ESB reconoce financiación Premio a la Innovación Nuevo Director del NIH (DP2 OD002002-01), NIH subvención-desafío 1RC1MH088182-01, NIH Gran oportunidades de becas 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, la NSF (0835878 y 0848804), el McGovern Instituto el Programa de Premios Neurotechnology , el Departamento de Defensa, NARSAD, la Fundación Alfred P. Sloan, Jerry y Marge Burnett, el Premio de Investigación SFN para la Innovación en Neurociencia, el Media Lab del MIT, la Fundación Benesse, y la Fundación Wallace H. Coulter.

1. La construcción de Clamp estereotáxica <ol><li> La pinza estereotáxica se usa para sujetar el conjunto inyector a la stereotax, de modo que los inyectores estén paralelos al brazo estereotáxica. </li><li> Cada laboratorio sólo necesita una pinza, a menos que se prevé que más de una cirugía puede llevarse a cabo de forma simultánea. En este caso, hacer el mismo número que el número máximo previsto de cirugías simultáneas. También puede ser recomendable hacer un extra, en caso de daños a la primera. </li><li> Para hacer la pinza estereotáxica, en primer lugar, un diámetro de 1,5 mm exterior (OD) cánula de acero se reduce a 2 pulgadas de largo, y uno de los extremos hacia abajo hasta que se Dremeled plana. </li><li> A continuación, una pequeña porción (aproximadamente 0,5 x 0,5 cm) se corta de PCB proto-board, para ser utilizado como separador. </li><li> Usando un cortador láser para asegurar que los recortes hechos son perpendiculares a la superficie del material, dos rectángulos iguales (1 / 2 &quot;x 3 / 8&quot;) se cortan de 1 / 8 &quot;láminas de acrílico, cada rectángulo que tiene dos agujeros circulares en esquinas opuestas del rectángulo. El primer agujero tiene un diámetro de 1,5 mm, y es lo suficientemente grande como para mantener la cánula de metal bien. El segundo agujero tiene un diámetro de 1 / 16 &quot;(fig. 1C). </li><li> La cánula de metal se inserta en el orificio de 1,5 mm de un rectángulo, y luego a través del agujero de 1,5 mm de la segunda. El extremo inferior de la cánula está alineado con la cara inferior del rectángulo inferior, adoptando la forma de un palo de hockey. </li><li> Manteniendo el separador firmemente sostiene, entre los dos rectángulos, esta estructura es unirse entre sí por el uso de pegamento caliente alrededor de los agujeros y cánula de 1,5 mm, teniendo cuidado de evitar pegar el separador de los rectángulos. Plastilina puede ser útil para mantener las cosas en este proceso. </li><li> Después de que el pegamento se haya secado, un tornillo de 1-72 se inserta en el orificio de 1 / 16 de la parte superior de los rectángulos. A continuación, una tuerca hexagonal 1-72 se enrosca en el extremo del tornillo de 1-72, y se aprieta. El tornillo y la tuerca que sujetan la abrazadera. </li><li> Para colocar la tuerca de la cara inferior del rectángulo de fondo, una pequeña cantidad de epoxi de 5 minutos se dejan caer por el borde de la tuerca hexagonal, sin permitir que el epoxi para entrar en los hilos de la tuerca hexagonal o tornillo. Cualquier arcilla se extrae, y se confirma que el separador puede ser sostenido firmemente en su lugar apretando el tornillo. </li></ol> 2. Preparación del sistema para la medida amplia de inyección: Hamilton bomba y stereotax <ol><li> El sistema de matriz de inyección pueden ser personalizados para casi cualquier conjunto de coordenadas en el cerebro. </li><li> El primer usuario localiza las coordenadas de los puntos de inyección deseada en un ratón (o de otras especies) atlas del cerebro, convirtiendo a las coordenadas utilizadas en los stereotax (en este caso, X, Y, y Z-coordenadas). El número de sitios de inyección (tres en las figuras 1A y 1B) en adelante se llamará k. </li><li> número k de 10 l jeringas Hamilton se colocan en una bomba de jeringa de inyección / retiro como este aparato de la Universidad de Harvard. </li><li> A continuación, tres metros de largo, pedazos de tubo de polietileno están firmemente adherido a la aguja de cada jeringa Hamilton. </li><li> Por cada pieza de tubo de polietileno, un F-252 tubos de manga Upchurch Científico se desliza sobre el extremo abierto y conectado a un adaptador de tubo P-627 con la tuerca y el casquillo incluye, además de Upchurch Científico. </li></ol> 3. La construcción de la matriz a medida