אנו מודים בריאן ג&#39;קון וקלאודיה ב חנה לדיונים מועיל ותמיכה. פרויקט זה מומן על ידי סטארט כספים מח&#39;. של מדעי הביולוגיה, אוניברסיטת Purdue ר קלאודיו אגילר לבין האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן מוסדי מענק מחקר ר קלאודיו אגילר באמצעות מרכז Purdue סרטן.

א התרבות תאים אינדוקציה חלבון סעיף זה מתאר תרבית תאים התנאים, מחזור התא סנכרון עם Nocodazole, ואחריו אינדוקציה של ביטוי חלבון מן מקדם regulatable בתאי שמרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוג בר שמרים זן W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) הופך עם העתק גבוהה (2μ) DNA פלסמיד המכיל את הגן שלנו עניין (ENTH2) תחת שליטה האמרגן של מתיונין-repressible (MET25). 2mm מתיונין מספיקה כדי לדכא את פעילות הפרומוטר, בעוד התקשורת חסר מתיונין מאפשר ביטוי מקסימלי. לפיכך, בטווח של ריכוזי מתיונין ניתן להשתמש כדי להביע את החלבון ברמה הרצויה. 1 טרנספורמציה של DNA פלסמיד ב W303 התאים מתבצע בשיטת LiAc-TE על פי נהלים קבועים. 2 הערה: הניסוי צריך להתבצע על ידי גידול התאים לילה בנוכחות 2mm מתיונין כדי להבטיח ביטוי חלבון רק ברמות הרקע. למחרת בבוקר, ביטוי חלבון צריך להיגרם על ידי resuspending התאים בתקשורת חסר מתיונין מיד סנכרון הבאים לתא מחזור (4H כ). עם זאת, מצאנו כי ENTH2 תלוי פנוטיפ חלוקת התא מושרה רק לאחר ריכוז ניכר של ENTH2 בנתה בתאים (בדרך כלל אחרי 4-6 שעות של אינדוקציה חלבון 3), מה שהופך את מהלך הזמן לניתוח של כל גילויי את הפנוטיפ ארוך מאוד (לפחות 16h). מצאנו כי גידול התאים לילה בנוכחות 0.2mM מתיונין מדכא את הפנוטיפ מורפולוגיים אך מאפשר ריכוז חלבון subcritical כי ניתן להגדיל במהירות פנוטיפ וישכנע רמות כאשר הועברה המדיה חסר מתיונין. זה מאפשר ניתוח מפורט של ביטויים חמורים של הפגם חלוקת התא בתקופה יחסית קצרה של זמן. ולכן אנו ממליצים כי הניסוי לקבוע את ריכוז מתיונין זה משנה סף לזירוז הפנוטיפ על בסיס כל מקרה לגופו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק six מושבות מהצלחת המכיל תאים הפך לאחרונה לחסן ב 50 מ&quot;ל של התקשורת סלקטיבית עם 0.2mM מתיונין בבקבוק חרוטי עיקור באמצעות טכניקות סטנדרטיות סטרילי. דגירה לילה בשעה 30 ° C עם רועד ב 200 סל&quot;ד. (למידע נוסף על התנאים תרבות תקן שמרים, ראה השופט. 4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, תא להעריך צפיפות על ידי מדידת צפיפות אופטית של התרבות ב 600nm. מעבירים את שווה ערך ל 20 OD 600nm של תאים לתוך צינור צנטריפוגות הקציר סטרילית ידי מסתובב בסל&quot;ד 2200 עבור 5min בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב YPD בריכוז של 0.4 OD 600nm / ml ולהוסיף Nocodazole לריכוז סופי של 15μg/ml של ממלאי של 1mg/ml ב DMSO. דגירה של 4H על 30 מעלות צלזיוס עם רעד בכל 200rpm. הערה: מעצר אלטרנטיבית בשיטות כולל מעצר בשלב G0 באמצעות אלפא גורם או בשלב G1-S באמצעות hydroxyurea ניתן להשתמש. מצאנו כי מעצר בבית מיטוזה באמצעות Nocodazole הוא פשוט ויעיל מספיק לצרכים שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4H, לבדוק את אחוז התאים