Damos las gracias a V. Zimmermann por su excelente asistencia técnica y para el cuidado de los peces. Este trabajo fue financiado por la Swiss National Science Foundation, el número de concesión: 310000_120611.

1. Instalación del equipo <ol><li> La principal herramienta utilizada para llevar a cabo cryoinjury es la criosonda, el instrumento de la pluma-como que está hecha de acero inoxidable (Figura 1A). El mango cilíndrico es de 40 mm de largo y tiene un diámetro de 8 mm. La punta del aplicador es de 6 mm de longitud y 0,8 mm de diámetro. La unión entre la punta y el mango es cónico 4 mm de largo. Además, el mango de la criosonda deben ser aislados con un tubo de plástico y cinta para evitar la congelación de los dedos mientras se mantiene la herramienta durante el procedimiento. </li><li> Otros materiales que se necesitan para la criocirugía es un microscopio estereoscópico, pinzas cortantes, micro Tijeras de disección de primavera y una pipeta de transferencia de plástico. Además preparar un vaso de precipitados para anestesiar a los peces y una cuchara de plástico para la transferencia de los peces. </li><li> Durante la cirugía, los peces se colocan en una esponja húmeda con su hasta la parte ventral (fig. 1B). Para mantener el animal en un procedimiento estable, unranura apropiada debe ser cortado manualmente en la esponja. </li><li> Preparar un tanque con agua del sistema para transferir el pescado después de la cirugía. </li><li> Establecer un temporizador doble por primera vez con una cuenta atrás de 10 segundos y luego automáticamente una cuenta regresiva de 24 segundos. </li></ol> 2. El Procedimiento Cryoinjury <ol><li> Enfriar la criosonda por inmersión de la punta en 3-5 cm de nitrógeno líquido por lo menos durante 3 min. </li><li> Anestesie un pez cebra adultos en sumergir en el 0,02% tricaína hasta que el pescado se convierte en su espalda y sus branquias casi deja de moverse (aproximadamente 90 segundos). </li><li> Transferir el pescado con una cuchara de plástico a una esponja húmeda que ha sido cortado para sostener un pez boca abajo (Figura 1B). Bodega de pescado estable con fórceps mano no dominante. Visualmente localizar el margen posterior medial del corazón y de utilizar tijeras rectas iridectomía para punzar la piel. (Figura 1C). </li><li> Haga una pequeña (aprox. 2 mm) incisión por encima del corazón por cutting recta anterior a través de la piel, los músculos (Figura 1D). No corte a través del aparato branquial ósea, ya que esto va a matar al animal. </li><li> Suavemente retire la capa de plata del epitelio de la hipodermis (fig. 1E) con la punta de las tijeras para tener un acceso directo hacia el ventrículo late. No introduzca las tijeras más profunda en la cavidad del cuerpo, ya que esto punción voluntad del corazón. El corazón que late debe estar bien visible, y no hay sangrado abundante debe ocurrir durante la toracotomía (Figura 1F). </li><li> Inicie el temporizador programado que se ha establecido durante 10 segundos, seguido por 24 segundos. Durante 10 segundos, sacar la criosonda del nitrógeno líquido. Asegúrese de que no hay más nitrógeno en la criosonda agitando suavemente. Extienda la incisión lateralmente con unas pinzas para abrir el pecho (Figura 1F). </li><li> Una vez que suene el timbre de 10 segundos, tocar de inmediato, pero con cuidado el ventrículo con la punta de la pre-enfriada criosonda (Figura 1G). </li><li> Una vez que suene el reloj de 24 segundos, vierta 2-3 ml de agua del sistema utilizando una pipeta de plástico en el pecho para liberar la criosonda a partir de tejido, y transferir los peces en el tanque con agua del sistema. </li><li> El pescado debe reiniciar la respiración después de unos segundos, y entonces debe volver a nadar. Si no respira después de alrededor de 45 segundos, estimular el animal mediante chorros de agua en las branquias con una pipeta de plástico hasta que se comienza a respirar por sí mismo. En nuestra experiencia, 95% de los peces sobrevivir la cirugía, y todas las muertes producen en el día de la cirugía. No será necesario para suturar incisiones. </li></ol> 3. Colección Corazón y fijación <ol><li> Preparar 1 ml de formalina al 2% en un tubo de microcentrífuga para la fijación del corazón, fórceps dos, tijeras de micro-disección y la esponja húmeda ranurada. </li><li> En el día seleccionado después cryoinjury, la eutanasia a los peces en 0,1% tricaína durante 5 minutos. </li><li> Coloque elpeces lado ventral hacia arriba en una esponja húmeda, con ranuras. Haga una grande (aprox. 