Para el aislamiento de criptas del intestino delgado murino, use fragmentos lavados adecuadamente de cinco milímetros por cinco milímetros del intestino delgado murino aislado. Incubar las piezas en antibióticos PBS que contengan dos EDTA milimolares durante 30 minutos en hielo sin agitar. Para facilitar la solidificación de la matriz extracelular, o ECM, incube previamente una placa de 24 pocillos en una incubadora de cultivo de tejidos de 37 grados centígrados.
Después de aspirar la solución de EDTA de los fragmentos de tejido, agregue 25 mililitros de antibióticos frescos para PBS fríos. Luego agite el recipiente vigorosamente a mano, de 30 a 40 veces. Filtrar la suspensión una vez a través de un colador de 70 micras.
Antes de pasar al siguiente paso, confirme la presencia de las criptas bajo el microscopio. A continuación, centrifuga la suspensión a 390 G y cuatro grados centígrados durante tres minutos. Luego, vuelva a suspender el pellet de cripta en 20 mililitros de DMEM que contiene 2% de sorbitol, en adelante denominado DMEM de sorbitol.
Transfiera 10 mililitros de la suspensión crypt a cada uno de los dos nuevos tubos de 15 mililitros. Esta vez, centrifugar los dos tubos a una velocidad inferior de 80 G durante tres minutos a cuatro grados centígrados para separar las grandes masas celulares de las células o desechos. Aspire el sobrenadante suavemente, dejando aproximadamente dos mililitros de sobrenadante en cada tubo.
Luego, agregue 10 mililitros de sorbitol DMEM a cada tubo. Centrifugar la suspensión de nuevo a 80 G y cuatro grados centígrados durante tres minutos. Aspire el sobrenadante como se demostró anteriormente, y agregue 10 mililitros de sorbitol DMEM para la resuspensión.
Después de aspirar el sobrenadante, agregue 10 mililitros de DMEM completo y vuelva a suspender el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Deja reposar la suspensión durante un minuto para obtener las criptas flotantes de manera eficiente. Después de un minuto, filtre la suspensión de ambos tubos en un tubo nuevo a través de un colador de células de 70 micras para purificar las criptas.
Para contar las criptas puras antes de sembrar, gotee gotas de 25 microlitros en un plato de seis centímetros en tres puntos. Cuente el número de criptas bajo un microscopio con un aumento de 4X y calcule la concentración de criptas por 25 microlitros. Luego, centrifugar todo el filtrado a 290 G durante tres minutos a cuatro grados centígrados.
Para la siembra, suspenda las criptas en ECM a una concentración de 100 criptas por 40 microlitros de ECM. Pipetear hacia arriba y hacia abajo de cinco a 10 veces evitando suavemente las burbujas de aire para obtener una suspensión homogénea. Luego, siembre 40 microlitros de la suspensión de la cripta por pocillo en la placa de 24 pocillos precalentada.
Incubar la placa de 24 pocillos durante 15 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para la polimerización de la ECM. Cubrir la ECM por pocillo con 500 microlitros de medio de cultivo que contenga factor de crecimiento epidérmico de ratón, R-Spondin 1 de ratón recombinante y noggin de ratón recombinante. La concentración final de materiales por pocillo se muestra aquí.
Cultive las criptas incubando a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Realice imágenes en vivo para registrar la morfogénesis de organoides utilizando un microscopio de imagen Timelapse cada tres horas durante un máximo de siete días y obtenga imágenes apiladas en serie Z. Casi todas las criptas aisladas fueron inmediatamente selladas y aparecieron en forma de cono una vez exprimidas de los nichos epiteliales.
Además, las criptas en la fracción final fueron integradas y adecuadas para su uso en la cultura. Las imágenes de lapso de tiempo del crecimiento de organoides revelaron que la proliferación activa y la diferenciación de las células madre intestinales ocurrieron en la región de la cripta con gemación. La gemación se combinó con la migración celular, la proliferación y la diferenciación de células de Paneth.
