אנו מודים בריאן ג&#39;קון וקלאודיה ב חנה לדיונים מועיל ותמיכה. פרויקט זה מומן על ידי סטארט כספים מח&#39;. של מדעי הביולוגיה, אוניברסיטת Purdue ר קלאודיו אגילר לבין האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן מוסדי מענק מחקר ר קלאודיו אגילר באמצעות מרכז Purdue סרטן.

א התרבות תאים אינדוקציה חלבון סעיף זה מתאר תרבית תאים התנאים, מחזור התא סנכרון עם Nocodazole, ואחריו אינדוקציה של ביטוי חלבון מן מקדם regulatable בתאי שמרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוג בר שמרים זן W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) הופך עם העתק גבוהה (2μ) DNA פלסמיד המכיל את הגן שלנו עניין (ENTH2) תחת שליטה האמרגן של מתיונין-repressible (MET25). 2mm מתיונין מספיקה כדי לדכא את פעילות הפרומוטר, בעוד התקשורת חסר מתיונין מאפשר ביטוי מקסימלי. לפיכך, בטווח של ריכוזי מתיונין ניתן להשתמש כדי להביע את החלבון ברמה הרצויה. 1 טרנספורמציה של DNA פלסמיד ב W303 התאים מתבצע בשיטת LiAc-TE על פי נהלים קבועים. 2 הערה: הניסוי צריך להתבצע על ידי גידול התאים לילה בנוכחות 2mm מתיונין כדי להבטיח ביטוי חלבון רק ברמות הרקע. למחרת בבוקר, ביטוי חלבון צריך להיגרם על ידי resuspending התאים בתקשורת חסר מתיונין מיד סנכרון הבאים לתא מחזור (4H כ). עם זאת, מצאנו כי ENTH2 תלוי פנוטיפ חלוקת התא מושרה רק לאחר ריכוז ניכר של ENTH2 בנתה בתאים (בדרך כלל אחרי 4-6 שעות של אינדוקציה חלבון 3), מה שהופך את מהלך הזמן לניתוח של כל גילויי את הפנוטיפ ארוך מאוד (לפחות 16h). מצאנו כי גידול התאים לילה בנוכחות 0.2mM מתיונין מדכא את הפנוטיפ מורפולוגיים אך מאפשר ריכוז חלבון subcritical כי ניתן להגדיל במהירות פנוטיפ וישכנע רמות כאשר הועברה המדיה חסר מתיונין. זה מאפשר ניתוח מפורט של ביטויים חמורים של הפגם חלוקת התא בתקופה יחסית קצרה של זמן. ולכן אנו ממליצים כי הניסוי לקבוע את ריכוז מתיונין זה משנה סף לזירוז הפנוטיפ על בסיס כל מקרה לגופו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק six מושבות מהצלחת המכיל תאים הפך לאחרונה לחסן ב 50 מ&quot;ל של התקשורת סלקטיבית עם 0.2mM מתיונין בבקבוק חרוטי עיקור באמצעות טכניקות סטנדרטיות סטרילי. דגירה לילה בשעה 30 ° C עם רועד ב 200 סל&quot;ד. (למידע נוסף על התנאים תרבות תקן שמרים, ראה השופט. 4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, תא להעריך צפיפות על ידי מדידת צפיפות אופטית של התרבות ב 600nm. מעבירים את שווה ערך ל 20 OD 600nm של תאים לתוך צינור צנטריפוגות הקציר סטרילית ידי מסתובב בסל&quot;ד 2200 עבור 5min בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב YPD בריכוז של 0.4 OD 600nm / ml ולהוסיף Nocodazole לריכוז סופי של 15μg/ml של ממלאי של 1mg/ml ב DMSO. דגירה של 4H על 30 מעלות צלזיוס עם רעד בכל 200rpm. הערה: מעצר אלטרנטיבית בשיטות כולל מעצר בשלב G0 באמצעות אלפא גורם או בשלב G1-S באמצעות hydroxyurea ניתן להשתמש. מצאנו כי מעצר בבית מיטוזה באמצעות Nocodazole הוא פשוט ויעיל מספיק לצרכים שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4H, לבדוק את אחוז התאים נעצר מיטוזה על ידי ספירת מספר התאים עם בלוטות בגודל שווה ידי צפייה במיקרוסקופ. אם המעצר עולה על 90%, המשך לשלב הבא. אחרת, לשמור על התאים Nocodazole עד האחוז הרצוי המעצר mitotic מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי צנטריפוגה בסל&quot;ד 2200 עבור 5min ולשטוף עם מים קרים כקרח שלוש פעמים. לאחר לשטוף הסופי, resuspend גלולה בתקשורת סלקטיבית חסר מתיונין בצפיפות תא של ~ 0.5 OD 600nm / ml. העברת חצי נפח התאים צינור סטרילי חדשה ולהוסיף מתיונין לריכוז 0.2mM הסופי. זה ישמש לשלוט על ההשפעות בשל רמות הבסיס של ביטוי חלבון. זה מסמן את הפעם הראשונה לנקודה של הניסוי (זמן = 0h). ניתוח תאים כל שעה למשך 6 שעות. </li></ol> ב ניתוח ופיתוח הפנוטיפ הערה: כל השיטות המתוארות להלן ניתוח לא צריכים להתבצע בעת ובעונה אחת. קביעת רמות ביטוי חלבון ע&quot;י המערבי סופג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב מסוים, בכל פעם, למדוד את OD 600nm של התרבות וקציר 2 OD 600nm ושווי של תאים על ידי צנטריפוגה ב 