4 mm) incisión por encima del corazón a través del cartílago branquial con las tijeras de disección micro. Abrir ampliamente la incisión con pinzas (Figura 1H). </li><li> Pellizque el bulbo arterioso, una estructura blanca anterior al ventrículo (Figura 1 HI), y quitar el corazón de la cavidad tirando de él. A todo el corazón disecado se muestra en la Figura 1J y la Figura 2A. </li><li> Coloque hasta 3 corazones en un tubo de microcentrífuga con 1 ml de formalina al 2%. Gire suavemente el tubo varias veces y mantenerlo durante toda la noche a 4 ° C. </li></ol> 4. Corazón de montaje <ol><li> Lavar los corazones en PBS durante 5 minutos. Transferir los corazones en 10 ml de 30% de sacarosa que debe ser pre-enfriado a 4 ° C, y mezclar suavemente. El espécimen inicialmente debe flotar en la superficie de la solución de sacarosa. Continuar la incubación durante 1 hora y 20 minutos a 4 ° C. Después deeste tiempo, los corazones se hundirá hasta el fondo del tubo. </li><li> Prepare una caja con hielo seco. Tomar un molde incrustación, y verter una capa de 5 mm de medio de octubre de montaje en la parte inferior del molde. </li><li> Con pinzas colocar el corazón en la T OC medio de montaje en el molde. Bajo el microscopio estereoscópico, ajustar la orientación de la muestra para conseguir el vértice del ventrículo en la parte inferior del molde, y el bulbo arterioso hacia la parte superior. </li><li> Coloque los moldes con la muestra en hielo seco. Cuando el medio de montaje empieza a congelar, llenar el resto del molde con el medio de octubre y se deja congelar completamente. Mantener el molde por lo menos durante 1 hora a -80 ° C antes de seccionar. La muestra congelada se puede almacenar durante varios meses a -80 ° C. </li></ol> 5. Corazones de seccionamiento <ol><li> Establecer un criostato con un tamaño de corte de 16 micras, una cámara de temperatura de -24 ° C y la temperatura de la muestra a -22 ° C. </li><li> Coloque el bloque congelado con elespécimen en el criostato y fijar su orientación para comenzar el corte paralela a la parte inferior del bloque. </li><li> Preparar seis Superfrost-plus diapositivas por un bloque y numerate ellos de 1 a 6. Empiece a cortar hasta que el tejido se alcanza, y recortar el bloque alrededor de la muestra con una cuchilla de afeitar. </li><li> Para obtener 6 repeticiones de un mismo corazón, toma la primera sección de la diapositiva 1, la sección segunda de la diapositiva 2, el tercero en la diapositiva 3, etc Una vez que colocó la sexta sección de la diapositiva 6, se reinicia con la diapositiva 1 y continuar hasta el órgano entero se corta. Recoge dos filas de alrededor de 8 secciones de la diapositiva (Figura 3). </li><li> Que las diapositivas seco durante 1 hora a temperatura ambiente. Guárdelos para un máximo de 1 año en envase perfectamente cerrado a -20 ° C. </li></ol> 6. Los resultados representativos Representante lesión cardiaca después de este protocolo se muestra en la disección de todo corazón a las 4 de DPCI (cryoinjury días después, la figura 2D-F). Para visualize el tejido de miocardio en vivo, hemos utilizado los peces transgénicos que expresan EGFP y DsRed2 nuclear bajo el control de los cardiaca específica CMLC-2 promotor de 11,12. La ausencia de EGFP y DsRed2 señales fluorescentes demarcado una zona de infarto en forma de disco a lo largo de la pared ventricular apical-lateral. Para llevar a cabo los análisis celulares y moleculares de los tejidos, los corazones fueron fijados y se secciona con un criostato. Un representante de diapositivas con una serie consecutiva de secciones transversales del corazón se muestra en la Figura 3. Las secciones pueden ser analizados con métodos diferentes (Figura 4). Para determinar el alcance de la regeneración del corazón en comparación con las cicatrices, se realizó un análisis histológico mediante fucsina ácida naranja-G (AFOG) tinción, que califica diferencialmente los tejidos cardíacos y fibrosis 9. Los análisis de expresión génica se consigue de acuerdo con el procedimiento en la hibridación in situ <sup&gt; 13. Para detectar la distribución de las proteínas marcadoras, se aplicó ensayo de inmunofluorescencia con anticuerpos específicos 9. Una combinación de diversos procedimientos de tinción conduce a la identificación de los mecanismos moleculares y celulares implicados en la regeneración cardiaca después de cryoinjury. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig1.jpg" /> Figura 1. Inducir cryoinjury del ventrículo en el pez cebra adulto. (A) Una fotografía de la criosonda. (B) Un pez cebra adulto se coloca en la ranura de la esponja con su lado ventral hacia arriba. (CF) Pecho incisión para acceder al corazón. (C) Una pequeña incisión a través de la piel y los músculos se hace entre las dos aletas pectorales (línea roja). (D) Las tijeras se insertan en la incisión para cortar la piel después de la flecha roja. (E) Debajo de la piel, la fina capa de hipodermis plateada (rodeada por la línea azul discontinua) se abrió con cuidado para tener acceso al corazón. (F) La incisión se extendió con elfórceps y el ventrículo latir (flecha verde) es accesible para cryoinjury. (G) La criosonda frío se introduce suavemente en el pecho para tocar el corazón. (HJ) Corazón colección. (H) realiza una incisión larga y profunda se hace a través de los arcos branquiales del pecho para acceder a la cavidad pericárdica. Dos estructuras del corazón son visibles: bulbo arterioso (flecha blanca) y el ventrículo (flecha verde). (I) El bulbo arterioso se mantenga con una pinza y sacó de la cavidad del cuerpo. (J) El corazón entero se escindió de del cuerpo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig2.jpg" /> Figura 2. Representante de control y los corazones cryoinjured disecados de adultos de pez cebra transgénico que expresa EGFP y DsRed2 nuclear en cardiomiocitos. (CA) ileso corazón. (A) La iluminación de campo oscuro se muestra el ventrículo (V), bulbo arterioso (Ba, blanco) y las válvulas (Va), donde se vinculó la aurícula al ventrículo. (B y C) las imágenes fluorescentes de t<html> que EGFP intacta pantalla ventrículo y DsRed2 expresión en los cardiomiocitos. (DF) Corazón a 4 días después de la cryoinjury (4 DPCI) (D) La iluminación de campo oscuro revela un infarto en forma de disco (línea amarilla discontinua). (EF) cardiomiocitos marcadores EGFP y DsRed2 no se detectan en la zona del infarto, lo que indica el miocardio dañado (rodeado de línea discontinua). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig3.jpg" /> Figura 3. La sección del corazón. (A) corazón entero con el dibujo de secciones transversales a partir de la parte inferior del corazón (1 y 2, en rojo) hacia la parte superior del corazón (3 y 4 en verde). (B) Fotografía de una diapositiva con la serie de secciones transversales consecutivas teñidas con AFOG (fucsina ácida naranja-G). Las primeras secciones (1 y 2, plazas rojas) contienen el ápex del ventrículo, y las últimas secciones del corazón (3 y 4, cuadrados verdes) comprenden bulbo arterioso. iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg &quot;/&gt; Ejemplos Figura 4. De análisis realizados en las secciones de corazón a las 7 cryoinjury días después. (A) AFOG (fucsina ácida naranja-G) las etiquetas de tinción de las células musculares sanas en color naranja, el tejido cicatricial que contiene colágeno y fibrina en azul en rojo. (B) La hibridación in situ de la cadena pesada de miosina ventricular (vmhc) ARNm visualiza el miocardio intacto (coloración azul). El tejido dañado está desprovisto de la transcripción de genes cardiacos (línea roja discontinua). (C) Immunoassaying de la tropomiosina (verde) llama a los cardiomiocitos intactas y no en el tejido dañado (rodeado con la línea discontinua). DAPI (azul) tiñe el núcleo de todas las células. (D) cardiomiocitos genéticamente etiquetados expresa DsRed2 (rojo) en sus núcleos. DAPI (azul) llama a todos los núcleos. La zona infartada no contiene DsRed2 de células positivas (línea blanca discontinua).