inyector <ol><li> Cada matriz de inyección se adapta al conjunto de coordenadas que el usuario elija. Sin embargo, para conjuntos de coordenadas que sólo difieren en la traducción y / o rotación, la misma variedad de inyección se pueden utilizar. </li><li> Considerando sólo el X relativa y las coordenadas Y de los sitios de inyección, los agujeros k se perforan en un PCB proto-board de espesor 1 / 32 &quot;, con la misma distancia relativa. Estos agujeros son perforados con un molino de Modela mini y un .011&quot; de diámetro de broca de McMaster-Carr. Asegúrese de utilizar un ritmo lento de la perforación (Z-velocidad) para evitar la rotura o desgaste de la broca. Antes de retirar la placa de la planta, un rectángulo es perforado alrededor de los agujeros pequeños, con una broca de mayor diámetro de 1 / 32 &quot;, para evitar el uso de la más pequeña del Código para la fábrica de Mini se puede generar fácilmente utilizando MATLAB;. Muestras código se proporciona en los siguientes archivos. <ol class="lroman"><li> generate.m - código de MATLAB para generar código Modela de coordenadas deseadas </li><li> holes_ex.rml - Modela el código de patrón de timbre de perforación (ocho agujeros) en el proto-board </li><li> outline_ex.rml - Modela el código de rectángulo alrededor de los agujeros de perforación </li></ol></li><li> 245 m OD/100 micras de diámetro interior (ID) tubo capilar de sílice fundida, disponible en las tecnologías de Polymicro, se corta en número k de 3 pedazos de una pulgada. Estos comprenden los inyectores individuales. Una pieza desechable de tubos capilares se asomó a través decada uno de los agujeros, para limpiar los residuos sin obstruir los inyectores real. Los inyectores se inserta a mitad de camino en cada agujero, de modo que se mantienen firmes y paralelas entre sí. Los inyectores son epóxico a la junta, que forman la estructura de la matriz del inyector. Todo lo que queda es ajustar los inyectores a la longitud correcta. </li><li> La matriz de inyección se une a la pinza estereotáxica mediante la colocación de una esquina de la proto-board entre los rectángulos de acrílico, y luego apretando el tornillo de la abrazadera estereotáxica. A continuación, la cánula metálica de la abrazadera se une a la stereotax, utilizando el mecanismo de fijación de la stereotax. </li><li> Todos los siguientes se realiza bajo un microscopio. Para uno de los inyectores exterior (es decir, que puede ser abordado desde el lado con un borde recto, sin chocar con alguno de los inyectores de otro tipo), la punta se extiende más allá de la parte inferior de la proto-board se corta con unas tijeras. Para las inyecciones cortical, es apropiado para que el inyector se extiende aproximadamente 5 mm más allá de la superficie de la proto-board. Para más inyecciones, este número puede ser aumentado por el incremento correspondiente en profundidad. La punta es aplanada con una herramienta Dremel. Consejos inyector también puede ser suelo en un ángulo como medida de precaución adicional contra la obstrucción, si la precisión en la profundidad es menos importante. </li><li> A continuación, un punto de referencia estable que se elija dentro del alcance del brazo estereotáxica, y el conjunto inyector se mueve de manera que la punta plana del exterior del inyector, es en este punto de referencia. </li><li> Un segundo inyector es elegido, junto con sus correspondientes coordenadas. En cuenta es la diferencia relativa de la altura (z) entre las coordenadas inyector primero y segundo. La matriz de inyección se mueve a lo largo del eje Z en esta distancia relativa. El inyector segundos se corta y Dremeled a la longitud correcta, de modo que la punta del inyector segundo plano y ahora es a la altura del punto de referencia. La matriz de inyección se pueden mover en las direcciones X e Y para facilitar la comparación de la punta del inyector con el punto de referencia. </li><li> Este proceso de recorte se repite para el resto de los inyectores. </li></ol> 4. Montaje de todo el sistema <ol><li> La pinza estereotáxica y personalizado conjunto inyector, ambos ya construidos, se requieren para esta parte. </li><li> La parte de atrás de cada inyector (el extremo que no ha sido recortada) se inserta en un azul F-240 y la tubería de manga, con un P-235 tuerca y P-200 casquillos