Nos gustaría dar las gracias a Laura Schippers para escribir las primeras versiones del protocolo de carga celular y Marcus de Goffau y Guille Zampar atinar morfologías mitocondriales.

1. Producción y Elaboración de una oblea de silicio del molde Chips de microfluidos se crean a partir de un molde de obleas de silicio producido por la litografía blanda. Estas obleas se pueden reutilizar muchas veces para producir chips de microfluidos. Es aconsejable que la producción de una oblea respectiva se lleva a cabo por un grupo especializado en la microfluídica 6. La oblea se hace en un proceso de fotolitografía en dos etapas utilizando dos capas diferentes de material fotorresistente negativo, SU-8 7. La capa inferior se utiliza para generar la zona de atrapamiento celular (SU-8 2002; altura de 3-4 micras), mientras que los canales se hacen con la capa superior (SU-8 2010; altura de 10 micras). Una impresión del proceso de producción de obleas se puede encontrar en Huang et al 8. Los dibujos de los chips de microfluidos se pueden obtener de los autores, así como asesoramiento sobre cómo obtener una oblea respectiva. <ol><li> Una vez que se obtiene la oblea, cortar una pieza de Tough-Tag into tiras delgadas de aproximadamente 0,5 mm por 3 mm con un bisturí y colocar con cuidado sobre la oblea ligeramente en la parte superior de la estructura del canal entre los canales de entrada y la matriz de micropad (Figura 2A). Esto dará lugar a la formación de un gran canal adicional en cada chip, que no sólo se utiliza durante la carga de las células, pero también es importante para el funcionamiento estable del dispositivo de microfluidos. </li><li> Cubrir la placa de Petri de vidrio con una doble capa de papel de aluminio y poner la oblea en la placa de Petri. El papel de aluminio evitará que se ejecute en PDMS entre la oblea y la placa de Petri. Si PDMS hace colarse entre la oblea y la placa de Petri de vidrio, la oblea será fijado de forma permanente en la placa de Petri. A pesar de la oblea es aún utilizable, no será posible reemplazar la placa de Petri de vidrio en caso de rotura y el PDMS tendrá que ser cortada después. </li></ol> 2. La producción de chips de microfluidos <ol><li> Coloque un plástico vacíavaso en la balanza y tarar la balanza. Verter 40 g de PDMS de base en el vaso de plástico (para un cm de diámetro de cristal placa de Petri 12). Añadir agente de curado PDMS con una pipeta desechable en relación p / w de 1:10, es decir, alrededor de 4 ml. </li><li> Mezclar el PDMS y agente de curado a fondo durante varios minutos. Esto se puede hacer con la pipeta de plástico desechable que se utilizó para pipetear el agente de curado. Es importante que la mezcla se mezcla bien antes de verterla en la parte superior de la oblea. Pobre mezcla hará que parte del PDMS no polimeriza. </li><li> Verter el PDMS en la parte superior de la oblea en la placa de Petri de vidrio. </li><li> La mezcla de PDMS con el agente de curado dará lugar a la formación de burbujas en la mezcla de PDMS. Estas burbujas deben ser eliminados antes de que el PDMS se polimeriza. El PDMS puede ser desgasificado después de verter en la parte superior de la oblea mediante la colocación de la placa de Petri en un desecador conectado a una bomba de vacío. Con esta configuración, se tarda unos 30 minutos para eliminar todas las burbujas de la mezcla. </li><li> Polimerizar ªe PDMS mediante la colocación de la placa de Petri con la oblea en la parte superior de una placa caliente a 120 ° C durante 1 hora y luego a 65 ° C durante otra hora. </li><li> Retirar el papel de aluminio junto con la oblea y polimerizado PDMS de la placa de Petri de vidrio. Despegue el papel de aluminio y la capa residual fina de polimerizado de PDMS de la parte posterior de la oblea. La capa de PDMS en la parte superior de la oblea a continuación, se puede separar de la oblea levantándolo cuidadosamente. </li><li> Coloque la capa de PDMS al revés (con los canales hacia arriba) en el banco y cortar los diseños de chip único impreso en el PDMS cuidadosamente con un escalpelo. Trate de retener aproximadamente 3 mm de PDMS alrededor de los bordes de los canales para mejorar el agarre de la viruta para la cubierta de vidrio más adelante. </li><li> Haga