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	<li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li><li>Singh, B. N., Koyano-Nakagawa, N., Garry, J. P., Weaver, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+of+newt:+a+recipe+for+regeneration.">Heart of newt: a recipe for regeneration.</a> J. Cardiovasc. Transl. Res. 3, 397-409 (2010).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+heart+of+regeneration+in+zebrafish.">Getting to the heart of regeneration in zebrafish.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).</li><li>Ausoni, S., Sartore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fish+to+amphibians+to+mammals:+in+search+of+novel+strategies+to+optimize+cardiac+regeneration.">From fish to amphibians to mammals: in search of novel strategies to optimize cardiac regeneration.</a> J. Cell Biol. 184, 357-364 (2009).</li><li>Borchardt, T., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+regeneration+in+non-mammalian+model+systems:+what+are+the+differences+between+newts+and+man.">Cardiovascular regeneration in non-mammalian model systems: what are the differences between newts and man.</a> Thrombosis and haemostasis. 98, 311-318 (2007).</li><li>Bos, E. J. v. a. n. d. e. n., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+cryoinjury-induced+myocardial+infarction+in+the+mouse:+a+comparison+with+coronary+artery+ligation.">A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 289, H1291-H1300 (2005).</li><li>van Amerongen, M. J., Harmsen, M. C., Petersen, A. H., Popa, E. R., van Luyn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoinjury:+a+model+of+myocardial+regeneration.">Cryoinjury: a model of myocardial regeneration.</a> Cardiovasc. Pathol. 17, 23-31 (2008).</li><li>Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+cryoinjury+induced+necrotic+heart+lesions+in+zebrafish+is+associated+with+epicardial+activation+and+cardiomyocyte+proliferation.">Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li><li>Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+heart+regenerates+after+cryoinjury-induced+myocardial+infarction.">The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction.</a> BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).</li><li>Gonz&#225;lez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Rottbauer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reptin+and+pontin+antagonistically+regulate+heart+growth+in+zebrafish+embryos.">Reptin and pontin antagonistically regulate heart growth in zebrafish embryos.</a> Cell. 111, 661-672 (2002).</li><li>Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assay+for+small+molecules+that+modulate+zebrafish+embryonic+heart+rate.">High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate.</a> Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).</li><li>Chablais, F., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF+signaling+between+blastema+and+wound+epidermis+is+required+for+fin+regeneration.">IGF signaling between blastema and wound epidermis is required for fin regeneration.</a> Development. 137, 871-879 (2010).</li><li>Baust, J. G., Gage, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+cryosurgery.">The molecular basis of cryosurgery.</a> BJU Int. 95, 1187-1191 (2005).</li><li>Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+the+pathogenesis+of+heart+disease:+mechanisms+and+significance.">Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance.</a> Annual review of physiology. 72, 19-44 (2010).</li></ol>