de Upchurch Científico, es conectado al adaptador de rosca ya está conectado a la bomba de Hamilton por la tubería de polietileno. Las instrucciones del fabricante se pueden consultar para más detalles. </li><li> Usando una aguja de calibre 27, aceite de silicona se inyecta en la parte posterior de las jeringas de Hamilton para que el sistema entero está lleno de la jeringa Hamilton a la punta del inyector, sin burbujas de aire en absoluto. </li><li> Como las jeringas Hamilton se vuelven a colocar en la bomba de Hamilton, el mayor volumen posible de aceite de silicona se mantiene en las jeringas. </li><li> Si el experimento requiere más jeringas que la bomba está diseñada para (dos en este caso), las jeringas se pueden colocar pequeños trozos de plástico (por ejemplo, tapas de aguja) para mantenerlos paralelos entre sí, y para asegurarse de que todas las piezas son impulsado por la bomba en la misma medida. O bien, un conjunto de bastidor multi-upgrade se pueden comprar en Harvard Apparatus para almacenar hasta 10 jeringas a la vez. </li></ol> 5. Inyecciones / cirugía <ol><li> El proceso de inyección con inyector de un paralelo es muy similar a la de la inyección con una pipeta única. </li><li> Es esencial el uso de recarga lenta / infundir las tasas a lo largo de este proceso, ya que rápidamente el bombeo podría poner presión sobre la articulación entre la tubería de grandes y pequeños. Peso máximo recomendado de la tasa: 2 l / min para la carga de virus, y 0,1 l / min para infundir virus. </li><li> Un ratón anestesiado se coloca en el stereotax, y permanece anestesiado durante todo el experimento. </li><li> Prepare el ratón, según sea necesario. Por ejemplo, con un bisturí, un solo corte se realiza por la línea media de la piel, de entre los ojos entre las orejas. La piel se estira hacia atrás para exponer el cráneo, y la fascia se limpia. Una pipeta de vidrio tirado se une a la stereotax. Las posiciones de las barras de la oreja se ajustan hasta bregma y lambda están alineados a la misma altura, y para que la línea que conecta ellos es paralelo al eje de la stereotax. Los ejes de la stereotax se orientan de acuerdo con el sistema de coordenadas en el que las coordenadas de la inyección se han calculado. El estereotáxica se pone a cero con la punta de la pipeta de vidrio en el bregma, y ​​luego la punta se coloca ligeramente por encima del cráneo, en la X e Y las coordenadas de uno de los sitios de inyección. </li><li> Usando un taladro dental, el cráneo debajo de la punta es cuidadosamente comparación de distancia hasta que queda una capa muy delgada de hueso. La pipeta de vidrio puede ser menored y se crió para comprobar que el agujero se perfora se centra en la posición correcta. Usando una aguja de calibre 30, un pequeño trozo de la capa es suave interceptado, en el X-y corregir las coordenadas, de modo que la duramadre se expone. Este agujero debe ser lo suficientemente grande como para ajustarse a uno de los inyectores (0,25 mm de ancho). Ver Figura 1 D para el diagrama. De esta manera, los pequeños agujeros, ancho de 0,25 mm se hacen en el cráneo, en la X e Y las coordenadas correspondientes a cada sitio de la inyección. </li><li> La pipeta de vidrio se desecha en un contenedor de objetos punzantes, y la medida amplia de inyección se une a la stereotax con la abrazadera estereotáxica. </li><li> Con el fin de ajustar correctamente el ángulo de la matriz de inyección, inyectores dos exteriores son elegidos para ser calibrados a un punto de referencia determinado, de la siguiente manera. Después de uno de los inyectores se corresponde con el punto de referencia, tenga en cuenta la relación X e Y las distancias entre los puntos de inyección en relación con este inyector y el otro. Los ejes de la stereotax se ajustan de manera que todo el conjunto inyector se mueve en la X e Y las direcciones de estas distancias relativas. Si el inyector segundo no está alineado con el punto de referencia, la cánula de metal se afloja y se gira. Este proceso se repite iterativamente hasta que la matriz de inyección tiene un ángulo correcto. </li><li> Antes de llenar los inyectores con el virus, los inyectores están llenos de aceite de silicona hasta que las jeringas se encuentran en el punto 2 l (o superior). Esto proporciona una zona de amortiguamiento, por