agujeros en el PDMS en los extremos del canal de entrada, salida y lateral (Figura 2A) presionando un trozo Luer Calibre 20 todo el camino a través del PDMS en forma recta. </li></ol> Asegúrese de que el chip de PDMStodavía está acostado boca abajo en el banco mientras perforación de los agujeros. Esto evita PDMS se pegue a la parte interior del canal, lo que podría causar el bloqueo del canal. <ol start="9"><li> Después de perforar cada agujero, quite la columna de PDMS en el talón de Luer con pinzas antes de tirar la colilla de nuevo. La columna PDMS lo contrario podría quedarse atrás y bloquear el agujero sólo puñetazos. </li><li> Limpiar las superficies del chip de partículas de polvo residual y PDMS mediante la colocación de cinta adhesiva sobre el mismo y retirar inmediatamente la cinta de nuevo. Del mismo modo limpiar el vidrio de cubierta a la que se une el chip. </li><li> Coloque el chip limpiado y cubierta de vidrio debajo de la lámpara de UV de la sobremesa UV-ozono Cleaner. Los lados que necesitan ser unidas entre sí deben hacer frente a la lámpara. </li><li> Exponer el PDMS y cubierta de cristal de la luz UV de 6-8 min y directamente después poner el chip en la cubierta de vidrio mediante la colocación de las superficies expuestas en la parte superior de uno al otro. </li><li> Golpee suavemente alrededor de los lados del chippara promover la unión del PDMS a la cubierta de vidrio y para eliminar cualquier burbuja de aire. No toque en la parte superior de la estructura del canal, ya que podría provocar que los micropads quedar atado a la cubierta de vidrio también. </li><li> Coloque la configuración de microfluidos recién hecho en una placa caliente a 100 ° C durante 60 min. Prueba de la fuerza de la unión entre el vidrio de cubierta y el chip de PDMS tratando de levantar los bordes del chip PDMS ligeramente. Cuando el bloque PDMS no puede ser levantada de la superficie del vidrio, la unión es exitosa y el chip está listo para su uso. </li></ol> 3. Preparación de la viruta para la célula de carga El fallo de un dispositivo de microfluidos potencialmente puede causar una fuga de medio en el microscopio. Para evitar esto, es de asesoramiento para utilizar un soporte de metal y / o sellar los lados del chip donde el PDMS se encuentra con el vidrio con esmalte de uñas o pegamento epoxi. Esto evita la fuga de medio en el caso de que el chip de PDMS no está unido suficientemente bien como para la cubierta de vidrio. También la tuberíaconexiones pueden ser asegurados alrededor de los puntos de inserción en una manera similar para evitar la fuga de medio. Un sensor de agua de fabricación casera que se desconecta la bomba de jeringa en caso de fuga se puede utilizar como una medida de seguridad adicional. Dibujos del soporte de metal especialmente diseñado para el chip de microfluidos pueden obtenerse a partir de los autores. <ol><li> Coloque el chip de microfluidos en el soporte de metal, con gel de silicona entre el vidrio del chip y las partes metálicas de la titular para crear un sello impermeable. Atornille las tuercas con cuidado, para no romper el vidrio. </li><li> Conectar tubos delgados (5-15 cm de largo) a la canal lateral y el canal de salida del chip. El uso de pinzas hace que sea más fácil de insertar el tubo en los agujeros perforados. </li><li> Llenar una jeringa de 50 ml Luer-Lok con medio de cultivo, eliminar el aire de la jeringa y conectar secuencialmente a un filtro de jeringa, un talón de Luer 20 de manómetro, un tubo corto y grueso (ca. 2 cm de largo) y un tubo delgado. Asegúrese de que la tina finae es el tiempo suficiente para abarcar la distancia entre la bomba de jeringa y la platina del microscopio. </li><li> Coloque la jeringa en la bomba de jeringa, avance rápido de la bomba hasta que el tubo delgado está completamente lleno con el medio. </li><li> Empuje el tubo delgado conectado a la jeringa en el canal de entrada del chip y dejar que el flujo del medio a través del chip a 10 l / min (Figura 2B). Recoger el medio dejando el chip (por ejemplo, en una placa de Petri). El medio se ejecutará a cabo a través del canal lateral debido a la diferencia de resistencia entre la Tough-Tag hace grande canal lateral y el canal de salida. </li><li> Coloque el chip en la platina del microscopio y ajustar el enfoque del microscopio en las almohadillas. </li></ol> Se prefiere el uso de objetivos de inmersión en aceite sobre la de objetivos de inmersión en agua porque el aceite no se seque durante el tiempo-curso del experimento. Dependiendo del microscopio, podría haber problemas con la retención de fOCU en las primeras horas del experimento. Por lo tanto, es aconsejable dejar el chip durante una a dos horas en la platina del microscopio por lo que puede establecerse antes de cargar las células y de comenzar el experimento. 