La investigación experimental en animales ha sido aprobado por la oficina cantonal de Friburgo veterinaria.

Cryoinjury se define como el daño de tejido controlado por la aplicación precisa de 14 frío extremo. Choque térmico directo destruye las células por la destrucción de proteínas y por la formación de cristales de hielo intracelular fluido que rompe la membrana plasmática. En consecuencia, las células dañadas mueren en los procesos de apoptosis y necrosis 14. Estos dos mecanismos de muerte celular se ha demostrado que contribuyen a la pérdida de tejido después de un infarto de miocardio 15. Así, cryoinjury representa un modelo adecuado de inducir un infarto cardíaco. Varios estudios informaron este método bien probado en diversos mamíferos, incluyendo ratones, ratas, conejos y cerdos 6,7. La adaptación del protocolo cryoinjury en el pez cebra permite un análisis más comparativo sobre la respuesta del infarto entre las diferentes especies. Otros dos grupos de forma independiente desarrolló el procedimiento cryoinjury para el corazón del pez cebra adulto. Las principales diferencias son el surmétodos de Gery, el tipo de herramientas y el tiempo de aplicar la congelación. En el estudio de González-Rosa et al., El pericardio fue inaugurada por el desgarro del tejido en lugar de cortar. Ellos usaron 0,3 mm filamento de cobre, vinculada a un tubo de poliamida pre-enfriado en nitrógeno líquido para congelar el corazón durante unos segundos hasta que la descongelación se puede observar 10. En el estudio de Schnabel et al., Una pieza cónica de hielo seco de 20 mm de longitud con una punta afilada de 2 mm en su diámetro se utilizó para tocar el corazón durante 10 segundos 8. Los dos grupos obtuvieron el daño ventricular a través de la muerte del miocardio. La ventaja de este método es una deposición más reproducible de rico en colágeno cicatriz, que mejor imita las respuestas infarto primeros curación observadas en los sistemas de mamíferos. El paso crítico durante el procedimiento cryoinjury en el pez cebra está haciendo una incisión a través de la piel y el saco pericárdico, sin perforar el fondo del corazón. Una correcta Realizamosla cirugía d hace poco de sangrado. Sangrado profuso indica una punción accidental del ventrículo con las tijeras. En tales casos, los animales deben ser retraído a partir del experimento. Con el fin de evitar la perforación del corazón, el punto de tijeras debe estar dirigida a un ángulo superficial de la piel. Otro aspecto importante para crear una lesión reproducible es el posicionamiento exacto de la criosonda frío en el ventrículo para la duración precisa óptima. El tiempo de congelación es demasiado corto tendrá como resultado la inflamación con la muerte celular poco. Congelación prolongada, por otro lado, puede causar daño extenso del corazón, lo que puede conducir a la mortalidad mejorada de los animales. Se determinó que el tiempo óptimo para mantener el ventrículo en los rangos de estado congelado entre 23-26 segundos para un adulto 2 cm pez cebra largo, y puede variar en dependencia de la tamaño de los animales. Debido a que nuestro protocolo es muy simple y rápido, no hay límite experimentalciones en someter a un número suficiente de animales para obtener suficientes repeticiones biológicos. El tratamiento de criocirugía es muy bien tolerado por los animales. Colección de los corazones en diferentes puntos temporales después de cryoinjury permite la caracterización detallada de las fases posteriores durante el proceso de regeneración. El análisis experimental de los corazones cryoinjured puede incluir: 1) la visualización de la transcripción de genes por hibridación in situ, 2) la detección de la distribución de las proteínas mediante la tinción de inmunofluorescencia, 3) la imagen histológica de las diferentes estructuras. La comprensión de los procesos de curación después de un infarto de miocardio clave en el pez cebra impactará en el campo de la biología regenerativa. Por otra parte, podría ser beneficioso para el diseño de nuevos enfoques terapéuticos en la medicina regenerativa.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Micro Tijeras de disección de primavera </td><td> Roboz quirúrgica Instrument Co., Inc. </td><td> RS-5602 </td></tr><tr><td> Tricaína </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> El formaldehído ~ 36% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 47630 </td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84100 </td></tr><tr><td> Tissue-Tek octubre compuesto </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Diapositivas Superfrost Plus </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Peel-A-Way moldes desechables - Moldes de incrustación truncadas T8 </td><td> Polyscience, Inc. </td><td> 18985 </td></tr></tbody></table>

induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury

El corazón de los mamíferos es capaz de una regeneración significativa después de una lesión aguda como el infarto de miocardio 1. Por el contrario, los anfibios urodelos y peces teleósteos conservan una notable capacidad de regeneración cardíaca con poca o ninguna cicatriz toda la vida 2,3. No se sabe por qué sólo algunos vertebrados no mamíferos puede volver a crear un órgano completo a partir de tejidos remanentes de 4,5. Para comprender las diferencias moleculares y celulares entre las respuestas regenerativas en distintas especies, tenemos que utilizar métodos similares para la inducción de lesiones agudas. En los mamíferos, el modelo más utilizado para estudiar la reparación cardíaca ha sido isquemia aguda después de una ligadura de la arteria coronaria o la destrucción del tejido después de cryoinjury 6,7. La regeneración cardiaca en los tritones y pez cebra ha sido particularmente estudiados después de una resección parcial de la punta del ventrículo 2,3. Recientemente, varios grupos han establecISHED la técnica cryoinjury de 8.10 adultos de pez cebra. Este método tiene un gran potencial debido a que permite un análisis comparativo de los resultados obtenidos de las especies de mamíferos y no mamíferos. A continuación, presentamos un método para inducir una reproducibles en forma de disco del infarto del ventrículo pez cebra cryoinjury. Este modelo de lesión se basa en una rápida congelación-descongelación del tejido, lo que resulta en la muerte celular masiva de aproximadamente 20% de los cardiomiocitos de la pared ventricular. En primer lugar, de una pequeña incisión se hace a través del pecho con unas tijeras iridectomía para acceder al corazón. La pared del ventrículo se congeló directamente mediante la solicitud de 23-25 ​​segundos, una criosonda de acero inoxidable pre-enfriado en nitrógeno líquido. Para detener la congelación del agua corazón pescado, a temperatura ambiente se dejó caer en la punta de la criosonda. El procedimiento es bien tolerado por los animales, con una tasa de supervivencia de 95%. Para caracterizar el proceso de regeneración, los corazones estabanrecogido y fijado en diferentes días después de cryoinjury. Posteriormente, la muestra se incluyeron para cryosectioning. Los portaobjetos con las secciones fueron procesadas para el análisis histológico, la hibridación in situ e inmunofluorescencia. Este compromiso mejora nuestra comprensión de los factores que se requieren para la plasticidad de regeneración en el pez cebra, y proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de regeneración cardíaca. Una comprensión conceptual y moleculares de la regeneración cardiaca en el pez cebra tendrá un impacto tanto en la biología del desarrollo y la medicina regenerativa.

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Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

El pez cebra representa un modelo valioso para estudiar los mecanismos de la regeneración del corazón en los vertebrados. Aquí, se presenta un protocolo para la inducción de un infarto al corazón en adultos de pez cebra con cryoinjury. Este método da como resultado la muerte celular masiva a menos de 20% de la pared ventricular, similar a la observada en los infartos de mamíferos.

La inducción de infarto de miocardio en adultos de pez cebra Uso de Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

induction-of-myocardial-infarction-in-adult-zebrafish-using-cryoinjury

Research

JoVE Journal

Medicine

22.0K vistas.  University of Fribourg, Fribourg, Switzerland. El pez cebra representa un modelo valioso para estudiar los mecanismos de la regeneración del corazón en los vertebrados. Aquí, se presenta un protocolo para la inducción de un infarto al corazón en adultos de pez cebra con cryoinjury. Este método da como resultado la muerte celular masiva a menos de 20% de la pared ventricular, similar a la observada en los infartos de mamíferos.