lo que las burbujas de aire o la obstrucción en la punta se puede quitar fácilmente empujando hacia adelante con aceite de la bomba de Hamilton, sin tener que volver a llenar el sistema con aceite de silicona de la parte posterior de las jeringas, como se describe anteriormente. </li><li> Un trozo de Parafilm estéril se coloca en el cráneo, y los inyectores son ligeramente baja en el Parafilm. Para las coordenadas con profundidades muy variables, una costumbre elaborado: una parte (por ejemplo, un objeto con forma de escalera) pueden facilitar la carga. </li><li> Las partes siguientes se supone que uno de l virus se va a cargar en cada lugar (las siguientes cantidades deben reducirse si se desean cantidades más pequeñas). Con el fin de garantizar que&gt; 1 l de virus se inyecta en cada sitio, de 1,5 l de virus es pipeta en el Parafilm o escalera en la punta de cada inyector. </li><li> Con la tasa de recambio de la bomba de Hamilton pone a 1 l / min, 1,2 l de que el virus se vuelve a llenar en cada inyector. </li><li> La punta de los más largos del inyector se pone a cero en el bregma, a continuación, la matriz de inyección se desplaza a la X e Y las coordenadas de ese inyector. Si la obstrucción es un problema, dicen que si muchos objetivos profundos están involucrados: incluso antes de insertar las puntas de inyección en el cerebro, a veces es aconsejable comenzar la infusión de la bomba, hasta que el virus se puede ver que salen de todos los consejos del inyector. Esto elimina las burbujas de aire en la punta del inyector, y también asegura que no se atasque. En el caso de la obstrucción, la bomba de Hamilton se encuentra a infundir un breve pulso a una velocidad mayor de 2 l / min, para limpiar suavemente la obstrucción. </li><li> La matriz de inyección se hace descender, a través de los pequeños orificios hechos con las agujas de calibre 30, a la correcta Z-profundidad. </li><li> 1 l de virus es inyectado a través de cada inyector, a 0,1 l / min. </li><li> Las inyecciones se quedan solos durante 30 minutos. </li><li> Después de la matriz inyector extrae lentamente desde el cerebro, la bomba de Hamilton está en infundir a la misma tasa de 0,1 l / min, con el fin de comprobar si la obstrucción en cada inyector. </li><li> A continuación, los inyectores se limpian por la reposición y la infusión de 1,5 l de etanol a 2 l / min. </li><li> Finalmente, los inyectores se rellenan con aceite de silicona para mantener la zona de amortiguación 2 l de cada jeringa Hamilton. </li><li> Todo el equipo debe ser esterilizado antes y después del procedimiento, de acuerdo con la bioseguridad de su institución y los protocolos de uso animal. </li></ol> 6. Resultados representante El paralelo conjunto inyector acelera una cirugía más o menos por un factor igual a la cantidad de inyectores, sin contar la instalación y el tiempo de recuperación, aunque los tiempos individuales dependerá de la habilidad del médico. Para una inyección de 1 microlitro, por lo general ver la expresión de lentivirus en una esfera de aproximadamente 1 mm de diámetro (Fig. 1E). La precisión de la inyección era tal que la variabilidad en el posicionamiento de la punta, a partir de los ensayos, fue de aproximadamente 45 micras (desviación estándar de la distancia desde la posición de la punta a la posición de punta de la intención). <img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diseño, implementación y uso de un virus en paralelo serie inyector. Un esquema, del sistema de matriz paralela inyector, mostrando una triple configuración de los inyectores, por tres inyecciones simultáneas. B, la fotografía de una matriz de tres paralelos de inyección como en el diagrama de un . <stRong&gt; C, abrazadera estereotáxica, que se muestra en líneas generales desde la parte superior D, la ilustración de la técnica para una eficiente, minimizando el daño-, la apertura de agujeros en el cráneo para inyector de inserción en el cerebro:. con un taladro dental, delgada del cráneo hasta espesor de ~ 50 micrones, a continuación, utilizar la punta de una aguja para abrir una pequeña craneotomía. E, que muestra imágenes de fluorescencia canalrodopsina-2 (ChR2)-GFP-etiquetados células en tres regiones corticales del ratón, como se había previsto por la triple serie de inyección se muestra en la B.

