Damos las gracias a Brian G. Coon y Claudia B. Hanna útil para los debates y el apoyo. Este proyecto fue financiado por los fondos iniciales de la Dip. de Ciencias Biológicas de la Universidad de Purdue a Claudio R. Aguilar y una subvención de la American Cancer Society Institucional de Investigación de Claudio R. Aguilar a través del Centro de Cáncer de Purdue.

A. cultivo celular y la inducción de proteínas En esta sección se describen las condiciones de cultivo celular, ciclo celular de sincronización con nocodazole, seguida por la inducción de la expresión de la proteína de un promotor regulable en células de levadura. <ol><li> El tipo salvaje cepa de levadura W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) se transforma con la copia de alta (2μ) plásmido de ADN que contiene nuestro gen de interés (ENTH2) bajo el control de un promotor reprimible metionina (MET25). Metionina 2mM es suficiente para suprimir la actividad del promotor, mientras que los medios de comunicación carecen de metionina permite la máxima expresión. Por lo tanto, un rango de concentraciones de metionina se puede utilizar para expresar la proteína en el nivel deseado. Una transformación del plásmido de ADN en las células W303 se realiza mediante el método LiAc-TE de acuerdo con los procedimientos estándar de 2. Nota: Este experimento debe ser realizado por cultivar las células durante la noche en la presencia de 2 mM metionina para asegurar la expresión de la proteína sólo en los niveles de fondo. A la mañana siguiente, la expresión de proteínas debe ser inducida por la resuspensión de las células en los medios de comunicación carecen de metionina inmediatamente después de la sincronización del ciclo celular (aproximadamente 4 horas). Sin embargo, hemos encontrado que el fenotipo de células ENTH2 dependiente de la división se induce sólo después de una considerable concentración de ENTH2 se ha acumulado en las células (normalmente después de 4-6h de la inducción de la proteína 3), por lo que el transcurso del tiempo para el análisis de todas las manifestaciones de el fenotipo muy largo (por lo menos a las 16h). Hemos encontrado que el crecimiento de las células durante la noche en la presencia de metionina 0,2 reprime el fenotipo morfológico, pero permite la concentración de proteínas subcrítico que pueden aumentar rápidamente a los niveles de inducir el fenotipo cuando se transfiere a los medios de comunicación carecen de metionina. Esto permite un análisis detallado de las manifestaciones graves del defecto la división celular en un período relativamente corto de tiempo. Nosotros por lo tanto, recomendamos que el experimentador determinar la concentración de metionina que es por debajo del umbral para la inducción del fenotipo sobre una base caso por caso. </li><li> Escoger seis colonias de una placa que contiene las células transformado recientemente y se inoculan en 50 ml de medio selectivo con 0,2 metionina en un matraz cónico de esterilizar utilizando técnicas estériles. Incubar toda la noche a 30 ° C con agitación a 200 rpm. (Para más información sobre las condiciones estándar de cultivo de levadura, ver ref. 4) </li><li> A la mañana siguiente, la estimación de la densidad celular mediante la medición de la densidad óptica del cultivo a 600 nm. Transferir el equivalente a 20 OD 600 nm de las células en un tubo de centrífuga estéril y la cosecha de gira a 2200 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender las células en YPD a una concentración de 0,4 OD 600 nm / ml y añadir nocodazole a una concentración final de 15μg/ml de partir de un stock de 1mg/ml en DMSO. Se incuba durante 4 horas a 30 ° C con agitación a 200 rpm. Nota: Los métodos alternativos de detención incluido el arresto en la fase G0 con alfa-factor o en fase G1-S con hidroxiurea puede ser utilizado. Hemos encontrado que la detención de la mitosis con nocodazole es simple y efectivo para nuestros propósitos. </li><li> Después de 4 horas, comprobar el porcentaje de células detenidas en la mitosis, contando el número de células con igual tamaño de los brotes mediante la visualización en el microscopio. Si el paro es superior al 90%, pasar a la etapa siguiente. De lo contrario, mantener las células en nocodazole hasta el porcentaje deseado de arresto mitótico se logra. </li><li> Las células de la cosecha por centrifugación a 2200 rpm durante 5 minutos y lavar con agua fría tres veces. Después del último lavado, resuspender el precipitado en medios selectivos que carecen de metionina a una densidad celular de ~ 600 nm 0,5 OD / ml. La transferencia de la mitad del volumen de las células a un tubo estéril y añadir nuevos metionina a una concentración de 0,2 mm final. Esto servirá como un control de los efectos debidos a los niveles basales de expresión de la proteína. Esto marca el primer punto de tiempo del experimento (tiempo = 0 h). Analizar