Muchos estudios terapéuticos y neurocientíficos genéticos implican inyecciones de vectores AAV en los cerebros de primates no humanos. Para que estos estudios tengan éxito, la técnica de inyección debe ser fiable. Nuestra técnica de inyección es instantánea y precisa.
Este procedimiento funciona bien para la inyección en animales anestesiados o despiertos. Nuestra cánula casera es fácil de manejar y de bajo costo. Demostrando el procedimiento estará Kevin Mai, un técnico de ingeniería de mi laboratorio.
Para comenzar, rome una punta de aguja hipodérmica de calibre 30 de 13 milímetros con una amoladora de disco. Luego, corte un trozo de tubo de acero inoxidable a una longitud que dependa de la profundidad del área del cerebro objetivo. Con una amoladora de disco, biselar un extremo del tubo cortado y alisar el otro.
Desbarbar el interior del tubo con una brocha. A continuación, corte un trozo de tubo de PTFE a una longitud apropiada para el volumen de la solución vectorial que se va a cargar. Ensartar ambos extremos del tubo insertando la aguja hipodérmica roma.
Inserte la aguja hipodérmica roma aproximadamente cinco milímetros en un extremo del tubo de PTFE. Luego inserte el extremo no biselado del tubo de acero inoxidable aproximadamente cinco milímetros en el otro extremo. Pruebe la cánula inyectando agua filtrada a través del cubo de la aguja hipodérmica.
Confirme que el agua sale suavemente de la punta del tubo de acero inoxidable biselado y que el agua no se escapa de ninguna de las uniones. Después de probar la cánula, colóquela en una bolsa de autoclave y esterilícela en autoclave. Transfiera suavemente la solución vectorial a un tubo de PCR esterilizado con un pipero P-20, evitando la formación de burbujas.
A continuación, fije la cánula con la punta biselada hacia abajo a un soporte estereotáxico orientado verticalmente. Luego conecte una jeringa luer lock de un mililitro al cubo de aguja hipodérmico de la cánula. Sumerge la punta biselada en la solución vectorial.
Luego, aplique una presión negativa suave con la jeringa de un mililitro para cargar la solución en la cánula mientras rastrea visualmente el menisco entre la solución y el aire. Una vez que se haya cargado la solución vectorial, continúe la presión negativa suave hasta que la solución llegue al cubo de la aguja. Luego, retire la jeringa de un mililitro e inyecte lentamente aceite mineral de color a lo largo de la pared interior del cubo de la aguja hipodérmica, teniendo cuidado de evitar burbujas de aire.
Fije el cubo de aguja hipodérmico a uno de los dos puertos abiertos de una llave de paso de bloqueo luer de tres vías. A continuación, cierre el puerto. Llene una jeringa de un mililitro con aire y conéctela a cualquiera de los otros dos puertos.
Finalmente, cierre el puerto restante de la llave de paso para conectar la jeringa a la cánula. Conectar la jeringa fuerza el aire en la llave de paso, y desviar este aire al puerto desocupado evita que empuje la solución vectorial hacia abajo de la cánula. Empuje lentamente el aire de la jeringa hacia la cánula.
Una vez que el aceite coloreado aparezca en la punta de la aguja roma en el tubo de PTFE, verifique si hay aire entre la solución y el aceite coloreado. Siga aplicando presión positiva hasta que una gota de solución vectorial sea visible en la punta de la cánula biselada. Luego, cierre la llave de paso para evitar que el vector salga de la cánula por gravedad.
Una vez que se haya cargado la solución vectorial, fije la cánula al manipulador estereotáxico. Luego, para conectar la llave de paso a la bomba de aire eléctrica, tome el tubo de la bomba del asistente no estéril. Agarre el conector luer lock a través de la pared de una funda estéril.