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	<li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+halorhodopsin+variants+for+improved+genetically-targetable+optical+neural+silencing.">High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. , (2009).</li><li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration.">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li><li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain.">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity,+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li><li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells.">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li><li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels.">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li></ol>

Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo con la Guía del NIH para animales de laboratorio y aprobado por el Cuidado de Animales del MIT y el empleo y los Comités de Seguridad de la Biotecnología.

En los últimos años, una serie de organismos genéticamente codificados sensibilizadores óptica han permitido a las neuronas que se activan y silenciados en vivo de una manera temporal, precisa, en respuesta a breves pulsos de luz (por ejemplo, 1,4,5,6,7,8 , 11). Un método clave con la que las neuronas se han sensibilizado a la luz en el cerebro de los mamíferos, es a través de virus como lentivirus y virus adeno-asociados (AAV), que pueden entregar los genes que codifican para opsinas a los cerebros de los animales que van desde los ratones a los monos, en un forma segura y duradera (por ejemplo, 2,9,10). Los virus más rápido tiempo de respuesta permite que los transgénicos, especialmente para los organismos que no son organismos genética modelo como las ratas y monos, y por opsinas pueden permitir altos niveles de expresión que no puede ser posible en los escenarios de transgénicos. Aquí se demuestra una serie paralela de inyección capaz de crear, en un plazo de tiempo rápido &quot;, circuito a nivel de los transgénicos&quot;, que permite todo en 3 dimensiones las estructuras del cerebro que se forma viral dirigida a un gen, en un paso quirúrgico. La matriz de inyección comprende una o más bombas de desplazamiento que cada unidad de un conjunto de jeringas, cada uno de los que se alimenta en una de sílice fundida de poliamida / capilar a través de un conector de alta presión de alta disponibilidad. Los capilares son de tamaño, y después se inserta en, lugares deseados especificados por la costumbre, el fresado de una placa de posicionamiento estereotáctica, permitiendo así que los virus u otros reactivos que se entregarán al conjunto deseado de las regiones del cerebro. Para utilizar el dispositivo, el primer cirujano llena el subsistema de fluidos en su totalidad con petróleo, rellenos de los capilares con el virus, se inserta el dispositivo en el cerebro, e infunde reactivos lentamente (&lt;0,1 l / min). Esta tecnología permitirá que una amplia variedad de nuevos tipos de experimentos, como la escala de tiempo de milisegundos cierre de forma compleja en forma de estructuras (tales como el hipocampo) en momentos precisos en el comportamiento, la inactivación temporal, precisa de estructuras bilaterales que pueden actuar de forma redundante (como la izquierda y la amígdala derecha), y la perturbación de múltiples regiones cerebrales discretas (por ejemplo, conducir dos regiones conectados fuera de fase para estudiar cómo cruzada región sincronía depende de la actividad dentro de cada región, o estimular las entradas a una región, mientras que el silenciamiento de un subconjunto de los objetivos a fin de comprender cuál de los varios objetivos son fundamentales para la mediación de los efectos de los insumos). Para los grandes cerebros como los de los primates, en el que hemos demostrado recientemente óptico tipo de célula específica de activación neural 3, perturbando la actividad en un área de comportamiento relevantes pueden requerir el etiquetado viral de las estructuras grandes y complejas. Tomamos nota de que en paralelo matrices de inyección puede ser utilizado para inyectar casi cualquier carga - drogas, neuromoduladores, los neurotransmisores, o incluso células - en el complejo de 3-D los patrones en el cerebro, de manera temporal, precisa. Por último, desde el punto de vista de traslación, es posible que el rápido, el paciente a medida terapia génica o dispositivos de administración de fármacos puede ser rápidamente diseñados y fabricados para que coincida con geometrías individuales del cerebro, el apoyo a nuevos tratamientos para una variedad de patologías, posiblemente mediante el uso de moléculas de control óptico. Las matrices de inyección están diseñados para ser más precisos, tanto espacial como volumétrica. En la X e Y las direcciones, esto se logra mediante la perforación de los agujeros con gran precisión puesto con un mini-molino de bajo costo, con los agujeros lo suficientemente grande como para ajustarse a los inyectores, de modo que los inyectores se mantienen paralelos entre sí, y de manera precisa ubicación. En la dirección Z, los inyectores se cortan con un aparato estereotáxico, lo que permite un nivel de precisión equivalente a la de la cirugía estereotáxica en sí. La precisión volumétrica surge de la precisión de la bomba de Hamilton, así como la casi nula volúmenes muertos conectores, una adaptación de la cromatografía líquida de alta presión (HPLC) sobre el terreno. Los inyectores son obtenidos de un tubo capilar de sílice fundida, que es fuerte y lo suficientemente rígido que mantiene la forma precisa y el espacio bajo presión, sin que el espesor de la pared más grande de alternativas tales como cánulas de acero. Pequeñas modificaciones se pueden hacer fácilmente para adaptar el conjunto inyector paralelo a una variedad de experimentos. Por ejemplo, si un menor volumen de virus o espaciamiento más fino se requiere, más pequeño tubo capilar puede ser empleado, junto con una broca correspondiente más pequeño. Dispositivos en el futuro podrán utilizar canales de microfluidos y bombas, para aumentar el número de inyectores en paralelo, para reducir al mínimo el tamaño (tal vez permita a estos dispositivos para ser montado en la cabeza de libertad de movimiento de los animales).