4. La carga de las células de levadura en el chip de microfluidos <ol><li> Conecte un ml jeringa con punta Luer 5 a un talón de Luer Calibre 20 y un tubo de espesor (alrededor de 3 cm). </li><li> Tomar una muestra del cultivo de células para ser cargado en el chip. </li></ol> El recuento de células preferida para la carga es entre 1-5 x 10 6 células por ml. Los cultivos con recuentos superiores deben diluirse antes de la carga. Cuando el cultivo de células en YPD, la eficiencia de carga de las células se pueden mejorar muchas veces si las células se lavan primero con y se resuspendieron en medio mínimo que contiene un porcentaje de glucosa similares antes de la carga. Durante el funcionamiento del chip, medio YPD nuevo puede ser utilizado con seguridad. <ol start="3"><li> Cargar aproximadamente 1 ml de la suspensión celular en the jeringa y eliminar todo el aire de la jeringa. </li><li> Disminución de la velocidad de flujo de la bomba de jeringa a 0,5 l / min. El flujo de baja y continua aplicada por la bomba de jeringa durante la carga (en el paso 4.5) empujará las células no unidas a cabo a través del canal lateral (Figura 2C). </li><li> Conectar la jeringa que contiene la suspensión de células en el tubo del canal de salida. Cargar las células presionando sobre el émbolo de la jeringa suavemente. Observar las células que entran y resolver bajo las micropads través del ocular oa través de la pantalla del ordenador. </li><li> Mantenga la presión sobre el émbolo hasta que suficientes células se asientan debajo de las almohadillas. La carga óptima es de 1-3 células por pad. Como las células se asientan por debajo de las almohadillas al azar, es bastante común que algunas pastillas no contienen células y otras almohadillas están completamente llenos de células. </li><li> Desconexión de la jeringa utilizada para la carga de las células y el tubo grueso conectado a la misma desde el tubo fino del canal de salida, lavar el lado channel durante un par de minutos a mayores velocidades de flujo (10 l / min) para eliminar las burbujas de aire y / o células que aún no ha salido el chip (Figura 2B). Si las células no se eliminan del canal lateral, que pueden comenzar a crecer en el canal lateral y interferir con el experimento más adelante. </li><li> Ponga el flujo de la bomba de jeringa de vuelta a 0,5 l / min y cerrar el canal lateral a la salida mediante la conexión a un tubo de espesor (alrededor de 5 cm de largo) que contiene un tapón de catéter en su extremo (Figura 2D). </li><li> Aumentar el flujo a una velocidad de flujo final de 1-5 l / min. Las velocidades de flujo pueden variar dependiendo del medio y la cepa de levadura. </li><li> Iniciar una película con la configuración de microscopio y cámara adecuados para el objetivo del experimento. Asegúrese de que la velocidad de la platina del microscopio se ajusta a una velocidad tan baja que el petróleo puede seguir. Para la determinación de replicativo, celdas de imagen cada 10 min. Para proteger las células de las cantidades de luz ultravioleta emitida por el halógenolámpara, que se utiliza durante la adquisición de DIC, es recomendable colocar un filtro UV adicional en la trayectoria de la luz. Cuando se utiliza la microscopía de fluorescencia, se prefiere a la imagen de las células con menos frecuencia (por ejemplo, cada 20 minutos) para evitar efectos fototóxicas. El experimento se completa cuando todas las células cargadas en el inicio del experimento están muertos, que en condiciones normales toma hasta 5 días. Se recomienda visitar periódicamente el enfoque de las imágenes durante el experimento y si es necesario ajustarlo. </li></ol>