Deje caer el cuello de la manga, permitiendo que se extienda a lo largo del tubo por gravedad. Luego, coloque la llave de paso y pegue firmemente la funda alrededor del conector luer lock. A continuación, pruebe la bomba de aire y la cánula ajustando la bomba de aire a baja presión, antes de encenderla y aumentar la presión hasta que el aceite avance a través de la cánula y una gota de solución vectorial sea visible en la punta de la cánula.
Pegue una regla de plástico al tubo de PTFE para medir el movimiento del menisco durante la inyección. Luego, empuje la cánula hacia abajo con el manipulador estereotáxico hasta que la punta llegue a la superficie y registre la profundidad. Conduzca la cánula al sitio más profundo para inyectarla a lo largo de la pista.
La superficie se hará hoyuelos al contacto. Para minimizar la orientación errónea debido a la compresión del tejido, empuje la cánula hacia abajo y sobrepase el sitio de inyección más profundo en 500 micrómetros. Luego, retraiga lentamente.
Otras alternativas son conducir la cánula lentamente hacia abajo o conducirla rápidamente y esperar en la parte inferior de uno a cinco minutos. Una vez que la cánula se coloca en el sitio de inyección más profundo, use la bomba de aire eléctrica para inyectar 0,5 microlitros de la solución vectorial durante 10 a 30 segundos. Confirme el flujo de inyección siguiendo el menisco entre el aceite coloreado y la solución vectorial en el tubo de PTFE.
Después de esperar un minuto, retraiga la cánula al siguiente sitio de inyección a lo largo de la pista. Después de la inyección final, deje la cánula en su lugar durante 10 minutos para evitar el flujo vectorial. Luego, retraiga la cánula y deséchela en un recipiente para objetos punzantes de riesgo biológico.
La inyección de vectores AAV portadores del transgén de rodopsina II del canal en el colículo superior izquierdo, seguida de estimulación con luz azul continua a 40 milivatios, produjo una serie de potenciales de acción consecutivos. Los pulsos de luz de un milisegundo no evocaron potenciales de acción a 40 milivatios, pero los evocaron de manera confiable a 160 milivatios. La estimulación óptica del colículo superior desencadenada por sacadas guiadas visualmente redujo gradualmente la ganancia de la sacádica.
La lentitud de este cambio es consistente con la plasticidad inducida optogenéticamente. La entrega de luz láser amarilla al vermis oculomotor después de las inyecciones de AAV en el núcleo reticularis tegmentae pontis suprimió la actividad de la fibra musgosa, que es una entrada al cerebelo. Esta supresión redujo la actividad de las células de Purkinje, que es una salida del cerebelo.
Durante la supresión optogenética, la velocidad de disparo disminuyó y cambió a un patrón de poros reventados, lo que sugiere que la entrada de fibra musgosa inhibida a las células de Purkinje influye en la fase de desaceleración de la sacádica al impulsar la segunda ráfaga. La rodopsina del canal se expresó exclusivamente en las células de Purkinje del vermis oculomotor. La entrega de pulsos de luz cortos aumentó la actividad de pico simple de una célula de Purkinje aislada.
Un solo pulso de luz de 1,5 milisegundos frecuentemente evocaba más de un pico simple. La activación de picos simples optogenéticos programada para ocurrir durante la sacada aumentó la amplitud de la sacada, confirmando el papel desinhibidor de las células de Purkinje en el generador de estallido oculomotor. Las burbujas de aire en la cánula pueden interrumpir el menisco del vector de aceite, complicar la determinación de los volúmenes de inyección y evitar un control fino del caudal.
Por estas razones, cargar las soluciones vectoriales sin burbujas de aire es fundamental para este procedimiento. De seis a ocho semanas después de la inyección, se pueden realizar manipulaciones optogenéticas y se puede procesar el tejido cerebral para el análisis histológico. Esta técnica permite a los investigadores probar muchos vectores en pocos animales, lo que, a su vez, facilita el desarrollo y la validación de nuevos vectores.
Un área particular de interés actual es el desarrollo de vectores que se dirigirán a tipos neuronales específicos.