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dremel Tool</td>
<td>Tool</td>
<td>Dremel</td>
<td>3956-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Cutter</td>
<td>Tool</td>
<td>Universal Laser Systems</td>
<td>VLS2.30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot glue gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Stanley Bostitch</td>
<td>GR20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump)</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton syringes</td>
<td>Tool</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>701N</td>
<td>Need one per injection site</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse stereotax</td>
<td>Tool</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51725D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Modela mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Roland</td>
<td>MDX-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.011" diameter drill bit for mini mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8915A12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/32" diameter drill bit For mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>8848A35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High speed dental drill</td>
<td>Tool</td>
<td>Lynx</td>
<td>333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dental drill accessories</td>
<td>Tool</td>
<td>Pearson</td>
<td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HTX-15R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 binding slotted machine screw</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>MX-0172B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 hex nut</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HNX-0172</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCB proto-board, 1/32" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Digi-Key</td>
<td>PC57-T-ND</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylic Sheet, 1/8" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8560K239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HPLC connectors</td>
<td>Material</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an &#x2018;x&#x2019; to the end of the part number)</td>
<td>Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused</td>
</tr>
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing, OD: 245 &mu;m, ID: 100 &mu;m</td>
<td>Material</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>2000022-10M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
<td>Material</td>
<td>Permatex</td>
<td>84101</td>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyethylene tubing .066 x .095 inch</td>
<td>Material</td>
<td>VWR</td>
<td>63018-827</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