2200 סל&quot;ד במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה במים 1ml סטרילי ולהעביר את ההשעיה לצינור Eppendorf 1.5ml. חזור על צנטריפוגה להשיג גלולה. לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה במאגר 50μl laemmli SDS-PAGE מדגם (50mm טריס pH 6.8, 2% SDS, גליצרול 10%, 2% ו - β-mercaptoethanol 0.006% bromophenol כחול). הוסף 50μl של חומצה שטף חרוזי זכוכית (קוטר 0.2-0.4 מיקרון) ו מערבולת דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים צינורות על 95 מעלות חום block במשך 2 דקות, מערבולת שוב למשך 30 שניות ולהמשיך רותחים במשך 5 דקות. להקפיא את דגימת החלבון ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל דגימות חלבון על ג&#39;ל SDS-PAGE 12%, להעביר על קרום nitrocellulose ולבצע המערבי סופג עם נוגדנים המתאימים כדי לזהות את החלבון של עניין. בדוגמה זו, אנו לחקור את נוכחותו של haemagglutinin (HA) מתויג תחומים ENTH ידי דוגרים עם נוגדן אנטי HA העכבר (Covance, Princeton, NJ) בדילול 1:2000 ב-Tween שיכור סחוט (1XPBS, 5% שומן לא יבש החלב , 0.1% Tween). HRP tagged אנטי עכבר עז נוגדנים משני (פירס) בשעה דילול של 1:2500, גם שיכור סחוט-Tween, מותר לקשור את הנוגדן הראשוני על הממברנה עבור 1h בטמפרטורת החדר. Supersignal תשתית מערב פיקו Chemiluminescent משמש כדי לזהות HRP מתויג נוגדן אנטי העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת ביטוי החלבון על ידי רמות צפיפות. </li></ol> סעיף זה מתאר שתי שיטות פיתוח פנוטיפ מעקב כפונקציה של ריכוז החלבון גוברת. השיטה הראשונה היא התא האוכלוסייה המבוססת, בעוד מחקרים השניה ברמה של תא בודד. כימות פנוטיפ חלוקת התא ומוות התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודה זו בזמן, העברת ההשעיה תא 1ml לצינור Eppendorf סטרילי תוך שימוש בטכניקות סטריליות ותאי הקציר על ידי צנטריפוגה ב 2200 סל&quot;ד במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 70μl התקשורת, ואחריו 30μl מתילן כחול מלאי של 1mg/ml במים סטריליים. מתילן כחול הוא צבע כחול חיוני זה הופך להיות חסר צבע בסביבה צמצום של cytosol ולכן התאים המתים יכולים להיות מזוהים על ידי הצבע הכחול שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה ~ 6μl של השעיה זו בשקופית זכוכית נקי במקום coverslip על הירידה. לחצו על coverslip בעדינות כדי ליצור שכבה דקה ואחידה של תאים בין ממשקים זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את coverslip לתוך 9 הרביעים ולקחת 3 תמונות לכל רביע, כמצוין באיור. 2. מספר תאים / שדה צריך להיות יותר מ 30 תאים כדי לאפשר כימות מדויק. כל coverslip ניתן הדמיה במשך כ 15 דקות לפני בועות אוויר הנזק הכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים מראה את הפנוטיפ תחת מחקר. חלוקת התא פגם המושרה על overexpression ENTH2 מוביל מוות של תאים, ולכן, אנחנו גם לספור את מספר התאים המתים זוהו על ידי הצבע הכחול שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב אחוזי התאים פנוטיפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את הנתונים כפי שמוצג באיור. 3. </li></ol> ויזואליזציה של פגמים ספציפיים הפנוטיפ באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי Cell-חלוקת תאים פגומים, כפי שניתן לראות על overexpression ENTH2, מאופיינים לעיתים קרובות על ידי תא הקיר פגמים septin mislocalization3 (דמיינו כמו GFP-Fusion חלבונים). דופן התא של שמרים ניצני יכול בקלות להיות דמיינו ידי מכתים עם Calcofluor לבן (CfW) אשר נקשר באופן בלתי הפיך עד כיטין בקירות תא שמרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותה נקודה בכל פעם, 1ml aliquot תרבות צינור Eppendorf סטרילית תאים הקציר על ידי צנטריפוגה ב 2200 סל&quot;ד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 100μl של פתרון CfW 1mg/ml במים דגירה סטרילי במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף 3 פעמים עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 100μl 1X PBS ותמונה תחת מיקרוסקופ באמצעות אופטיקה UV (תא הקיר) ואת FITC המסנן (GFP-septin) בהגדלה 