las células vivas. Es importante destacar que procedimientos similares se aplican a la visualización de las otras asambleas macomolecular. FSM ha sido demostrada para los microtúbulos, filamentos intermedios y los complejos de adhesión.

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Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selección, la microinyección, y las imágenes de fluorescencia marcado con F-actina a través de microscopía de fluorescencia moteado (FSM).

Imágenes de células vivas de la F-actina Dynamics a través de Microscopía Fluorescente Speckle (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

15.8K vistas.  Scripps Institute. Selección, la microinyección, y las imágenes de fluorescencia marcado con F-actina a través de microscopía de fluorescencia moteado (FSM).

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Investigación

Biología

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Concentración, la carga, y la alineación de una célula de ultracentrifugación analítica de muestras

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Marcaje fluorescente de COS-7 Expresando etiqueta SNAP-proteínas de fusión de imágenes de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para formar imágenes de estructuras subcelulares en ratones vivos que expresan proteínas fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Imágenes en tiempo real de la Planta Dinámica superficie celular con Variable de ángulo epifluorescencia Microscopía

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Tridimensional súper resolución Microscopía de filamentos de actina F por interferométrica photoactivated localización de Microscopía (iPalm)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, misunderstood, or misinterpreted by the fixed-cell analysis. While the fixed cell imaging and analysis is robust and sufficient to observe cellular steady-state, it can be limited in defining a temporal order of events at the cellular level and is ill-equipped to assess the transient nature of dynamic processes including mitotic progression. In contrast, live cell imaging is an eloquent tool that can be used to observe cellular processes at the single-cell level over time and has the capacity to capture the dynamics of processes that would otherwise be poorly represented in fixed cell imaging. Here we describe an approach to generate cells carrying fluorescently labeled markers of chromatin and microtubules and their use in live cell imaging approaches to monitor metaphase chromosome alignment and mitotic exit. We describe imaging-based techniques to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression, including the identification of cells at various stages in mitosis, identification&#160;and tracking of mitotic defects, and analysis of spindle dynamics and mitotic cell fate following the treatment with mitotic inhibitors.

Here we present a protocol to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression. Our application of time-lapse imaging enables the user to identify cells at various stages of mitosis, track and identify mitotic defects, and analyze spindle dynamics and mitotic cell fate upon exposure to anti-mitotic drugs.

Imágenes de células vivas para evaluar la dinámica del tiempo metafásico y el destino celular después de las perturbaciones del husillo mitático

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Dinámica de oligomerización de receptores de superficie celular en células vivas mediante la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total combinada con análisis de número y brillo

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...