Combinamos la microscopía de fluorescencia con la microfluídica para estudiar cómo las proteínas de unión a la actina regulan el ensamblaje y el desmontaje de los filamentos de actina. Con la microfluídica, podemos cuantificar las reacciones que ocurren en decenas de filamentos de actina individuales simultáneamente, mientras controlamos con precisión las condiciones bioquímicas y mecánicas. Recuerde que las soluciones se inyectan primero en paralelo hasta que llegan a la cámara, y luego, los filamentos se exponen secuencialmente a cada solución cambiando el ajuste de presión.
Para comenzar la preparación del ensamblaje de la cámara de polidimetilsiloxano, o PDMS, precaliente la placa caliente a 100 grados centígrados. Exponga una cámara PDMS limpia y una cubierta de vidrio en una placa de Petri limpia a la luz ultravioleta durante tres a cinco minutos en un limpiador UV profundo. Cuando haya terminado, coloque la cámara PDMS sobre el deslizamiento de la cubierta de modo que las dos superficies expuestas directamente a los rayos UV se pongan en contacto.
Para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la interfaz deslizante de la cubierta PDMS, presione suavemente la superficie de la cámara con un dedo. Presione fuertemente sobre las esquinas y los lados, asegurándose de que el techo de la cámara no entre en contacto con la superficie de vidrio. Coloque la cámara con el fondo de vidrio mirando hacia la placa caliente a 100 grados centígrados durante cinco minutos.
Luego use la cámara inmediatamente o guárdela en una placa de Petri limpia durante una semana. Para enjuagar el tubo de entrada y salida, llene un tubo de depósito de 2 mililitros con 300 microlitros de F-buffer, atorníllelo en el soporte microfluídico y ajuste la presión a 300 milibares. Deje que se desperdicien de cinco a ocho gotas de F-buffer, luego establezca la presión en cero y repita el procedimiento para cada canal.
A continuación, ajuste la presión para la salida en el tubo del depósito de cuatro a 50 milibares, una vez que salga una gota de la punta del tubo, conecte el tubo a la salida de la cámara PDMS. A medida que el líquido llena la cámara y sale de todas las entradas, ajuste la presión de salida a 20 milibares. Más tarde, ajuste la presión para el tubo del depósito a 1 a 50 milibares.
Para evitar la introducción de burbujas de aire, asegúrese de que salga una gota del tubo y de la entrada PDMS antes de conectar el tubo a uno de entrada. Ajuste la presión de la entrada a 30 milibares. Después de conectar las entradas dos y tres, como se ha demostrado, ajuste la presión de todas las entradas a 20 milibares y la presión de salida a cero milibares.
Asegúrese de que los caudales en las entradas sean aproximadamente iguales. Al cambiar el depósito, ajuste todas las presiones de entrada a 12 milibares y la presión de salida a 5 milibares. Para inyectar rápidamente una solución, ajuste la presión de la entrada correspondiente a 150 milibares y ajuste la presión en las otras entradas a alrededor de 100 milibares, de modo que el caudal resultante en las entradas sea de 500 nanolitros por minuto.
Para cambiar la solución, llene de 200 a 300 microlitros de la solución en un nuevo tubo de depósito y ajuste la presión a la configuración de cambio. Luego, desenrosque el tubo del depósito de la entrada. Una vez que se haya formado una pequeña gota en la punta del tubo, atornille el tubo nuevo con la solución fresca, cambie el ajuste de presión a alto flujo.
Dependiendo de la configuración microfluídica y la geometría de la cámara, espere de tres a cinco minutos para que la solución llene el tubo y llegue a la cámara. El proceso se puede seguir midiendo el aumento de la fluorescencia a lo largo del tiempo. Para la funcionalización de la superficie, cambie la solución tres a 200 microlitros de 50 semillas picomolares de espectrina-actina en F-buffer, e inyecte la solución durante dos minutos con tres de alto flujo.
Para la pasivación superficial, cambie el tubo tres con 300 microlitros de 5% BSA en F-buffer, luego, inyecte durante cinco minutos a alto flujo tres, seguido de cinco minutos a medio flujo tres, con presión reducida de siete a ocho milibares en los canales uno y dos para obtener un contraflujo de 100 nanolitros por minuto. Toda la superficie de la cámara será pasivada por BSA. Cambie el tubo tres a F-buffer para enjuagar el canal durante cinco minutos a un flujo alto tres.
Más tarde, cambie los tubos de uno a tres con una profilina de actina micromolar, actina micromolar de 0,15 y tampón F, respectivamente, como se explica en el manuscrito, e inyecte soluciones recién preparadas utilizando el alto flujo preestablecido durante tres a cuatro minutos. Encienda el microscopio y ajuste el tiempo de exposición de la cámara a 100 a 200 milisegundos, el láser de excitación a 10 a 20% de potencia y la fluorescencia de reflexión interna total, o profundidad TIRF, a 200 a 300 nanómetros para capturar las imágenes con un objetivo de 60X. A continuación, ajuste el ajuste de presión a flujo medio uno durante 10 minutos para registrar la polimerización del filamento a la velocidad de un fotograma cada 20 segundos, seguido de flujo medio dos durante 15 minutos para el envejecimiento del filamento.
Capture la despolimerización en el modo de epifluorescencia a un fotograma cada cinco segundos, después de uno o dos fotogramas, cambie a flujo medio tres para registrar filamentos despolimerizando a alrededor de 10 subunidades por segundo. Para restablecer el experimento, rompa todos los filamentos marcados fluorescentemente exponiéndolos continuamente al láser a máxima potencia durante dos minutos. Pruebe diferentes condiciones cambiando las soluciones uno, dos o tres e inyectándolas a alto flujo durante tres o cuatro minutos.
El resultado del experimento básico de polimerización/despolimerización se presenta aquí. Los kymographs resultantes se utilizaron para cuantificar las tasas de polimerización y despolimerización. Cuando los filamentos de actina cultivados fueron expuestos a una solución de cofilina marcada fluorescentemente, los racimos de cofilina se nuclearon y crecieron hacia los extremos puntiagudos y con púas.
Cuando los filamentos individuales se exponen a la fasina, forman haces que parecen más brillantes y no están perfectamente alineados con el flujo. Es muy importante evitar introducir burbujas de aire en el sistema al cambiar de tubo y prestar atención a no vaciar los tubos del depósito. Esta técnica fue fundamental para aplicar fuerzas de tracción sobre decenas de filamentos individuales, observar la sensibilidad mecánica de la formina y la cofilina, y el desramado ARP2/3.
