Este protocolo proporciona un enfoque estandarizado para obtener imágenes y cuantificar los cambios en la morfología mitocondrial en múltiples tejidos. En C elegance, la morfología mitocondrial a menudo se asocia con su funcionalidad. Los cambios en la morfología mitocondrial se pueden observar bajo diversas condiciones de enfermedad y con la progresión del envejecimiento, que a menudo se correlacionan con la desregulación de la función mitocondrial, diferentes tejidos, y ver elegancia.
Exhiben estructuras mitocondriales únicas que requieren distintas estrategias de imagen. Por lo tanto, la selección de un microscopio adecuado y la optimización de la preparación de la muestra es esencial para el éxito de la obtención de imágenes específicas de tejido de las mitocondrias y C Elegance. En este caso, se optó por utilizar las cepas transgénicas de cele que expresan GFP localizada en mitocondrias en lugar de colorantes mitocondriales convencionales.
Esto nos permite evitar los efectos fuera del objetivo, la bipenetrancia onal y los complejos pasos de preparación de la muestra necesarios para visualizar las mitocondrias en diferentes tejidos utilizando un colorante. El enfoque principal de nuestro laboratorio es estudiar la homeostasis mitocondrial durante el estrés y el envejecimiento. La estandarización de un protocolo de imágenes mitocondriales es esencial para minimizar los errores extramentales y generar resultados reproducibles con respecto a los cambios en la morfología mitocondrial bajo diversas condiciones biológicas.
Para empezar, consigue portaobjetos de vidrio limpios. Para la preparación de la muestra, agregue de 10 a 20 microlitros de solución M nine en el portaobjetos de vidrio y coloque el número deseado de gusanos adultos a edades específicas en la solución. En el portaobjetos, cubra los gusanos con la solución M nine con un cubreobjetos para obtener una imagen del músculo.
Mitocondrias, empuje el cubreobjetos para hacer rodar los gusanos. Luego, con un esmalte de uñas, selle los lados del vidrio de cobertura para evitar la evaporación de la solución M nine. Utilice un microscopio de campo amplio estándar para obtener imágenes de los músculos y las mitocondrias epidérmicas que expresan las etiquetas fluorescentes.
Utilice un microscopio confocal para obtener imágenes de las mitocondrias intestinales y optimice la configuración de imágenes para que se adapte a la configuración experimental específica. Para comenzar el análisis, abra la aplicación Fiji después de la instalación para descargar e instalar la macro del mapeador mito. Primero, descargue el código fuente.
Copie el código que aparece en Un código IJM para el mapeador MIT 1.0. Abra Fiji y vaya a complementos, seguido de nuevo y macro pegue el código copiado en la ventana de macros. A continuación, guarde la macro para su uso futuro a través de un archivo y guárdela como.
Navegue hasta el archivo y, a continuación, abra para abrir una imagen microscópica 3D con Zs.In Fiji, cree una proyección máxima debajo de la imagen, seguida de pilas y proyecto Z. Seleccione el rango de cortes dentro de las imágenes enfocadas para la proyección máxima y elija la intensidad máxima como tipo de proyección para guardar la imagen proyectada máxima. Como tiff, vaya a archivo y haga clic en guardar seguido de tiff.
Recorte las regiones de interés de la imagen completa con la herramienta rectángulo y navegue hasta la imagen y el recorte. Vaya a archivo seguido de guardar como y tiff para guardar la imagen recortada en formato Tiff. Arrastre y suelte el mapa mito o el archivo de macro guardado anteriormente en la barra de herramientas de Fiji.
Haga clic en ejecutar. Cuando se le solicite, seleccione la carpeta que contiene el archivo TIFF guardado en el paso anterior. Cuando se le pida que seleccione un área, cree un rectángulo en la imagen con la herramienta rectángulo y presione OK para confirmar.
Por último, vaya a archivo y guarde los datos con todos los valores relacionados con la morfología mitocondrial como un archivo CSV de puntos. La morfología mitocondrial era específica del tejido, con mitocondrias tubulares alineadas con las fibras musculares en los músculos, estructuras interconectadas en forma de red en el intestino y más redondeadas u ovaladas. Las mitocondrias en la hipodermis obtuvieron imágenes con un microscopio confocal y mejoraron la visualización de las mitocondrias intestinales al reducir la luz desenfocada en comparación con la microscopía compuesta.
En los portaobjetos, las mitocondrias mostraron fragmentación después de 30 minutos en el tampón M nine, y las mitocondrias epidérmicas mostraron la fragmentación más prominente. El envejecimiento dio lugar a la fragmentación mitocondrial en todos los tejidos, apareciendo como estructuras truncadas y esféricas. La cuantificación del mapeador MIT indicó que la longitud del objeto cambió en los músculos y el punto de unión cambió en la hipodermis.