<ol>
	<li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+yeast+to+discover+the+fountain+of+youth.">Using yeast to discover the fountain of youth.</a> Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).</li><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+of+individual+yeast+cells.">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li><li>Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+replicative+life+span+in+the+budding+yeast.">Measuring replicative life span in the budding yeast.</a> J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).</li><li>Lee, S. 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B., Gonnet, G., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+asymmetric+segregation+of+age+during+yeast+budding.">A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding.</a> Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).</li><li>Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+heterogeneity+in+populations+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).</li><li>Huh, W. 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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El método de microfluidos descrito aquí es una nueva herramienta importante en la investigación del envejecimiento, ya que permite la generación sencilla y automatizada de levadura replicación de datos de vida útil en combinación con imágenes continuas de alta resolución. Estos atributos son importantes mejoras con respecto a las posibilidades experimentales del método de disección clásica, sin embargo, hay algunas limitaciones del método que necesita ser tenido en cuenta. Tenga...

Ciernes levadura es un organismo modelo importante para la investigación del envejecimiento 1. Hasta recientemente, el estudio de envejecimiento replicativa en células de levadura era un proceso laborioso que requiere un método de disección, en la que cada brote fue retirado manualmente de la célula madre 2,3. Para solucionar este problema, hemos presentado recientemente una nueva configuración de microfluidos capaz de rastrear las células madre individuales a lo largo de toda su vida útil 4. En nuestro chip de microfluidos, células de levadura son atrapados bajo micropads suaves elastómero a base de (véase la Figura 1). Un flujo continuo de medio de lava células hijas recién formadas y proporciona a las células con nutrientes frescos. En un experimento, de hasta 50 células madre pueden ser controlados de forma totalmente automática durante toda su vida replicativa. Debido a las excelentes propiedades ópticas del chip de microfluidos, es posible controlar simultáneamente diferentes aspectos de la biología celular de la levadura (por ejemplo, </em&gt; por el uso de proteínas fluorescentes). En comparación con el método de disección clásica, la configuración de microfluidos proporciona ventajas sustanciales. Se asegura un entorno definido y constante durante todo el experimento de envejecimiento. No requiere de equipo especializado costoso y se puede ejecutar en cualquier microscopio equipado con enfoque automático y capacidades de lapso de tiempo, así como de control de temperatura para el cultivo celular. La producción y el funcionamiento de los chips de microfluidos se pueden aprender en unos pocos días. Además, las células se pueden cargar directamente de un cultivo en crecimiento exponencial, una ventaja sobre otro método de microfluidos recientemente publicado 5, que requiere la biotinilación de las células madre. Combinado con una alta resolución de imagen, el método aquí descrito se puede utilizar para medir los cambios graduales en la morfología celular, expresión de la proteína y la localización de levadura durante el envejecimiento en una forma sin precedentes. La capacidad paraseguimiento a largo plazo de las células individuales también ofrece posibilidades únicas para estudios del ciclo celular de levadura. un Este método ha sido optimizado recientemente para eliminar la biotinilación del protocolo 16, que se publicó mientras que este manuscrito estaba en revisión.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number </td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC Sylgard 184 elastomer </td>
 <td>Mavom bv </td>
 <td>1060040 </td>
 <td>This package contains PDMS base and PDMS curing agent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Petri dishes 120/20 mm </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-2850 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cover glasses 22x40 mm </td>
 <td>CBN Labsuppliers BV </td>
 <td>190002240 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tough-Tags </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>Z359106 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum foil </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic disposable cup </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Serological pipette 5 ml </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>612-1245 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scotch tape </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>819-1460 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Baysilone paste (GE Bayer silicones) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>85403-1EA </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06417-11 </td>
 <td>Referred to as thin tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06418-03 </td>
 <td>Referred to as thick tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>233-5334 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Luer-Lok syringes </td>
 <td>BD </td>
 <td>300137 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml syringes, Luer tip </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>613-1599 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tweezers </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>232-2132 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 Gauge Luer stubs </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>LS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe filters (pore size 0.20 &mu;m) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>16534K </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>SP20/12 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-0892 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td> EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benchtop UV-Ozone Cleaner </td>
 <td>NOVA Scan </td>
 <td>PSD-UVT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Harvard Pump 11 Elite </td>
 <td>Harvard Apparatus </td>
 <td>70-4505 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 silicon master mold (wafer) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Balance </td>
 <td>Sartorius corporation </td>
 <td>ED4202S </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vacuum pump </td>
 <td>KNF Neuberger </td>
 <td>N022 AN.18 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Desiccator </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>467-2115 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hot plate </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>460-3267 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>Eclipse Ti-E </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast

Se demuestra el uso de una configuración sencilla de microfluidos, en el que las células de levadura en ciernes individuales pueden ser rastreados a lo largo de toda su vida útil. El chip de microfluidos explota la diferencia de tamaño entre las células madre y su hija con una gran variedad de micropads. Tras la carga, las células se encuentran atrapados debajo de estas micropads, porque la distancia entre la micropad y cubierta de vidrio es similar al diámetro de una célula de levadura (3-4 micras). Después de que el procedimiento de carga, medio de cultivo se vacía continuamente a través del chip, que no sólo crea un ambiente constante y definida a lo largo de todo el experimento, pero también vaciados de las células hijas emergentes, que no sean retenidos debajo de las pastillas debido a su tamaño más pequeño. La configuración conserva las células madre manera tan eficiente que en un solo experimento de hasta 50 células individuales pueden ser controlados de una manera completamente automatizada durante 5 días o, si es necesario, ya. Además, las excelentes propiedades ópticas del chip permiten altoResolución de imagen de células durante todo el proceso de envejecimiento.

En este protocolo, las células se cargan en el chip de microfluidos directamente del cultivo exponencial media. Para determinar si la distribución de la edad de las células atrapadas en el chip de microfluidos es similar a la del cultivo antes de la carga, las células se tiñeron con aglutinina de trigo conjugada con FITC (WGA-FITC) para visualizar las cicatrices del brote. Como puede verse en la Figura 3, el atrapamiento de células bajo las micropads del chip de microfluidos no está sesgada a las...

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Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Se describe aquí la operación de un dispositivo de microfluidos que permite imágenes microscópicas continua y de alta resolución de las células de levadura en ciernes individuales durante su completa replicativa y / o cronológico vida útil.

Continua observación microscópica de alta resolución de replicativa envejecimiento en la levadura en ciernes

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

continuous-high-resolution-microscopic-observation-replicative-aging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.8K vistas.  University of Groningen. Se describe aquí la operación de un dispositivo de microfluidos que permite imágenes microscópicas continua y de alta resolución de las células de levadura en ciernes individuales durante su completa replicativa y / o cronológico vida útil.

Video: Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

De alta resolución de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imágenes

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Investigación

Bioingeniería

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

3D de alta resolución de imagen de Ex-Vivo Muestras Biológicas por Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparación de Mica Soportado bicapa lipídica de Alta Resolución Microscopía Óptica de Imagen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Nutriente Reglamento mediante la alimentación continua de expansión a gran escala de células de mamífero en esferoides

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Posicionamiento adecuado y la contención de una rata de extremidades para la proyección de imagen enfocada de alta resolución del hueso utilizando la microarquitectura In Vivo Micro-tomografía computada

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Proyección de imagen 3D de alta resolución de la red Neuro-insular del páncreas humano

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Patterning Using Two Modes of Electrohydrodynamic Jet: Drop on Demand and Near-field Electrospinning

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning tool. EHD printing uses a fluidic supplier to maintain the extruded meniscus by pushing the ink out of the nozzle tip. The electric field is then used to pull the meniscus down to the substrate to produce high-resolution patterns. Two modes of EHD printing have been used for fine patterning: continuous near-field electrospinning (NFES) and dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing. According to the printing modes, the requirements for the printing equipment and ink viscosity will differ. Even though two different modes can be implemented with a single EHD printer, the realization methods significantly differ in terms of ink, fluidic system, and driving voltage. Consequently, without a proper understanding of the jetting requirements and limitations, it is difficult to obtain the desired results. The purpose of this paper is to present a guideline so that inexperienced researchers can reduce the trial and error efforts to use the EHD jet for their specific research and development purposes. To demonstrate the fine-patterning implementation, we use Ag nanoparticle ink for the conductive patterning in the protocol. In addition, we also present the generalized printing guidelines that can be used for other types of ink for various fine-patterning applications.

Here, we present a protocol to produce high-resolution conductive patterns using electrohydrodynamic (EHD) jet printing. The protocol includes two modes of EHD jet printing: the continuous near-field electrospinning (NFES) and the dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing.

Alta resolución patrones usando dos modos de electrohidrodinámicos Jet: caída en la demanda y Electrospinning de campo cercano

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

Alta resolución con motivos Biofilm deposición utilizando pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

Imágenes de alta resolución de la dinámica nuclear en células vivas bajo tensión de tracción uniaxial

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...