נעצר מיטוזה על ידי ספירת מספר התאים עם בלוטות בגודל שווה ידי צפייה במיקרוסקופ. אם המעצר עולה על 90%, המשך לשלב הבא. אחרת, לשמור על התאים Nocodazole עד האחוז הרצוי המעצר mitotic מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי צנטריפוגה בסל&quot;ד 2200 עבור 5min ולשטוף עם מים קרים כקרח שלוש פעמים. לאחר לשטוף הסופי, resuspend גלולה בתקשורת סלקטיבית חסר מתיונין בצפיפות תא של ~ 0.5 OD 600nm / ml. העברת חצי נפח התאים צינור סטרילי חדשה ולהוסיף מתיונין לריכוז 0.2mM הסופי. זה ישמש לשלוט על ההשפעות בשל רמות הבסיס של ביטוי חלבון. זה מסמן את הפעם הראשונה לנקודה של הניסוי (זמן = 0h). ניתוח תאים כל שעה למשך 6 שעות. </li></ol> ב ניתוח ופיתוח הפנוטיפ הערה: כל השיטות המתוארות להלן ניתוח לא צריכים להתבצע בעת ובעונה אחת. קביעת רמות ביטוי חלבון ע&quot;י המערבי סופג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב מסוים, בכל פעם, למדוד את OD 600nm של התרבות וקציר 2 OD 600nm ושווי של תאים על ידי צנטריפוגה ב 2200 סל&quot;ד במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה במים 1ml סטרילי ולהעביר את ההשעיה לצינור Eppendorf 1.5ml. חזור על צנטריפוגה להשיג גלולה. לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה במאגר 50μl laemmli SDS-PAGE מדגם (50mm טריס pH 6.8, 2% SDS, גליצרול 10%, 2% ו - β-mercaptoethanol 0.006% bromophenol כחול). הוסף 50μl של חומצה שטף חרוזי זכוכית (קוטר 0.2-0.4 מיקרון) ו מערבולת דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים צינורות על 95 מעלות חום block במשך 2 דקות, מערבולת שוב למשך 30 שניות ולהמשיך רותחים במשך 5 דקות. להקפיא את דגימת החלבון ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל דגימות חלבון על ג&#39;ל SDS-PAGE 12%, להעביר על קרום nitrocellulose ולבצע המערבי סופג עם נוגדנים המתאימים כדי לזהות את החלבון של עניין. בדוגמה זו, אנו לחקור את נוכחותו של haemagglutinin (HA) מתויג תחומים ENTH ידי דוגרים עם נוגדן אנטי HA העכבר (Covance, Princeton, NJ) בדילול 1:2000 ב-Tween שיכור סחוט (1XPBS, 5% שומן לא יבש החלב , 0.1% Tween). HRP tagged אנטי עכבר עז נוגדנים משני (פירס) בשעה דילול של 1:2500, גם שיכור סחוט-Tween, מותר לקשור את הנוגדן הראשוני על הממברנה עבור 1h בטמפרטורת החדר. Supersignal תשתית מערב פיקו Chemiluminescent משמש כדי לזהות HRP מתויג נוגדן אנטי העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת ביטוי החלבון על ידי רמות צפיפות. </li></ol> סעיף זה מתאר שתי שיטות פיתוח פנוטיפ מעקב כפונקציה של ריכוז החלבון גוברת. השיטה הראשונה היא התא האוכלוסייה המבוססת, בעוד מחקרים השניה ברמה של תא בודד. כימות פנוטיפ חלוקת התא ומוות התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודה זו בזמן, העברת ההשעיה תא 1ml לצינור Eppendorf סטרילי תוך שימוש בטכניקות סטריליות ותאי הקציר על ידי צנטריפוגה ב 2200 סל&quot;ד במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 70μl התקשורת, ואחריו 30μl מתילן כחול מלאי של 1mg/ml במים סטריליים. מתילן כחול הוא צבע