100x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת אחוז התאים עם הפגם תא קיר mislocalization septin על ידי השלבים הבאים 4-6 בסעיף B.2.1 </li></ol> ב .3. קביעת התפתחות פנוטיפ ברמת תא בודד: זמן לשגות מיקרוסקופיה וידאו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה שקופיות זכוכית עם דיכאון קעורה עם אלכוהול 70% ולאפשר לאוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים 0.06g agarose בתקשורת סלקטיבית 5 מ&quot;ל חסר מתיונין בתוך שפופרת זכוכית סטרילית במיקרוגל עד agarose נמס לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות 200μl פיפטה של ​​agarose המכיל התקשורת הדיכאון שקופיות להפוך עוד שקופיות זכוכית נקי על זה, כדי לוודא ששום בועות אוויר לכודים מתחתיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הג&#39;ל מחזקת, להעביר את השקף על גבי חלק מן השקופית דיכאון, לשמור על פני השטח שלהן במקביל בכל עת. זה מבטיח את פני השטח של המיטה agarose הוא מיושר עם פני השטח של השקופית דיכאון. נקו את האזור סביב המיטה שקופיות agarose עם רקמה עדינה. השקופית עכשיו הוא מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו זמן = 4 שעות, 1ml העברת תאים מתרבות לצינור Eppendorf הקציר סטרילית על ידי צנטריפוגה ב 2200 סל&quot;ד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: מומלץ מאוחר יותר זמן נקודה להיבחר כדי להבטיח רמות גבוהות של ביטוי חלבון, כך התפתחות פנוטיפ מובטחת. ניסויי פיילוט נדרשים determinדואר פעמים אינדוקציה על בסיס כל מקרה לגופו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התאים supernatant ו resuspend ב 100μl התקשורת סלקטיבית טרי חסר מתיונין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל וזלין את הקצוות של coverslip. אז במקום ירידה של השעיה תא במרכז המיטה agarose ולהפיץ באופן אחיד על ידי לחיצה בעדינות coverslip עליהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הקצוות של coverslip עם וזלין ולתקן את מעמדה על ידי רירית קצוות עם לק. המתן עד מייבש לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את השקף על הבמה סוער של מיקרוסקופ ולבחור השדה המכיל לא יותר מ 10 תאים מרווחים כראוי. כאשר התאים מתחלקים, השדה יקבל צפוף לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונה של שדה כל 5 דקות ~ 5 שעות. התקדמות הפנוטיפ ניתן ללמוד על ידי הרכבת את התמונות לסרט באמצעות ImageJ תוכנה ( <a name="cite">Rasband, היה, ImageJ, ארה&quot;ב National Institutes of Health, Bethesda, מרילנד, ארה&quot;ב, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 -2005</a> ) </li></ol> הערה: אנו משתמשים במיקרוסקופ Zeiss 200 מיליון Axiovert, מונוכרום Zeiss AxioCam MRM מצלמה דיגיטלית ו Carl Zeiss רכישת AxioVision תמונת התוכנה (גירסה 4.4) עבור הדמיה תא חי. בקרת טמפרטורת הגוף מושגת על ידי הצבת שקופיות על הבמה מחוממת שמרו על 30 מעלות צלזיוס על ידי המכשיר Tempcontrol 37 Pecon. על מנת להימנע מחדש התאמת להתמקד שוב ושוב, נוח בתוכנה רכישת התמונה באופן אוטומטי לרכוש כמה Z-מחסנית תמונות בנקודת זמן כל לבחור את התמונה הטובה ביותר עם ​​דגש מאוחר יותר, כאשר הרכבת את הסרט. כמה תוכנות רכישת תמונה יש אפשרות פוקוס אוטומטי עבור ניסויים כמובן זמן. זה נוח להשתמש באפשרות זו כאשר זמין. Wild שמרים תאים סוג לגדול הטובה ביותר ב 30 מעלות צלזיוס ומכאן בקרת טמפרטורה היא קריטית. על מנת להבטיח מספיק חום, כדאי לספק מקור חום חיצוני בנוסף לבמה מחומם. לדוגמה, אנו עוזבים את אור לבן המשודר של המיקרוסקופ במשך כל תקופת הדמיה. זה גם קריטי כדי למנוע בועות אוויר בעת הכנת את המיטה agarose כריך בתא. אוויר לכוד בתוך בועות מתרחב כאשר מחומם לאורך זמן נוטים לדחוף את התאים מן השדה להיות הדמיה. חשוב גם להבטיח כי עמדות תאים בודדים בתוך השדה לא משתנים במידה ניכרת על משך תהליך הדמיה, במיוחד בתקופת מחדש התמקדות ניסיונות. ייצוב תמונה plugins זמינים עבור ImageJ לתקן משמרות קטן בעמדה תא אחרי הסרט כבר נאספו. ( <a href="http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html">http://www.cs.cmu.edu/ ~ kangli / קוד / Image_Stabilizer.html</a> ).