scalable fluidic injector arrays for viral targeting of intact 3-d brain circuits

Nuestra comprensión de los circuitos neuronales - cómo mediar en los cálculos que la sensación subserve, pensamiento, emoción y acción, y la forma en que están dañados en enfermedades neurológicas y psiquiátricas - se vería enormemente facilitada por una tecnología para la rápida selección de genes complejo 3 - dimensiones circuitos neuronales, lo que permite la rápida creación de &quot;nivel de circuito transgénicos.&quot; Recientemente hemos desarrollado métodos de codificación en el que los virus sensibles a la luz de las proteínas pueden sensibilizar a los tipos específicos de células a escala de tiempo de milisegundos de activación y silenciamiento en el cerebro intacto. Presentamos aquí el diseño e implementación de una matriz de inyección capaz de entregar los virus (y otros líquidos) a docenas de puntos definidos dentro de la estructura 3-dimensional del cerebro (<strong&gt; Figura. 1A, 1B</strong&gt;). La matriz de inyección comprende una o más bombas de desplazamiento que cada unidad de un conjunto de jeringas, cada uno de los que se alimenta en una de sílice fundida de poliamida / capilar a través de un conector de alta presión de alta disponibilidad. Los capilares son de tamaño, y después se inserta en, lugares deseados especificados por la costumbre, el fresado de una placa de posicionamiento estereotáctica, permitiendo así que los virus u otros reactivos que se entregarán al conjunto deseado de las regiones del cerebro. Para utilizar el dispositivo, el primer cirujano llena el subsistema de fluidos en su totalidad con petróleo, rellenos de los capilares con el virus, se inserta el dispositivo en el cerebro, e infunde reactivos lentamente (&lt;0,1 microlitros / min). La naturaleza paralela de la matriz de inyección facilita el etiquetado rápido, preciso, robusto y de toda circuitos neuronales con capacidades de carga viral tal como sensibilizadores óptica para permitir que la luz de activación y el silenciamiento de los circuitos cerebrales definidos. Junto con otras tecnologías, como las matrices de fibra óptica para la entrega de la luz a los conjuntos deseados de las regiones del cerebro, que esperamos crear una caja de herramientas que permite a la sistemática exploración de causal funciones neuronales en el cerebro intacto. Esta tecnología no sólo puede abrir tales métodos sistemáticos para circuito centrado en la neurociencia en los mamíferos, y de facilitar el etiquetado de las regiones del cerebro en los animales grandes, como los primates no humanos, pero también puede abrir un camino de traslación clínica de células específicas de prótesis de control óptico , cuya precisión puede permitir un mejor tratamiento de los trastornos cerebrales intratables. Finalmente, los dispositivos como se describe aquí puede facilitar precisamente el momento oportuno suministro de fluidos de otras cargas, como las células madre y los agentes farmacológicos, a tres dimensiones de estructuras, de manera fácilmente personalizable por el usuario.

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Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Control y análisis de circuitos neuronales<em&gt; In vivo</em&gt; Se vería facilitada por una tecnología para la entrega de los virus y otros reactivos que desee en 3 dimensiones conjuntos de las regiones del cerebro. Demostramos a medida de fluidos de fabricación de serie del inyector, y la entrega de forma viral codificada sensibilizadores óptica, que permite la manipulación óptica de los circuitos cerebrales complejas.