כחול חיוני זה הופך להיות חסר צבע בסביבה צמצום של cytosol ולכן התאים המתים יכולים להיות מזוהים על ידי הצבע הכחול שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה ~ 6μl של השעיה זו בשקופית זכוכית נקי במקום coverslip על הירידה. לחצו על coverslip בעדינות כדי ליצור שכבה דקה ואחידה של תאים בין ממשקים זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את coverslip לתוך 9 הרביעים ולקחת 3 תמונות לכל רביע, כמצוין באיור. 2. מספר תאים / שדה צריך להיות יותר מ 30 תאים כדי לאפשר כימות מדויק. כל coverslip ניתן הדמיה במשך כ 15 דקות לפני בועות אוויר הנזק הכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים מראה את הפנוטיפ תחת מחקר. חלוקת התא פגם המושרה על overexpression ENTH2 מוביל מוות של תאים, ולכן, אנחנו גם לספור את מספר התאים המתים זוהו על ידי הצבע הכחול שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב אחוזי התאים פנוטיפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את הנתונים כפי שמוצג באיור. 3. </li></ol> ויזואליזציה של פגמים ספציפיים הפנוטיפ באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי Cell-חלוקת תאים פגומים, כפי שניתן לראות על overexpression ENTH2, מאופיינים לעיתים קרובות על ידי תא הקיר פגמים septin mislocalization3 (דמיינו כמו GFP-Fusion חלבונים). דופן התא של שמרים ניצני יכול בקלות להיות דמיינו ידי מכתים עם Calcofluor לבן (CfW) אשר נקשר באופן בלתי הפיך עד כיטין בקירות תא שמרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותה נקודה בכל פעם, 1ml aliquot תרבות צינור Eppendorf סטרילית תאים הקציר על ידי צנטריפוגה ב 2200 סל&quot;ד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 100μl של פתרון CfW 1mg/ml במים דגירה סטרילי במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף 3 פעמים עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 100μl 1X PBS ותמונה תחת מיקרוסקופ באמצעות אופטיקה UV (תא הקיר) ואת FITC המסנן (GFP-septin) בהגדלה 100x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת אחוז התאים עם הפגם תא קיר mislocalization septin על ידי השלבים הבאים 4-6 בסעיף B.2.1 </li></ol> ב .3. קביעת התפתחות פנוטיפ ברמת תא בודד: זמן לשגות מיקרוסקופיה וידאו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה שקופיות זכוכית עם דיכאון קעורה עם אלכוהול 70% ולאפשר לאוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים 0.06g agarose בתקשורת סלקטיבית 5 מ&quot;ל חסר מתיונין בתוך שפופרת זכוכית סטרילית במיקרוגל עד agarose נמס לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות 200μl פיפטה של ​​agarose המכיל התקשורת הדיכאון שקופיות להפוך עוד שקופיות זכוכית נקי על זה, כדי לוודא ששום בועות אוויר לכודים מתחתיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הג&#39;ל מחזקת, להעביר את השקף על גבי חלק מן השקופית דיכאון, לשמור על פני השטח שלהן במקביל בכל עת. זה מבטיח את פני השטח של המיטה agarose הוא מיושר עם פני השטח של השקופית דיכאון. נקו את האזור סביב