las células de cada hora durante 6 horas. </li></ol> B. Análisis para el Desarrollo Fenotipo Nota: Todos los métodos de análisis se describen a continuación no es necesario llevar a cabo de forma simultánea. Determinación de los niveles de expresión de la proteína por Western Blot <ol><li> En cada punto del tiempo, medir el OD 600nm de la cultura y la cosecha 2 OD 600nm equivalentes de las células por centrifugación a 2200 rpm durante 5 minutos. </li><li> Resuspender el precipitado en 1 ml de agua estéril y transferir la suspensión a un tubo eppendorf de 1,5 ml. Repetir la centrifugación para obtener un pellet. Aspirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en 50μl de SDS-PAGE Laemmli muestra de amortiguación (50 mM Tris pH 6,8, SDS 2%, glicerol al 10%, 2% de β-mercaptoetanol y 0,006% azul de bromofenol). Añadir 50μl de perlas de vidrio lavado con ácido (0.2-0.4 micras de diámetro) y agitar durante 1 minuto. </li><li> Tubos de ebullición en un 95 ° C de calor block durante 2 minutos y agitar de nuevo durante 30 segundos y volver a hervir durante 5 minutos. Congelar la muestra de proteína a -20 ° C. </li><li> Ejecutar las muestras de proteínas en un 12% SDS-PAGE gel, transferencia a una membrana de nitrocelulosa y realizar Western Blot con anticuerpos adecuados para detectar la proteína de interés. En este ejemplo, la sonda de la presencia de la hemaglutinina (HA) etiquetados dominios Enth mediante la incubación con el ratón anticuerpos anti-HA (Covance, Princeton, NJ) en la dilución 1:2000 en BLOTTO-Tween (1XPBS, 5% sin grasa leche en polvo , 0,1% Tween). HRP etiquetados de cabra anti-anticuerpo secundario del ratón (Pierce) a una dilución de 1:2500, también en Blotto-Tween, se permite obligar a la primaria de anticuerpos en la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente. Supersignal sustrato West Pico quimioluminiscente se utiliza para detectar anticuerpos de ratón HRP etiquetados contra. </li><li> Cuantificar los niveles de expresión de la proteína por densitometría. </li></ol> Esta sección describe dos métodos de desarrollo de fenotipo de seguimiento en función de la concentración de proteínas en aumento. El primer método consiste en células de base poblacional, mientras que los estudios de segundo en el nivel de una sola célula. La cuantificación del fenotipo de la división celular y muerte celular <ol><li> En cada punto del tiempo, la transferencia de 1 ml de suspensión celular a un tubo estéril eppendorf con técnicas estériles y las células de la cosecha por centrifugación a 2200 rpm durante 5 minutos. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 70μl los medios de comunicación, seguido de metileno 30μl azul de un stock de 1mg/ml en agua estéril. El azul de metileno es un colorante azul vital que se vuelve incolora en el entorno de la reducción del citosol por lo tanto, las células muertas se pueden identificar por su color azul. </li><li> Pipeta ~ 6μl de esta suspensión en un portaobjetos de vidrio limpio y coloque un cubreobjetos sobre la gota. Presione suavemente el cubreobjetos para formar una capa fina y uniforme de las células entre las interfaces de vidrio. </li><li> Divide el cubreobjetos en 9 cuadrantes y tomar tres imágenes por cuadrante, como se indica en la figura. 2. El número de células / campo no debe ser mayor de 30 células para permitir la cuantificación exacta. Cada portaobjetos se pueden obtener imágenes durante unos 15 minutos antes de las burbujas de aire daño a la preparación. </li><li> Cuente el número de células que muestran el fenotipo en estudio. El defecto en la división celular inducida por la sobreexpresión ENTH2 conduce a la muerte celular y, por tanto, también contamos con el número de células muertas identificadas por su color azul. </li><li> Calcular el porcentaje de células fenotípica. </li><li> Representar los datos como se muestra en la figura. 3. </li></ol> Visualización del fenotipo específico defectos mediante microscopía de fluorescencia La división celular, las células defectuosas, como se ve en ENTH2 sobreexpresión, se caracterizan a menudo por defectos de la pared celular y septina mislocalization3 (visualizado como proteínas de fusión GFP). La pared celular de la levadura en ciernes pueden ser fácilmente visualizados por tinción con blanco de calcoflúor (CFW), que se une irreversiblemente a la quitina en las paredes celulares de la levadura. <ol><li> 1 ml en cada alícuota punto de tiempo, de la cultura en un tubo estéril eppendorf y las células de la cosecha por centrifugación a 2200 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender el botón celular en 100μl de la solución de 1mg/ml CFW en agua estéril y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Las células de la cosecha por centrifugación y lavado 3 veces con PBS 1X. </li><li> Resuspender el precipitado en 100μl PBS 1X y la imagen bajo el