Para comenzar, prepare dos mililitros de formalina al 4% o cualquier otro fijador apropiado. También mantenga una placa de Petri, fórceps y tijeras quirúrgicas listas antes de comenzar el procedimiento. Coloque el pez criolesionado debidamente sacrificado en una placa de Petri que contenga agua desionizada.
Usando tijeras, realiza un corte a través del cuerpo, anterior y posterior al pedúnculo caudal. Deje que el tejido se desangre en el agua desionizada dentro de la placa de Petri. Usando fórceps, recolecte y transfiera el pedúnculo caudal a la solución fijadora preparada en un tubo de microcentrífuga.
Invierta cuidadosamente el tubo varias veces. Antes de montar, lave el pañuelo fijo en PBS durante 10 minutos en un balancín. Luego transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros que contiene una solución de sacarosa al 30% en agua desionizada, preenfriada a cuatro grados centígrados e invierta suavemente el tubo varias veces.
Deje el tubo en posición vertical a 4 grados centígrados durante al menos 24 horas. Llene un molde de incrustación con una capa de cinco milímetros de medio de montaje OCT. Usando fórceps, coloque el pedúnculo caudal en la parte inferior del molde.
Ajuste su orientación para secciones transversales o coronales. Deje que el medio se congele en una caja de hielo seco. Tan pronto como el tejido se estabilice en la posición deseada, llene el resto del molde antes de que la OCT se congele por completo.
Guarde el molde a 80 grados centígrados durante al menos una hora antes de seccionar el tejido con un criostato. La extensión de la criolesión en diferentes días después de la criolesión, o DPCI, se analizó en las secciones del pedúnculo caudal utilizando tinción tricrómica compuesta de azul de anilina, fuschin ácido y naranja-G. Las áreas dañadas fueron determinadas por la ausencia de manchas naranjas.
A 4 y 7 dpci, la sección transversal mostró músculo esquelético extensamente degenerado en el flanco criolesionado del cuerpo. El análisis de inmunofluorescencia mostró que, a 4 DPCI, el lado lesionado del pedúnculo caudal contenía abundantes células DAPI positivas, pero poca o ninguna actina F y tropomiosina 1, lo que indica músculos degenerados. A 7 dpci, se pudo detectar tropomiosina 1 y F-actina en la herida, cerca de la línea media vertical del cuerpo, lo que indica el inicio de la formación de nuevas miofibras.
A 30 dpci, ambos lados del cuerpo mostraron una distribución similar de tinción de actina F, lo que indica una restauración eficiente del músculo esquelético.