המיטה שקופיות agarose עם רקמה עדינה. השקופית עכשיו הוא מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו זמן = 4 שעות, 1ml העברת תאים מתרבות לצינור Eppendorf הקציר סטרילית על ידי צנטריפוגה ב 2200 סל&quot;ד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: מומלץ מאוחר יותר זמן נקודה להיבחר כדי להבטיח רמות גבוהות של ביטוי חלבון, כך התפתחות פנוטיפ מובטחת. ניסויי פיילוט נדרשים determinדואר פעמים אינדוקציה על בסיס כל מקרה לגופו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התאים supernatant ו resuspend ב 100μl התקשורת סלקטיבית טרי חסר מתיונין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל וזלין את הקצוות של coverslip. אז במקום ירידה של השעיה תא במרכז המיטה agarose ולהפיץ באופן אחיד על ידי לחיצה בעדינות coverslip עליהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הקצוות של coverslip עם וזלין ולתקן את מעמדה על ידי רירית קצוות עם לק. המתן עד מייבש לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את השקף על הבמה סוער של מיקרוסקופ ולבחור השדה המכיל לא יותר מ 10 תאים מרווחים כראוי. כאשר התאים מתחלקים, השדה יקבל צפוף לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונה של שדה כל 5 דקות ~ 5 שעות. התקדמות הפנוטיפ ניתן ללמוד על ידי הרכבת את התמונות לסרט באמצעות ImageJ תוכנה ( <a name="cite">Rasband, היה, ImageJ, ארה&quot;ב National Institutes of Health, Bethesda, מרילנד, ארה&quot;ב, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 -2005</a> ) </li></ol> הערה: אנו משתמשים במיקרוסקופ Zeiss 200 מיליון Axiovert, מונוכרום Zeiss AxioCam MRM מצלמה דיגיטלית ו Carl Zeiss רכישת AxioVision תמונת התוכנה (גירסה 4.4) עבור הדמיה תא חי. בקרת טמפרטורת הגוף מושגת על ידי הצבת שקופיות על הבמה מחוממת שמרו על 30 מעלות צלזיוס על ידי המכשיר Tempcontrol 37 Pecon. על מנת להימנע מחדש התאמת להתמקד שוב ושוב, נוח בתוכנה רכישת התמונה באופן אוטומטי לרכוש כמה Z-מחסנית תמונות בנקודת זמן כל לבחור את התמונה הטובה ביותר עם ​​דגש מאוחר יותר, כאשר הרכבת את הסרט. כמה תוכנות רכישת תמונה יש אפשרות פוקוס אוטומטי עבור ניסויים כמובן זמן. זה נוח להשתמש באפשרות זו כאשר זמין. Wild שמרים תאים סוג לגדול הטובה ביותר ב 30 מעלות צלזיוס ומכאן בקרת טמפרטורה היא קריטית. על מנת להבטיח מספיק חום, כדאי לספק מקור חום חיצוני בנוסף לבמה מחומם. לדוגמה, אנו עוזבים את אור לבן המשודר של המיקרוסקופ במשך כל תקופת הדמיה. זה גם קריטי כדי למנוע בועות אוויר בעת הכנת את המיטה agarose כריך בתא. אוויר לכוד בתוך בועות מתרחב כאשר מחומם לאורך זמן נוטים לדחוף את התאים מן השדה להיות הדמיה. חשוב גם להבטיח כי עמדות תאים בודדים בתוך השדה לא משתנים במידה ניכרת על משך תהליך הדמיה, במיוחד בתקופת מחדש התמקדות ניסיונות. ייצוב תמונה plugins זמינים עבור ImageJ לתקן משמרות קטן בעמדה תא אחרי הסרט כבר נאספו. ( <a href="http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html">http://www.cs.cmu.edu/ ~ kangli / קוד / Image_Stabilizer.html</a> ).