microscopio utilizando la óptica UV (pared celular) y el filtro FITC (GFP-septina) con una ampliación de 100X. </li><li> Cuantificar el porcentaje de células con defectos de la pared celular y la deslocalización septina siguiendo los pasos 4-6 en el apartado B.2.1 </li></ol> B.3. Determinación de desarrollo en el fenotipo de célula de nivel simple: Time-lapse microscopía de vídeo. <ol><li> Limpiar un portaobjetos de vidrio con una depresión cóncava con un 70% de alcohol y dejar secar al aire. </li><li> Hervir 0.06g de agarosa en 5 ml medios selectivos que carecen de metionina en un tubo de vidrio estéril en un horno de microondas hasta que la agarosa se disuelva completamente. </li><li> Rápidamente 200μl pipeta de la agarosa que contiene los medios de comunicación en la depresión de diapositivas e invertir otro portaobjetos de vidrio limpio sobre ella, asegurándose de que no queden burbujas de aire atrapadas debajo. </li><li> Cuando el gel se solidifica, mover la diapositiva en la parte superior sin problemas fuera de la diapositiva depresión, manteniendo sus superficies paralelas en todo momento. Esto asegura que la superficie de la cama de agarosa al ras de la superficie de la diapositiva depresión. Limpie la zona de diapositivas rodean la cama de agarosa con un delicado tejido. La diapositiva está listo para su uso. </li><li> En el tiempo = 4 horas, 1 ml de la transferencia de células de la cultura a un tubo estéril eppendorf y la cosecha por centrifugación a 2200 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Nota: Se recomienda un tiempo después del punto se elegirá para asegurar altos niveles de expresión de la proteína para que el desarrollo fenotipo está garantizada. Experiencias piloto están obligados a detere los tiempos de inducción sobre una base caso por caso. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 100μl de agua dulce carecen de medios selectivos metionina. </li><li> Aplique vaselina en los bordes del cubreobjetos. A continuación, coloque una gota de suspensión celular en el centro de la cama de agarosa y se repartirán uniformemente presionando suavemente un cubreobjetos sobre ellos. </li><li> Sellar los bordes del cubreobjetos con vaselina y fijar su posición, alineando los bordes con esmalte de uñas. Espere hasta que se seque el esmalte de uñas. </li><li> Colocar la placa en un escenario caliente de un microscopio y elegir un campo que no contiene más de 10 células espaciadas adecuadamente. Como las células se dividen, el campo se llene con el tiempo. </li><li> Tomar una imagen del campo cada 5 minutos durante ~ 5 horas. Progresión fenotipo puede ser estudiado mediante el ensamblaje de las imágenes en una película utilizando el software ImageJ ( <a name="cite">Rasband, WS, ImageJ, EE.UU. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EE.UU., http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 -2005</a> ) </li></ol> Nota: Usamos Zeiss Axiovert 200M microscopio Zeiss Axiocam MRM blanco y negro de la cámara digital y lente Carl Zeiss imagen Axiovision adquisición de software (versión 4.4) para imágenes de células vivas. El control de temperatura se logra mediante la colocación de diapositivas en un escenario calentado mantuvo a 30 ° C por la PECON Tempcontrol 37 dispositivo. Con el fin de evitar volver a ajustar el enfoque en repetidas ocasiones, es conveniente programar el software de adquisición de imágenes para adquirir de forma automática unos pocos z-stack imágenes en cada punto del tiempo y elegir la imagen con el mejor enfoque más tarde, cuando el montaje de la película. Algunos programas de adquisición de imágenes tienen la opción de enfoque automático de experimentos de tiempo. Es conveniente utilizar esta opción en la que esté disponible. Salvaje células de levadura tipo crecen mejor a 30 ° C por lo tanto, el control de la temperatura es crítica. A fin de asegurar una calefacción adecuada, es útil para proporcionar una fuente de calor externa, además de la etapa de calefacción. Por ejemplo, dejamos la luz transmitida blanca del microscopio para toda la duración de las imágenes. También es fundamental para evitar las burbujas de aire en la preparación de la cama de agarosa y un bocadillo de la célula. El aire atrapado en las burbujas se expande cuando se calienta con el tiempo y tienden a empujar a las células fuera del campo se va a examinar. También es importante asegurarse de que las posiciones de células individuales en el campo no cambian apreciablemente durante la duración del proceso de imagen, sobre todo durante la re-enfoque intentos. Plugins de estabilización de imagen están disponibles para ImageJ para corregir pequeños cambios en la posición de la célula después de la película ha sido montada. ( <a href="http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html">http://www.cs.cmu.edu/ ~ Kangli / code / Image_Stabilizer.html</a> ).