Escalable neumático matrices inyector para Viral focalización de los circuitos cerebrales intactas en 3-D

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K vistas.  Massachusetts Institute of Technology. Control y análisis de circuitos neuronales In vivo Se vería facilitada por una tecnología para la entrega de los virus y otros reactivos que desee en 3 dimensiones conjuntos de las regiones del cerebro. Demostramos a medida de fluidos de fabricación de serie del inyector, y la entrega de forma viral codificada sensibilizadores óptica, que permite la manipulación óptica de los circuitos cerebrales complejas.

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Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

Focalización de estructuras profundas del cerebro con microinyecciones de entrega de medicamentos, vectores virales, o trasplantes de células

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Investigación

Neurociencias

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Caracterización histológica de avería Microdevices Brain-implantado y el tejido circundante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Registro electrofisiológico en el cerebro del pez cebra adultos Intacto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

Imaging 3-D y Análisis de neuronas infectadas<em&gt; En Vivo</em&gt; Con<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Modificación de un Colliculo-tálamo-cortical del ratón Cerebro Loncha, incorporación de la impresión 3-D de la Cámara Componentes e Imagen óptica multi-escala

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo Optogenética Disección de circuitos del miedo en rodajas de cerebro

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not represent the underlying cytoarchitectural and functional complexity of the affected individuals carrying suspected disease variants. Conventional 2-D models remain incomplete representations of in vivo-like structures and do not adequately capture the complexity of the brain. Thus, there is an emerging need for more 3-D hiPSC-based models that can better recapitulate the cellular interactions and functions seen in an in vivo system.
Here we report a protocol to develop a 3-D system from undifferentiated hiPSCs based on the serum free embryoid body (SFEB). This 3-D model mirrors aspects of a developing ventralized neocortex and allows for studies into functions integral to living neural cells and intact tissue such as migration, connectivity, communication, and maturation. Specifically, we demonstrate that the SFEBs using our protocol can be interrogated using physiologically relevant and high-content cell based assays such as calcium imaging, and multi-electrode array (MEA) recordings without cryosectioning. In the case of MEA recordings, we demonstrate that SFEBs increase both spike activity and network-level bursting activity during long-term culturing. This SFEB protocol provides a robust and scalable system for the study of developing network formation in a 3-D model that captures aspects of early cortical development.

Here we report a protocol to develop a three-dimensional (3-D) system from human induced-pluripotent stem cells (hiPSCs) called the serum free embryoid body (SFEB). This 3-D model can be used like an organotypic slice culture to model human cortical development and for the physiological interrogation of developing neural circuits.

Desarrollo de cuerpos embrionarios libres de suero derivados de HiPSC para la interrogación de cultivos de células madre tridimensionales usando ensayos fisiológicamente relevantes

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Generación de hidrogeles a base de colágeno 3D para analizar el crecimiento y el comportamiento axonal durante el desarrollo del sistema nervioso

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and smaller functional subgroups, it becomes paramount to record from projections and/or genetically-defined subpopulations of neurons. Fiber photometry is an accessible and powerful approach that can overcome these challenges. By combining optical and genetic methodologies, neural activity can be measured in deep brain structures by expressing genetically-encoded calcium indicators, which translate neural activity into an optical signal that can be easily measured. The current protocol details the components of a multi-fiber photometry system, how to access deep brain structures to deliver and collect light, a method to account for motion artifacts, and how to process and analyze fluorescent signals. The protocol details experimental considerations when performing single and dual color imaging, from either single or multiple implanted optic fibers.

This protocol details how to implement and perform multi-fiber photometry recordings, how to correct for calcium-independent artifacts, and important considerations for dual-color photometry imaging.

Fotometría multifibra para registrar la actividad neuronal en animales en movimiento libre

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...