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Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

Infarto agudo de miocardio en ratas

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Investigación

Medicina

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ideal model for testing novel therapeutic strategies.
In vivo magnetic resonance imaging (MRI) gives excellent views of the heart noninvasively with clear anatomical detail, which can be used for accurate functional assessment. Contrast agents can provide basic measures of tissue viability but these are nonspecific. Positron emission tomography (PET) is a complementary technique that is highly specific for molecular imaging, but lacks the anatomical detail of MRI. Used together, these techniques offer a sensitive, specific and quantitative tool for the assessment of the heart in disease and recovery following treatment.
In this paper we explain how these methods are carried out in mouse models of acute myocardial infarction. The procedures described here were designed for the assessment of putative protective drug treatments. We used MRI to measure systolic function and infarct size with late gadolinium enhancement, and PET with fluorodeoxyglucose (FDG) to assess metabolic function in the infarcted region. The paper focuses on practical aspects such as slice planning, accurate gating, drug delivery, segmentation of images, and multimodal coregistration. The methods presented here achieve good repeatability and accuracy maintaining a high throughput.

We describe how to perform MRI and PET imaging of the mouse heart. The protocol is tailored to assess treatment efficacy in models of myocardial infarction and heart failure.

Resonancia magnética y PET en modelos de ratón de infarto de miocardio

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One important prerequisite is a good understanding of all safety and efficacy aspects obtained in a large animal model that validly reflect the human scenario of myocardial infarction (MI). Pigs are widely used in this regard since their cardiac size, hemodynamics, and coronary anatomy are close to that of humans. Here, we present an effective protocol for using the porcine MI model using a closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. This approach is based on 90 min of myocardial ischemia, inducing large left ventricle infarction of the anterior, septal and inferoseptal walls. Furthermore, we present protocols for various measures of outcome that provide a wide range of information on the heart, such as cardiac systolic and diastolic function, hemodynamics, coronary flow velocity, microvascular resistance, and infarct size. This protocol can be easily tailored to meet study specific requirements for the validation of novel cardioregenerative biologics at different stages (i.e. directly after the acute ischemic insult, in the subacute setting or even in the chronic MI once scar formation has been completed). This model therefore provides a useful translational tool to study MI, subsequent adverse remodeling, and the potential of novel cardioregenerative agents.

This protocol describes the porcine myocardial infarction (MI) model using a 90 min closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. Furthermore, the protocol for several outcome parameters, such as cardiac function, hemodynamics, microvascular resistance, and infarct size, are also presented.

Infarto de miocardio y la evaluación de resultados funcionales en los cerdos

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last decades. For clarification of the underlying mechanisms and the development of new therapeutic strategies, the availability of valid animal models are mandatory. Since we need new insights into pathomechanisms of cardiovascular diseases under in vivo conditions to combat myocardial infarction, the validity of the animal model is a crucial aspect. However, protection of animals are highly relevant in this context. Therefore, we establish a minimally invasive and simple model of myocardial infarction in mice, which assures a high reproducibility and survival rate of animals. Thus, this models fulfils the requirements of the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction) for animal experiments and assure the scientific information needed for further developing of therapeutical strategies for cardiovascular diseases.

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

Mínimo procedimiento quirúrgico invasivo de inducir infarto de miocardio en ratones

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are therefore required to confine cardiac damage, promote survival and reduce the disease burden of heart failure. Large animal experiments are an essential part in the translational process from experimental to clinical therapies. To optimize clinical translation, robust and representative outcome measures are mandatory. The present manuscript aims to address this need by describing the assessment of three clinically relevant outcome modalities in a pig acute myocardial infarction (AMI) model: infarct size in relation to area at risk (IS/AAR) staining, 3-dimensional transesophageal echocardiography (TEE) and admittance-based pressure-volume (PV) loops. Infarct size is the main determinant driving the transition from AMI to heart failure and can be quantified by IS/AAR staining. Echocardiography is a reliable and robust tool in the assessment of global and regional cardiac function in clinical cardiology. Here, a method for three-dimensional transesophageal echocardiography (3D-TEE) in pigs is provided. Extensive insight into cardiac performance can be obtained by admittance-based pressure-volume (PV) loops, including intrinsic parameters of myocardial function that are pre- and afterload independent. Combined with a clinically feasible experimental study protocol, these outcome measures provide researchers with essential information to determine whether novel therapeutic strategies could yield promising targets for future testing in clinical studies.

Reliable and accurate outcome assessment is the key for translation of preclinical therapies into clinical treatment. The current paper describes how to assess three clinically relevant primary outcome parameters of cardiac performance and damage in a pig acute myocardial infarction model.