<ol>
	<li>R&#246;nicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).</li><li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway.">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).</li><li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , 3-21 (1991).</li></ol>

Este protocolo describe la manera de supervisar el desarrollo de un fenotipo morfológico (célula de levadura no pueden someterse a la división celular adecuada) a sobreexpresión de la proteína. Cuando se realiza este procedimiento, es importante recordar que la cosecha de células de levadura por granulación a la velocidad de centrifugado se recomienda como una mayor velocidad puede dañar las células y los resultados oscuro. El azul de metileno y el blanco calcofluor debe agregarse a las células vivas justo ant...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Nocodazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>M1404</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene Blue 1% (w/v)</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW6276-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcofluor White</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>F3543</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petroleum Jelly</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW3339-2</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of the development of a morphological phenotype as a function of protein concentration in budding yeast

Deleción del gen y la sobreexpresión de la proteína son métodos comunes para el estudio de las funciones de las proteínas. En este artículo se describe un protocolo para el análisis del fenotipo de desarrollo en función de la concentración de proteínas en la población y de una sola célula en los niveles<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Aunque este protocolo se basa en la sobre-expresión de una proteína, que puede ser fácilmente adaptado a fenotipos morfológicos dependientes de la supresión de la expresión de la proteína. Nuestro laboratorio está interesado en estudiar las propiedades de señalización de la proteína epsin adaptador endocítica. Para tal fin se utilizó un enfoque negativo dominante en el que sobre-expresa la conservación<u&gt; E</u&gt; PSIN<u&gt; N</u&gt; -<u&gt; T</u&gt; Erminal<u&gt; H</u&gt; Omology (Enth) de dominio con el fin de interferir con las funciones de la endógena epsin-2 (Ent2 o YLR206W). Hemos observado que la sobreexpresión del dominio Enth de Ent2 (ENTH2) en células de tipo salvaje llevó a un defecto de la división celular que depende de la deslocalización de una familia de proteínas de andamiaje, septins.

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Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Deleción del gen y la sobreexpresión de la proteína son métodos comunes para el estudio de las funciones de las proteínas. En este artículo se describe un protocolo para el análisis del fenotipo de desarrollo en función de la concentración de proteínas en la población y de una sola célula en los niveles<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;.

Análisis de la elaboración de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la levadura en ciernes

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.7K vistas.  Purdue University. Deleción del gen y la sobreexpresión de la proteína son métodos comunes para el estudio de las funciones de las proteínas. En este artículo se describe un protocolo para el análisis del fenotipo de desarrollo en función de la concentración de proteínas en la población y de una sola célula en los niveles Saccharomyces cerevisiae.

Video: Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

El uso de Rotorod como un método para el análisis cualitativo de la Ruta de la rata

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Investigación

Biología

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Medición de Span replicativa vida en la levadura en ciernes

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

La importancia de la concentración de la proteína correcta para la cinética y la determinación de afinidad en el análisis de la estructura-función

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Análisis de Composición Nephron y función en el riñón adultos de pez cebra

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Proteína técnica de purificación que permite la detección de Sumoylation y Ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro Proteínas Ndc10 y Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Imágenes de alta resolución y análisis de la dinámica de microtúbulos astrales individuales de levadura en ciernes

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...