<ol>
	<li>R&#246;nicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).</li><li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway.">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).</li><li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , 3-21 (1991).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר כיצד לפקח על התפתחות פנוטיפ מורפולוגיים (תא שמרים מסוגלים לעבור חלוקת התא הנכון) על overexpression חלבון. כאשר עושים את זה הליך חשוב לזכור לקצור תאים שמרים ידי pelleting במהירות צנטריפוגה מומלץ מהירויות גבוהות עלולה לגרום נזק לתאים תוצאות מעורפלות. מתילן כחול Ca...

<table><tbody><tr><td>Nocodazole</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue 1% (w/v)</td><td>Reagent</td><td>VWR international</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor White</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3543</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum Jelly</td><td>Reagent</td><td>VWR international</td><td>VW3339-2</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of the development of a morphological phenotype as a function of protein concentration in budding yeast

המחיקה ין overexpression חלבון שיטות משותף ללימוד פונקציות של חלבונים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח התפתחות פנוטיפ כפונקציה של ריכוז החלבון על האוכלוסייה תא בודד רמות<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. אמנם זה פרוטוקול מבוסס על overexpression של חלבון, זה יכול בקלות להיות מותאמים עבור פנוטיפים מורפולוגיים תלויים דיכוי של ביטוי חלבון. המעבדה שלנו הוא מעוניין ללמוד את המאפיינים של איתות epsin מתאם endocytic חלבון. כדי לשם כך השתמשנו בגישה שלילית הדומיננטי בה אנו ביטוי יתר של שימור<u&gt; E</u&gt; Psin<u&gt; N</u&gt; -<u&gt; T</u&gt; Erminal<u&gt; H</u&gt; Omology (ENTH) תחום על מנת להפריע את הפונקציות של אנדוגני epsin-2 (או Ent2 YLR206W). הבחנו כי overexpression של תחום ENTH של Ent2 (ENTH2) בתאים סוג בר הוביל פגם כי חלוקת התא תלויה mislocalization של משפחה של חלבונים הפיגומים, septins.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast at JoVE.com

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

המחיקה ין overexpression חלבון שיטות משותף ללימוד פונקציות של חלבונים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח התפתחות פנוטיפ כפונקציה של ריכוז החלבון על האוכלוסייה תא בודד רמות<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;.

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

analysis-development-morphological-phenotype-as-function-protein

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Views.  Purdue University. המחיקה ין overexpression חלבון שיטות משותף ללימוד פונקציות של חלבונים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח התפתחות פנוטיפ כפונקציה של ריכוז החלבון על האוכלוסייה תא בודד רמות Saccharomyces cerevisiae.

Video: Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

תצפית מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה מתמשכת של replicative הזדקנות בשמרי הנצה

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Bioengineering

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Biochemistry

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

במושבה שמרים והטבעה שיטה

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are used as models in lipid metabolic research or for industrial lipid production. Lipid droplets are highly dynamic storage bodies and their cellular content represents a convenient readout of the lipid metabolic state. Fluorescence microscopy is a method of choice for quantitative analysis of cellular lipid droplets, as it relies on widely available equipment and allows analysis of individual lipid droplets. Furthermore, microscopic image analysis can be automated, greatly increasing overall analysis throughput. Here, we describe an experimental and analytical workflow for automated detection and quantitative description of individual lipid droplets in three different model yeast species: the fission yeasts Schizosaccharomyces pombe and Schizosaccharomyces japonicus, and the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Lipid droplets are visualized with BODIPY 493/503, and cell-impermeable fluorescent dextran is added to the culture media to help identify cell boundaries. Cells are subjected to 3D epifluorescence microscopy in green and blue channels and the resulting z-stack images are processed automatically by a MATLAB pipeline. The procedure outputs rich quantitative data on cellular lipid droplet content and individual lipid droplet characteristics in a tabular format suitable for downstream analyses in major spreadsheet or statistical packages. We provide example analyses of lipid droplet content under various conditions that affect cellular lipid metabolism.

Here, we present a MATLAB implementation of automated detection and quantitative description of lipid droplets in fluorescence microscopy images of fission and budding yeast cells.

ניתוח של השומנים שומנים תוכן ביקוע והנצה ליעדים באמצעות עיבוד תמונה אוטומטית

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Immunology and Infection

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic changes are regulated by a complex signaling network controlled in response to environmental stimuli. These regulatory components have been highly studied, but almost all studies use a variety of in vitro stimuli to trigger filamentation. To determine how morphogenesis is regulated during the pathogenesis process, we developed an in vivo microscopy system to obtain high spatial resolution images of organisms undergoing hyphal formation within the mammalian host. The protocol presented here describes the use of this system to screen small collections of C. albicans mutant strains, allowing us to identify key regulators of morphogenesis as it occurs at the site of infection. Representative results are presented, demonstrating that some regulators of morphogenesis, such as the transcriptional regulator Efg1, have consistent phenotypes in vitro and in vivo, whereas other regulators, such as adenyl cyclase (Cyr1), have significantly different phenotypes in vivo compared to in vitro.

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

This manuscript describes a method for screening moderately sized Candida albicans mutant libraries for morphogenesis phenotypes during active infection in a mammalian host using non-invasive confocal microscopy.

שימוש בהדמיית in vivo לבדיקת פנוטיפים של מורפוגנזה בזנים מוטנטיים של קנדידה אלביקנס במהלך זיהום פעיל בפונדקאי של יונקים

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...