<ol>
	<li>R&#246;nicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).</li><li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway.">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).</li><li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , 3-21 (1991).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר כיצד לפקח על התפתחות פנוטיפ מורפולוגיים (תא שמרים מסוגלים לעבור חלוקת התא הנכון) על overexpression חלבון. כאשר עושים את זה הליך חשוב לזכור לקצור תאים שמרים ידי pelleting במהירות צנטריפוגה מומלץ מהירויות גבוהות עלולה לגרום נזק לתאים תוצאות מעורפלות. מתילן כחול Ca...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Nocodazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>M1404</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene Blue 1% (w/v)</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW6276-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcofluor White</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>F3543</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petroleum Jelly</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW3339-2</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of the development of a morphological phenotype as a function of protein concentration in budding yeast

המחיקה ין overexpression חלבון שיטות משותף ללימוד פונקציות של חלבונים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח התפתחות פנוטיפ כפונקציה של ריכוז החלבון על האוכלוסייה תא בודד רמות<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. אמנם זה פרוטוקול מבוסס על overexpression של חלבון, זה יכול בקלות להיות מותאמים עבור פנוטיפים מורפולוגיים תלויים דיכוי של ביטוי חלבון. המעבדה שלנו הוא מעוניין ללמוד את המאפיינים של איתות epsin מתאם endocytic חלבון. כדי לשם כך השתמשנו בגישה שלילית הדומיננטי בה אנו ביטוי יתר של שימור<u&gt; E</u&gt; Psin<u&gt; N</u&gt; -<u&gt; T</u&gt; Erminal<u&gt; H</u&gt; Omology (ENTH) תחום על מנת להפריע את הפונקציות של אנדוגני epsin-2 (או Ent2 YLR206W). הבחנו כי overexpression של תחום ENTH של Ent2 (ENTH2) בתאים סוג בר הוביל פגם כי חלוקת התא תלויה mislocalization של משפחה של חלבונים הפיגומים, septins.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast at JoVE.com

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

המחיקה ין overexpression חלבון שיטות משותף ללימוד פונקציות של חלבונים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח התפתחות פנוטיפ כפונקציה של ריכוז החלבון על האוכלוסייה תא בודד רמות<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;.

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

analysis-development-morphological-phenotype-as-function-protein

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Views.  Purdue University. המחיקה ין overexpression חלבון שיטות משותף ללימוד פונקציות של חלבונים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח התפתחות פנוטיפ כפונקציה של ריכוז החלבון על האוכלוסייה תא בודד רמות Saccharomyces cerevisiae.

Video: Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

השימוש Rotorod כשיטה לניתוח איכותי של הליכה עכברוש

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

מדידת תוחלת החיים בשמרים replicative הנצה

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

חשיבותה של ריכוז חלבון נכון עבור קינטיקס וקביעת זיקה בניתוח מבנה פונקציה

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של Sumoylation וUbiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור Ndc10 וNdc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...