La evaluación de resultado primaria en un modelo porcino de infarto agudo de miocardio

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

El infarto de miocardio en ratones recién nacidos, un modelo de regeneración cardiaca

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Real-time Pressure-volume Analysis of Acute Myocardial Infarction in Mice

Acute myocardial infarction can lead to acute heart failure and cardiogenic shock. The evaluation of hemodynamics is critical for the evaluation of any potential therapeutic approach directed against acute left ventricular (LV) dysfunction. Current imaging modalities (e.g., echocardiography and magnetic resonance imaging) have several limitations since data on LV pressure cannot directly be measured. LV catheterization in mice undergoing coronary artery occlusion could serve as a novel method for a real-time evaluation of LV function.
At the beginning of the procedure, mice were anesthetized followed by endotracheal intubation. For LV catheterization, the right carotid artery was exposed via middle-neck incision. The catheter was introduced and placed into the LV cavity. Left thoracotomy was conducted and the left main coronary artery (LCA) was ligated. To induce reperfusion, the suture was released after 45 min. Pressure-volume data was recorded at all times.
Ligation of the LCA caused a decrease in LV systolic function as evidenced by a 30% reduction in stroke volume, LV ejection fraction (EF), and cardiac output. Maximum dP/dt as a parameter for LV contractility was also significantly reduced and diastolic function was severely impaired (minimum dP/dt -40%). Reperfusion over a period of 20 min did not lead to a complete recovery of LV function.
Real-time pressure-volume analysis served as a valid procedure for monitoring cardiac function during acute myocardial infarction in mice. Maintaining stable anesthesia and a standardized surgical approach was crucial to ensure valid results. As the early phase of acute myocardial infarction is critical for morbidity and mortality, the delineated method could be beneficial for preclinical evaluation of new strategies for cardioprotection.

Acute myocardial infarction in mice induces acute but incompletely characterized changes in left ventricular (LV) function. LV catheterization in mice undergoing coronary artery occlusion serves as a novel method for a real-time evaluation of LV function.

Análisis en tiempo real de presión-volumen del infarto agudo de miocardio en ratones

Acute myocardial infarction can lead to acute heart failure and cardiogenic shock. The evaluation of hemodynamics is critical for the evaluation of any ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Modelo de infarto de miocardio murino usando ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

Un modelo de criolesiones para estudiar el infarto de miocardio en el ratón

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

A Modified Simple Method for Induction of Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction (MI) represents one of the leading causes of death. MI models are widely used for investigating the pathomechanisms of post-MI remodeling and evaluation of novel therapeutics. Different methods (e.g., isoproterenol treatment, cryoinjury, coronary artery ligation, etc.) have been used to induce MI. Compared with isoproterenol treatment and cryoinjury, coronary artery ligation may better reflect the ischemic response and chronic remodeling after MI. However, traditional methods for coronary ligation in mice are technically challenging. The current study describes a simple and efficient process for induction of MI in mice with readily available materials. The mouse chest skin was cut open under stable anesthesia. The heart was immediately externalized through the intercostal space after blunt separation of the pectoralis major and pectoralis minor. The left anterior descending branch (LAD) was ligated with a 6-0 suture 3 mm from its origin. Following LAD ligation, staining with 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) indicated successful induction of MI and temporal changes of post-MI scar size. Meanwhile, survival analysis results showed overt mortality within 7 days after MI, mainly due to cardiac rupture. Moreover, post-MI echocardiographic assessment demonstrated successful induction of contractile dysfunction and ventricular remodeling. Once mastered, an MI model can be established in mice within 2-3 min with readily available materials.

Under adequate anesthesia, the mouse heart was externalized through the intercostal space, and myocardial infarction was successfully induced by ligating the left anterior descending artery (LAD) using materials readily available in most laboratories.

Un método simple modificado para la inducción de infarto de miocardio en ratones

Myocardial infarction (MI) represents one of the leading causes of death. MI models are widely used for investigating the pathomechanisms of post-MI ...